Usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da Arabidopsis Root gravitrópico Response
Summary
Este protocolo descreve um processo para cobrança rápida de imagens de plântulas de Arabidopsis que respondem a um estímulo gravidade usando scanners de mesa disponíveis comercialmente. O método permite a baixo custo, a captura de grandes volumes de imagens de alta resolução passíveis de algoritmos de análise a jusante.
Abstract
Os esforços de pesquisa em biologia exigem cada vez mais o uso de metodologias que permitem a coleta de grandes volumes de dados de alta resolução. Um desafio laboratórios podem enfrentar é o desenvolvimento ea consecução desses métodos. Observação de fenótipos em um processo de interesse é um objectivo típico de laboratórios de pesquisa que estudam a função do gene e isso muitas vezes é conseguido através de captura de imagem. Um processo especial, que é passível de observação usando abordagens de imagem é o crescimento corretiva de uma raiz de mudas que foi deslocado de alinhamento com o vetor de gravidade. Plataformas de imagem usado para medir a resposta gravitrópico raiz pode ser caro, relativamente baixa na taxa de transferência, e / ou de trabalho intensivo. Estas questões foram abordadas através do desenvolvimento de um método de captura de imagem de alto rendimento com baixo custo, mas de alta resolução, scanners de mesa. Usando este método, as imagens podem ser capturadas a cada poucos minutos a 4.800 dpi. A configuração atual permite a coleta de 216 indivíduo responses por dia. Os dados de imagem coletados são de ampla qualidade para aplicações de análise de imagem.
Introduction
Recolha de dados fenotípicos de alta resolução é útil em estudos que visam compreender a interacção da genética e do ambiente na mediação função do organismo 1,2. Estudos dessa natureza também são inerentemente grande escala, tornando-se necessário que, adicionalmente, métodos empregados para medir fenótipos neste contexto ser alta na taxa de transferência de 3,4. Ao estabelecer métodos para a investigação phenomics escala, trocas entre o throughput e resolução de entrar em jogo. Métodos que são superiores na taxa de transferência também tendem a ser mais baixos em resolução, tornando-o mais difícil de detectar pequenos efeitos da genética ou o ambiente 5. Alternativamente, os métodos que medem com mais cuidado um fenótipo desejado também tendem a ser mais baixos no rendimento, o que torna difícil fazer um levantamento efeitos genéticos e ambientais de forma ampla. Além disso, os métodos manuais para fenótipos quantificar, incluindo inspeção visual, pode estar sujeita a variações devido a diferenças nas per humanopercepção 6.
Tecnologias de imagem pode fornecer uma ponte útil entre rendimento e resolução na obtenção de observações fenotípicas 7-9. Em geral, uma imagem é relativamente fácil para capturar, facilitando a produção, e quando feita com resolução suficiente, subtis fenótipos podem ser detectados 1,2,7. Tecnologias de imagem tendem a ser modificável para caber um sistema ou processo de interesse e são geralmente escalável 10-12. Devido a isso, as tecnologias de imagem são ideais para o desenvolvimento de trabalhos em larga escala de função do organismo.
A resposta da raiz principal de um estímulo gravidade é um processo fisiológico complexo que ocorre dentro de um órgão morfologicamente simples. A resposta envolve a ativação de vias de sinalização que se propagam através do órgão de raiz e sua progressão é determinada por fatores genéticos e ambientais, incluindo fatores genéticos influenciados pelo ambiente 12-14 </sup>. A resposta da raiz primária a um estímulo gravidade tem sido estudada pelo menos desde Darwin, ainda há muito a aprender sobre como ele funciona, particularmente nos primeiros eventos de sinalização e nos fatores mediadores resposta plasticidade 12,14,15. Ganhar uma compreensão detalhada da dinâmica de esta resposta é importante para encontrar maneiras de melhorar a capacidade de mudas para tornar-se estabelecida com sucesso dentro de um determinado ambiente 16. Além disso, a forma da raiz torna favorável para aplicações de processamento de imagem 8,12,17. Tomados em conjunto, a resposta gravitrópico raiz é um sistema ideal para o desenvolvimento de tecnologia de imagem de alto rendimento com a finalidade de realização de estudos de genômica de nível de função do organismo.
Neste relatório, uma alta taxa de transferência, método de alta resolução para captura de imagem da resposta gravitrópico root usando baratos, scanners de mesa comercialmente disponíveis é apresentada. A visão geral doprotocolo é demonstrado na Figura 1. Mudas plantadas em placas de ágar foram posicionados em scanners de mesa orientados verticalmente equipados com suportes de acrílico personalizados placa. As imagens foram coletadas a cada poucos minutos a 4.800 dpi e salvas em uma unidade local ou servidor de dados. Metadados associados a cada série de imagens são armazenadas em um banco de dados e as imagens armazenadas são processados. A abordagem utiliza o software VueScan para captura de imagem. VueScan pode ser usado para executar mais de 2.100 scanners diferentes em Windows, Mac, ou sistemas operacionais Linux (ver Tabela Materiais). A resolução do scanner de 4800 dpi foi utilizada nesta aplicação para corresponder à resolução alcançada em estudos anteriores usando câmeras CCD fixos 1,8,12. A flexibilidade do software VueScan juntamente com a interface comum que utiliza para qualquer scanner é executado permite que os usuários adotem prontamente praticamente qualquer hardware digitalizador de resolução suficiente para o protocolo apresentado neste artigo. Rendimento atual permite a recolha de216 respostas individuais por dia. A tecnologia é adaptável e escalável para uso em instituições que vão desde escolas a universidades de pesquisa. Além disso, as imagens recolhidas são de qualidade suficiente para aplicações de análise de imagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Observação fenotípica preciso é fundamental para a compreensão das manifestações da função do gene dentro de um organismo. Uma maneira de adquirir informação fenotípica é através da captura de dados de imagem de alta resolução. A plataforma baseada na do scanner desenvolvido permitiu coleção de muitas imagens (200 imagens / período scan) em alta resolução (4800 dpi) durante um número de horas. Além disso, a plataforma pode ser facilmente adaptado para uma variedade de ambientes de laboratório e em sala de aula, devido à flexibilidade do software VueScan para executar milhares de diferentes leitores que utilizam uma interface comum 18.
O método aqui apresentado preenche um vazio em alto rendimento de captura de imagem, que se estende a partir de grandes instalações de fenotipagem de escala e sistemas automatizados implementáveis em um único laboratório. As plataformas de alto rendimento disponíveis atualmente tendem a usar hardware de imagem especializada, incluindo câmeras montadas em suportes robóticos, para capturar imagens de alta resolução de primarily acima tecidos vegetais solo (por exemplo, centro de Planta Integrativa Tecnologia e da Scanalyzer HTS por LemnaTec) 20,21. Sistemas de imagem especializados utilizando raios-X e de ressonância magnética tecnologias também têm sido desenvolvidos para a imagem abaixo tecidos de terra com uma notável resolução à medida que crescem no ambiente do solo (por exemplo, Centro de Plantas Integrativa Tecnologia) 11,22,23. Este desenvolvimento de tecnologia mais especializada é geralmente o custo de produção, fazendo estudos fenotípicos dinâmicas mais difícil. É importante ressaltar que as necessidades de custo e de infra-estrutura para essas plataformas high-end fazê-los principalmente inviável para aplicação em laboratórios menores.
Plataformas também têm sido desenvolvidos que usam a tecnologia de captura de imagem mais padrão e são bem adequados para a medição das respostas dinâmicas, como a resposta a um estímulo raiz gravidade. Por exemplo, as câmaras CCD têm sido utilizadas para capturar respostas plântulas individuais à luz e a gravidade em alta1,8,12 resolução espacial e temporal. Outros sistemas foram desenvolvidos permitindo a medição da orientação ponta da raiz de múltiplas raízes de uma única imagem (por exemplo, RootTipMulti pelo iPlant Collaborative) 17,24. No primeiro caso, o rendimento é relativamente baixo uma vez que só uma das plântulas é trabalhada por cada câmara de cada vez, enquanto que no segundo caso o rendimento é mais elevado, mas geralmente à custa da resolução.
O procedimento descrito neste artigo apresenta uma plataforma para a captura de imagens de alta resolução em alto rendimento, com equipamentos e softwares que estão prontamente disponíveis e relativamente acessível. Usando esta configuração, 1.080 respostas de raiz individuais podem ser coletadas a cada semana em um único laboratório equipado com um banco de seis scanners. Em 15 meses de coleta uma média de 864 respostas individuais por semana, num total de 41.625 mudas foram digitalizadas para um estudo de genômica. Cerca de 15% das coleções individuais falhou devido a um erro de configuração, network falha ou mau funcionamento do equipamento. Outras respostas de 22% de falha, devido à falta de germinação ou crescimento da raiz insuficiente para provocar uma resposta de crescimento. O conjunto final de dados consiste de 27.475 respostas de mudas individuais a um estímulo gravidade das 163 linhagens recombinantes, mais 99 linhas isogênicas. Os dados foram coletados em um único laboratório, tornando esta uma abordagem muito de alto rendimento. Mesmo tendo em conta que o equipamento utilizado para a aquisição é relativamente barato, ele tem funcionado de forma confiável por mais de dois anos, mesmo com uso pesado.
Embora este protocolo tem sido muito útil para os objetivos deste grupo de pesquisa, algumas limitações ainda existem. Devido à taxa de transferência de cerca de 50 GB de dados da imagem não comprimida por dia, era evidente que uma grande quantidade de espaço necessário para as imagens foi de casa, a menos que esquemas de compressão eficaz poderia ser desenvolvido. O problema foi temporariamente resolvido armazenamento através da compra de discos rígidos externos para cada computador. Além disso, dois 1Dispositivos de armazenamento de rede associadas 0 TB foram comprados. Mais tarde, os algoritmos de compressão foram desenvolvidos, como descrito acima, que pode ajudar a reduzir o tamanho dos dados em até 60% (figura 8). É importante notar que a velocidade à qual os dados podem ser guardados num dispositivo de armazenamento associado com a rede depende da velocidade da conexão de rede. Sistemas de compressão, também têm sido limitada devido ao desejo de evitar a perda de dados de imagem.
Outras limitações específicas a um sistema de imagens baseado em scanner também estão sendo considerados. Por exemplo, em uma abordagem baseada no scanner de plântulas são expostos a luz de alta intensidade nas faixas brancas e potencialmente infravermelhos durante cada varrimento. Isso provavelmente afectando o crescimento de plântulas, embora mudas ainda pode ser observada a sofrer fortes respostas a um estímulo da gravidade (Figura 7). A melhoria futura poderia envolver programação scanners tais que apenas LEDs infravermelhos estão ativos. Uma área em developmen ativot é a criação de algoritmos de análise bem adaptado para a resolução e taxa de transferência de estes dados de imagem. O grande conjunto de dados gerados usando esse método baseado em scanner foi ideal para o desenvolvimento de ferramentas robustas para high-throughput fenotipagem de imagens de plântulas. O algoritmo de compressão empregada nestas imagens mostradas na Figura 7 é compatível com a afirmação de que eles são passíveis de aplicações de análise de imagem. Além disso, as imagens geradas podem ser analisados pelo algoritmo publicado anteriormente, RootTrace 17,24, se forem coletadas em resolução mais baixa (menos de 1.200 dpi), e mudas individuais são segmentados a partir da imagem usando o algoritmo de compressão descrito acima antes da análise. Dados de crescimento da raiz pode ser extraído a partir de imagens reduzidas a 1.200 dpi, enquanto os dados de ângulo de ponta poderia ser extraído de imagens reduzidas para 900 dpi (observação não publicada).
O procedimento descrito neste artigo se encaixa em seu próprio nicho no mundo do root imagem em que é alto rendimento e alta resolução, enquanto continuam sendo relativamente acessível. Uma vantagem adicional desta abordagem é que ele pode ser facilmente personalizado para acomodar as necessidades de imagem de um grupo de investigação particular.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Science Foundation (número prêmio IOS-1031416) e foi realizado em colaboração com Nathan Miller, Logan Johnson e Edgar Spalding, da Universidade de Wisconsin e Brian Bockelman, Carl Lundstedt e David Swanson do University of Holland Computing Center do Nebraska.
Materials
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
| Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
| Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |
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