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Medicina

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Published: September 18, 2013
doi:
10.3791/50873
, ,
1Department of Medicine,Northwestern University, 2Robert H. Lurie Cancer Center,Northwestern University, 3Center for Molecular Innovation and Drug Discovery,Northwestern University

Summary

Este modelo ortotópico de cancro de próstata humana permite a quantificação do tamanho do tumor, as células tumorais, e a formação de metástases distinta circulante para o pulmão. Como as células deve escapar o principal órgão, entrar na corrente sanguínea, e implantar em um site secundário, este modelo recapitula efetivamente o cenário em seres humanos.

Abstract

Nosso laboratório desenvolveu um modelo de implantação ortotópico romance de câncer de próstata humano (PCA). Como morte CaP não é devido ao tumor primário, mas sim a formação de metástases distinta, a capacidade de modelar a progressão eficazmente este pré-clinicamente é de elevado valor. Neste modelo, as células são directamente implantadas no lóbulo ventral da próstata em Balb / c atímicos ratinhos, e deixada progredir durante 4-6 semanas. No experimento de terminação, várias extremidades distintas podem ser medidos, tal como o tamanho e caracterização molecular do tumor primário, a presença e quantificação de células de tumor que circulam no sangue e medula óssea, e formação de metástases no pulmão. Além de uma variedade de terminais, este modelo proporciona uma imagem de uma capacidade de invadir células e escapar do órgão principal, entrar e sobreviver no sistema circulatório, e implante e crescer em um site secundário. Este modelo tem sido utilizada de forma eficaz para medir metastáticoresposta para ambas as alterações na expressão de proteínas, bem como a resposta a pequenas moléculas terapêuticas, em um curto tempo de resposta.

Introduction

O câncer de próstata (CaP) é o câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda causa de morte por câncer nos Estados Unidos 1. Morte de CaP não é devido à formação do tumor primário, mas sim a formação de metástases. Portanto, a prevenção de metástases em pacientes é de grande importância. Modelos do rato do CaP oferecer uma diversidade de opções para descobrir a informação biológica crítica sobre esta doença.

Uma variedade de modelos do rato do CaP existir, cada um com vantagens e limitações inerentes. Enquanto a freqüência de CaP em humanos é alta, ocorre naturalmente PCA é extremamente raro em ratos 2, apesar de igual susceptibilidade de camundongos geral para câncer 3. Uma exceção roedor é o desenvolvimento de CaP em ratos Wistar Lobund, que pode atingir taxas de CaP de 90% em 12 meses de idade através da indução de metilnitrosoureia e testosterona 4. Por esta razão, os sistemas de modelo induzido, tal como o TRAMP(Adenocarcinoma transgénico da próstata de ratinho) modelo são vulgarmente utilizados. O modelo TRAMP pode induzir a expressão do transgene especificamente na próstata, e sofre a progressão normal de CaP, de hiperplasia para neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) para o sistema linfático e metástase pulmonar 5-6. Estes modelos proporcionam as vantagens de ser capaz de medir a gama completa da progressão do tumor, bem como conter um sistema imune intacto. No entanto, os eventos moleculares subjacentes ao desenvolvimento CaP pode diferir entre os ratos e os seres humanos, e as correlações entre os ratos e estudos clínicos em humanos demonstraram variabilidade. Além disso, ambos os modelos são demorados, como por exemplo, o modelo TRAMP requer cerca de 28 semanas, a fim de desenvolver metástases.

Ao estudar metástase, freqüentemente um modelo de injeção de ventrículo cauda veia ou esquerda é usada. Este modelo beneficia do tempo de resposta rápido, e, adicionalmente, pode medir a presença de metastas ósseasé usando linhas e condições específicos de células. Yang et al. Relataram que a injeção subcutânea de células PC3 GFP positivas podem causar amplamente divulgados metástase óssea 7 e veia da cauda e as injeções intercardiac também geraram osso desenvolvimento metástase 8-9. As principais limitações destes modelos referem-se à falta de um tumor primário que reside dentro da própria glândula da próstata. Além disso, para os modelos dependentes de injecção de células cancerígenas na circulação, isto evita toda a primeira metade da cascata metastática. É, assim, impede o exame de medidas iniciais, como a invasão através do órgão principal, que são biologicamente medidas cruciais de transformação metastático. Muitos reguladores de transformação metastático afetam diretamente invasão celular precoce. Os primeiros passos da cascata metastática constituem locais de alta prioridade para o direcionamento terapêutico, como uma vez que as células cancerosas disseminar, a variação clonal expande, aumentando assim biológicodiversidade al e diminuindo direcionamento terapêutico eficaz.

Numa tentativa para responder a muitas das limitações destes modelos, o nosso laboratório tem desenvolvido um modelo ortotópico de CaP humana em que a linha de células de CaP PC3-M humana está directamente implantadas na próstata de Balb / c atímicos ratinhos. Depois de 4-6 semanas, o tamanho do tumor, a presença de células tumorais (CTCs) em circulação, e metástase para os pulmões e nódulos linfáticos podem ser quantificados. Nós efetivamente utilizado este modelo para avaliar a eficácia de 4 ',5,7-trihidroxi (genisteína) para inibir humano PCa metástase 10. Consumo alimentar de genisteína tem sido associada à diminuição da metástase do câncer de próstata e morte 11-12, mas previamente nenhum estudo havia determinado se administração de genisteína poderia alterar PCa metástases em animais ou homens. Neste estudo foi demonstrado que o tratamento com genisteína reduziu significativamente o número de metástases pulmonares. Além disso, determinou-se a genisteína altrado a activação e expressão de várias proteínas pro-metastáticos importantes do tumor primário, incluindo a quinase de adesão focal (FAK), p38 activada por mitógeno proteína quinase (MAPK p38), e a proteína de choque térmico 27 ​​(HSP27).

Estes resultados correspondem com as observações na clínica. Usando o sangue obtido a partir dos ratos, fomos capazes de medir com precisão as concentrações de sangue de genisteína e observaram que estes sejam semelhantes aos níveis em seres humanos com o consumo da dieta regular de genisteína. Além disso, um estudo de fase II realizado pelo nosso grupo determinou que, após tratamento com genisteína, homens experimentaram diminuições na expressão de mRNA de tecido de próstata de genes associados com a metástase e invasão celular, especificamente matriz metaloproteinase tipo 2 (MMP-2) 13.

Temos também utilizado este modelo para avaliar o efeito da alteração de expressão gênica do produto no tumor primário em humanos PCa metástase 14. O suppr tumoressor endoglina é um membro da superfamília de TGF-p e suprime CaP invasão celular humano in vitro, através de alteração de sinalização Smad 15. Estendemos esses estudos para determinar o efeito de endoglin em metástase PCa humano. Knockdown endoglin estável, controle de vetores ou endoglin sobre linhas de células de expressão foram implantadas em ratinhos. Células knockdown endoglina mostraram o maior número de metástases do pulmão, bem como CTC em 38% dos ratinhos. Ratos implantados com controle de vetores mostraram uma resposta médio, com menos metástase pulmonar por mouse, e CTCs em apenas 18% dos camundongos. Camundongos alta endoglin implantados mostrou supressão quase completa de metástase pulmonar e supressão completa de CTCs.

Estes são apenas dois exemplos da grande variedade de aplicações desta técnica tem. Desde a descoberta da droga, para as mudanças de modelagem em biologia molecular, este modelo oferece um método de alto rendimento de avaliar os efeitos de várias funções no crescimento do tumor e molesalterações vasculares, a presença de CTCs, e formação de metástases distinto nos gânglios linfáticos e pulmão.

Protocol

Para todos os procedimentos que envolvem animais, os protocolos foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) da Universidade de Northwestern. As técnicas cirúrgicas e condições de cuidados de animais foram observados por veterinários e modificado para minimizar o estresse ou mortalidade animal. Instituições individuais podem ter diferentes necessidades e é importante trabalhar com IACUC e animal pessoal ao elaborarem e executarem esta técnica cirúrgica. 1. Preparação de Células para Injecção Este passo deve ser realizado o mais próximo possível de se iniciar as cirurgias. Tripsinizar células a ser utilizadas para o experimento, retire do prato, e neutralizar com a mídia. A linha celular PC3-M humana CaP estavelmente transfectadas com GFP tem sido utilizado com sucesso para estas experiências, devido às condições de crescimento rápido das células PC3-M. GFP foi adicionado para facilidade adicional de detecção da metástase pulmonar em amostras de tecido de pulmão, e a determinação rápida decélulas de câncer, contra as células do sistema imunológico nas culturas obtidas a partir de sangue e de medula óssea para identificar as células tumorais circulantes. Se a modificação de um gene específico de interesse, em seguida, a criação de linhas celulares estáveis ​​com esta alteração do gene é realizada em primeiro lugar, seguida por transfecção com GFP. Se GFP irá alterar a função deste gene de interesse, a GFP pode ser omitido. Isso fará com que a detecção de metástases pulmonares mais difícil, mas ainda possível. Além disso, se utilizar a tecnologia de imagem específico utilizando marcadores fluorescentes, tais como à base de luciferase IVIS, outras proteínas fluorescentes podem ser utilizados em vez disso. Centrifugar durante 5 minutos a 225 x g. Isolar 2,5 x 10 5 células, e centrifuga-se durante 5 min a 225 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 20 ul de solução salina estéril. Suspensão de células Aspirar para uma seringa de 0,5 ml com um permanente 28 ½ G agulha (recomendado: Kendall Monojet, como outras marcas têm causado problemas), garantindo que não haja ar entra no al agulhaong com a suspensão. Embrulhe em papel alumínio seringa estéril e armazenar no gelo até ser usado. 2. Implantação ortotópico de células cancerosas da próstata humana Macho de 6-8 semanas de idade Balb / c atímicos ratos são usados. O peso corporal do rato ideal para a cirurgia é 19-21 g, e os ratos devem ser autorizados a crescer para pelo menos 18 g antes da cirurgia. Animais menores são tecnicamente mais difíceis de operar. Animais maiores tendem a experimentar cinética mais lenta de crescimento de tumores e metástases. Os animais devem ser alojados na instalação para animais pelo menos uma semana antes da cirurgia, para minimizar a tensão dos animais. Dependendo do desenho experimental, o medicamento pode começar uma semana antes da cirurgia. Injetar pré-cirurgia medicação para a dor de acordo com as instruções de instalação animal. 0,1 mg / kg de peso corporal Buprenex subcutânea usando uma agulha de 30 ½ G ligada a uma seringa de 1 ml é sugerido. Coloque os animais na câmara de isoflurano e espere até que os animais são completamente umnesthetized. No reflexo dedo do tônus ​​muscular deve estar presente neste momento. Recomenda-se este método, mas se não estiver disponível, outros métodos de anestesia pode ser utilizado de acordo com as instruções de instalação dos animais. Mova animais para fora da câmara de isoflurano em uma capa de procedimento estéril. Coloque o animal para dentro do aparelho cone do nariz, e re-assegurar esse animal está sob anestesia completo antes de prosseguir. Desinfetar região inferior abdominal com uma esfoliação Betadine com bolas de algodão estéreis, limpe com algodão embebido em álcool, e spray de final com solução de Betadine. Deixe secar. Usando um bisturi estéril ou tesouras cirúrgicas estéreis afiadas, uma baixa incisão abdominal mediana de cerca de 3-4 mm é feita. Suavemente elevar a bexiga, utilizando um fórceps e identificar o lóbulo ventral da próstata. Estes dois lobos estão localizadas diretamente abaixo da bexiga. Alguns ratos terá uma pequena camada de gordura que cobre a próstata, que pode ser suavemente afastou com um cotonete estéril. Minimizandoe todo o movimento de órgãos e musculatura, se possível. Injecte 20 ul volume de solução de células na próstata, minimizando o vazamento e assegurando uma pequena bolha é observada. Substitua bexiga e fechar a camada muscular com 4,0 absorvíveis suturas vicryl monofilamento em um padrão simples interrompido. Feche a camada de pele usando estéreis grampos 9 milímetros. Remover animais da anestesia isoflurano e monitorar até acordado e se movendo normalmente. Coloque em almofada de aquecimento durante o período de recuperação. Se várias cirurgias estão sendo realizadas, entre cirurgias, limpo todas as ferramentas com etanol 70%, e esterilizar utilizando um esterilizador de contas de vidro. Permitir ferramentas para esfriar completamente antes do próximo animal. Não reutilize suturas, bolas de algodão, cotonetes ou estéreis. 3. Animais de Monitoramento Administrar medicação para a dor com base nas instruções da instalação animal. 4 horas pós-cirurgia de administração de uma dose de meloxicam por via subcutânea com 1 mg / kg de peso corporal ucantar uma agulha 30 ½ G ligada a uma seringa de 1 ml é sugerido, seguido por uma dose adicional a cada 12-24 horas, para o próximo 48 hr. Os grampos podem ser removidas a partir de animais de 7-10 dias após a cirurgia, uma vez que a ferida tenha cicatrizado. Monitorar o peso animal, consumo de alimentos, e palpar os ratos para tumores duas vezes por semana até o término do experimento. Aumentar a frequência até a cada dois dias, quando os tumores se tornam visíveis para verificar se os animais sob a carga tumoral significativa ou coação. Morte antecipada a partir deste modelo é devido à grande carga do tumor primário, como tumores primários podem bloquear o fluxo de urina, de modo que qualquer animal com uma perda de mais de 15% de peso do corpo ou de um tumor primário atingindo um diâmetro de 1,5 cm deve ser necropsiados imediatamente evitar a obstrução urinária e morte dos animais. Monitor para necessidade de enriquecimento adicional do ambiente animal. O estresse da cirurgia aumenta lutas animal. A adição de duas barracas de lona plástica por gaiola em vez de um e comportamento adicionalal enriquecimento pode diminuir estes incidentes. Discuta com as opções do pessoal veterinário disponíveis na instalação sejam alojados em. Dada a falta de cílios nesta linhagem de camundongos, cabanas e enriquecimento de papel não são recomendados, pois podem irritar os olhos. 4. Procedimentos de necropsia Depois de 4-6 semanas, os tumores são totalmente evidente e os animais começam a perder peso devido ao aumento da carga tumoral. Os tumores podem ser tipicamente palpada e / ou que são claramente visíveis. A necrópsia deve ser realizada neste momento. Executar uma injeção intraperitoneal de Nembutal a 260 mg / kg de peso corporal usando um medidor de 30 ½ agulha acoplada a uma seringa de 1 ml, e permitir que os animais para se tornar totalmente inconsciente, sem nenhum reflexo dedo do pé ou o tônus ​​muscular presente. Uma vez que o animal é anestesiado, usando tesouras cirúrgicas esterilizadas ou de um bisturi, cortar horizontalmente ao longo do tronco do animal directamente sob a caixa torácica, então verticalmente para a axila ao longo do lado do animal, Expor o coração. Realizar uma punção cardíaca, usando uma agulha de terminal 30 ½ G ligada a uma seringa de 1 ml lavada com citrato de sódio a 4% em DPBS para impedir a coagulação, obtendo-se o máximo de sangue possível do animal. Remoção dos pulmões do animal através do corte da traqueia com uma tesoura cirúrgica ou bisturi e colocar imediatamente em uma cassete de cultura de tecidos e em 10% de formalina. Remover o tumor da próstata primário a partir do animal, cortando individualmente quaisquer vasos sanguíneos ligados ao tumor e não há garantia de órgãos complementares, tais como os canais deferentes ou vesículas seminais estão ligados. Registar o peso e tamanho do tumor. Medir o peso do tumor, em gramas, a uma escala laboratorial. Usando pinças, medir o comprimento do maior diâmetro do tumor em cm, e o eixo perpendicular correspondente. Multiplique esses valores para obter o tamanho do tumor. Dependendo do uso pretendido, imediatamente tirar congelamento em nitrogênio, e / ou local de líquido nopara uma cassete de tecido em formalina a 10%. Expor os quadril e joelho com uma tesoura cirúrgica ou um bisturi, e articulações das pernas de desconexão, tendo o cuidado de manter o fêmur intacto. Remover os fémures do animal e colocar em solução salina estéril. Obter quaisquer outros órgãos ou materiais de interesse, e dispor de animais de acordo com as instruções do seu instituto. Em particular, os nódulos linfáticos regionais, tendem a ter metástases, tendem a ser ampliado, se as abrigam, e pode ser colhido. No entanto, cuidados devem ser tomados, pois isso pode ser afetado por mudanças na pressão hidrostática causadas pelo procedimento cirúrgico. 5. Processamento e imunocoloração de pulmão amostras de tecido Dentro de 24-48 horas de colocar o tecido em formalina a 10% em PBS, inserir os pulmões em parafina. Seção dos pulmões em 45 mM seções passo, tendo 2-3 4 mm de seções adjacentes tecido pulmonar. Se foram utilizadas células GFP positivas (recomendado), execute immunostainingpara GFP. Se não, realizar Hematoxilina padrão e eosina (H & E) coloração. NOTA: O kit Dako Envision + combinado com o anticorpo GFP a partir de Invitrogen tem sido utilizado com sucesso de acordo com as instruções do fabricante, mas este pode ser modificado a qualquer procedimento de imuno-histoquímica. Pontuação metástase de forma cega. Se GFP-positivas, as células tumorais irá manchar castanho, para além de ter núcleos grandes e distintivos. Quando a primeira metástase de pontuação, consultar um patologista para garantir pontuação correta, e usar H & E o tecido pulmonar corado para confirmar presença de células tumorais, e não infiltrar células do sistema imunológico. 6. Identificação de células tumorais circulantes do sangue e medula óssea Adicione todo o sangue coletado da necropsia para um tubo de centrífuga de 1,5 ml. Centrifugar 5 min a 800 x g. Remover o plasma e adicionar 1 ml ACK tampão de lise (154,95 mM cloreto de amônio, 9,99 mM de potássio Bicarbonate, EDTA 0,0995 mM,). Permitir que o sangue para descansar em temperatura ambiente 3-5 min. Centrifugar 5 min a 800 x g. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio de cultura celular contendo antibióticos. Adicionar células a um frasco T75 contendo 9 ml de meio de cultura celular. As células de cultura a 37 ° C em uma atmosfera húmida contendo 5% de CO 2 durante 10 dias, verificando-se a presença de CTC a cada 2-3 dias. Para medula óssea, remover todo o tecido muscular de fêmures usando um par de tesouras, uma lâmina de barbear ou bisturi. Retirar as extremidades do osso, o mais próximo possível das extremidades como possível. Usando uma agulha de 23 ¾ L, ejectar suavemente a medula óssea do fémur para um tubo de centrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1 ml de meio de cultura de células e suavemente pipetar bem para misturar. Adicionar células a um frasco T75 contendo 9 ml de meio de cultura celular. 7. Caracterização molecular dos tumores Por reacção em cadeia da polimerase (PCR)s, as amostras de tumor que foram rapidamente congelados em azoto líquido são primeiro pulverizados em gelo seco e em seguida homogeneizadas com um homogeneizador de tecidos para 3-5 min com 1 ml de Trizol. TRIzol extração é realizada por instruções do fabricante. Purifica-se o ARN utilizando o kit de isolamento de ARN RNeasy de acordo com as instruções do fabricante. Realizando a síntese de cDNA e quantitativo em tempo real, PCR (qRT / PCR), utilizando os reagentes TaqMan de acordo com as instruções do fabricante é recomendada, mas pode ser modificado por qualquer método de PCR actualmente empregues. Para ensaios de Western blot, homogeneizar os tecidos utilizando um homogeneizador de tecidos para 3-5 min com 1 ml de tampão de lise: PBS (NaCl 137 mM, fosfato de sódio 10 mM, KCl 2,7 mM), 0,5% de Triton X-100, 1 mM de EDTA, pirofosfato de sódio a 2,5 mM, 1 mM β-glicerofosfato, com a adição do cocktail inibidor de protease, inibidor de fosfato cocktails 2 e 3, o fluoreto de sódio 10 mM, e ortovanadato de sódio 1 mM. A mistura de ligado celular é colocado em um tubo de centrífuga de 1,5 ml. Centavomistura lisado celular rifuge durante 10 min a 13.000 x g. Remover o sobrenadante e no lugar de um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml e novamente centrifugado durante 10 min a 13.000 x g. Se os restos celulares ainda está presente, uma etapa de centrifugação adicional pode ser realizada. Remover o sobrenadante e realizar um Western blot conforme condições normais de laboratório.

Representative Results

Para este experimento, mostramos um grupo representativo de ratos obtidos durante os procedimentos cirúrgicos. Cinco ratinhos foram implantados com células GFP positivas PC3-M, contendo um vector de controlo. Os tumores foram deixados crescer durante seis semanas, e, em seguida, foram avaliados vários parâmetros. Nas Figuras 1A e 1B, que mostra a alteração no peso corporal e consumo de alimento dos ratos, respectivamente. Há uma pequena queda no peso corporal e consumo de alimentos em torno da data da cirurgia, devido à anestesia. Durante o decurso da experiência, o peso corporal aumenta lentamente pós-cirurgia, e em seguida começa a diminuir no sentido do fim da experiência, como a carga do tumor atinge um nível crítico. Isto é acompanhado pelo consumo de alimentos nesses camundongos. Nas Figuras 2A e 2B, os tamanhos de tumor representativos obtidos são mostrados. Tamanhos tumorais individuais variam, mas em média conseguimos tumores de aproximadamente 1 grama, comvariância normais entre 0,5-1,5 g, e uma dimensão do tumor de 1 cm 2, com uma variação normal do 0.5-1.5 cm 2. Embora o tamanho dos tumores variam, estes não se correlacionam com o número de metástase resultante, mostrado tanto neste documento e as obras já publicadas 10. Contudo, a partir deste modelo, pode-se determinar o efeito do tratamento com droga ou alterações moleculares no peso e tamanho do tumor. Uma consideração importante neste modelo é, quando o ponto final adequado para a experiência é. Nas Figuras 2C e 2D, que mostra as variações de peso do tumor e o tamanho do tumor em uma linha celular PC3-M especial estavelmente transfectadas com GFP e um vector de controlo às 4 semanas e às 6 semanas. Nas últimas duas semanas, o peso médio do tumor aumentou de 2,7 vezes, e o tamanho do tumor 1,9 vezes. Esta mostra a adição de 1-2 semanas adicionais na experiência pode influenciar drasticamente resultados. Como um grande número de factores pode alterar o crescimento de tumores, incluindoa idade e o tamanho dos ratinhos, o número de passagens das células, etc recomendamos não encerra experiências até tumores visíveis são observadas na maioria dos ratinhos. Nas Figuras 3A-3C, o número de metástases é quantificada três maneiras diferentes. Na Figura 3A, o número total de células humanas CaP GFP positivas são representadas. Na Figura 3B, o número de loci de células, ou os locais em que os depósitos metastáticos estão presentes, é mostrada. Finalmente, na Figura 3C, o número de metástases distinta, tal como definido por um grupo claramente ligado de células mostrando 5 ou mais células de CaP humanos GFP positivas, é exibido. Imagens representativos destas condições diferentes são apresentados nas Figuras 4A-4D. Na Figura 4A, uma célula individual em 40x magnitude é destacada com uma seta. Observe a coloração marrom e grandes núcleos distintos. Uma seção do pulmão adjacente coradas utilizando H & E coloraçãoé mostrada na Figura 4B, confirmando que, sem a GFP, a detecção de células de cancro ainda é facilmente alcançável. Esta foto é tirada em 40x magnitude ea célula é destacada com uma seta. Na Figura 4C, vários loci de variação do número de células em 10x magnitude são exibidos e cada locus destacada com uma seta. . Por último, na Figura 4D, um depósito metastático de células 10 é mostrado. Como influenciar estes métodos os dados são mostrados por diferenças de Rato 1 e 3 do mouse. Rato 1 tem um número menor de células totais, do pulmão, com uma média de 21,5 células por secção de pulmão, em comparação com Rato 3, que tem uma média de 700 células por secção de pulmão. No entanto, Rato 3 tem menos loci, ou em locais onde as células estão presentes de rato 1. Rato 3 tem relativamente poucos sítios de metástase, mas o número de células por unidade de área é muito alta em 82 células por loci devido a várias metástases número de células muito grandes. Em contraste, Rato 1 tem loci mais original, mas significativamente fcélulas ewer por local em apenas uma média de duas células por localização. Estes diferentes parâmetros podem lançar luz sobre a cinética de células tráfico para o pulmão e na sua capacidade para iniciar a crescer e proliferar. Além disso, na Figura 3D, vamos mostrar alterações nas células metastáticas totais por pulmão em camundongos submetidos à necropsia aos quatro contra seis semanas. Tal como descrito nas Figuras 2C e 2D, as alterações significativas são observados em relação ao peso e tamanho do tumor em duas semanas finais de uma experiência. Este é recapitulada na Figura 3D. Os ratinhos foram necropsiados em quatro semanas não apresentaram desenvolvimento metastático, enquanto que os ratinhos às 6 semanas mostrou células metastáticas em todos os ratinhos estudados. Isso demonstra ainda mais a importância de se garantir necropsias ratos são realizados em um ponto de extremidade de fase final para garantir a formação de metástases ocorreu. Uma medição adicionado neste modelo é de alterações moleculares que ocorrem no interior do tumor primário. Nas Figuras 5A-5C mostram que três exemplos de experiências de qRT / PCR medindo três genes de interesse em progressão metastática, as metaloproteinases de matriz tipo 2 (MMP-2), metaloproteinases de matriz do tipo 9 (MMP-9), e a proteína de choque térmico 27 (HSP27) respectivamente. Qualquer gene de interesse medido por meio de qRT / PCR pode ser detectada usando esta técnica. Além disso, os níveis de proteína pode ser quantificada utilizando-se procedimentos de western blot. Figura 1. Peso corporal observado e consumo de alimentos em animais AB) de peso. Corpo em gramas, ou consumo médio de alimentos por rato por dia, em gramas, é registrado durante todo o experimento e mostrado em A) e B), respectivamente. fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/> Figura 2. O tamanho do tumor e peso do tumor em grupos de ratinhos individuais e. AB) O peso do tumor, em gramas, e o tamanho do tumor em centímetros quadrados de cinco ratinhos de controlo representativos e a média dos cinco ratinhos no fim de seis semanas são mostradas em A) e B), respectivamente. CD) Uma comparação entre o peso do tumor, em gramas, e o tamanho do tumor em centímetros quadrados entre grupos de ratos submetidos à necropsia aos quatro e seis semanas. Clique aqui para ver maior figura . Figura 3. Metástase em individual e grupos de ratos. AC) A dist metastático médiad por corte de pulmão de cinco ratinhos individuais e a média dos cinco ratinhos no fim de seis semanas representados como qualquer número total de células (A), locais de células metastáticas (B), ou metástase distinta, tal como definido por 5 + células em um cluster claramente definida (C). D) Uma comparação entre o número médio de células metastáticas por seção pulmão por rato entre os ratos submetidos à necropsia aos quatro e seis semanas. Clique aqui para ver maior figura . Figura 4. Imagens representativas de metástases pulmonares. A) Uma GFP células de pulmão positivo indivíduo em 40X objetivo é destacada com uma seta. B) Um pulmão adjacentesecção de A), mostrando a mesma célula em H & E coloração. C) Uma seção de pulmão em 10X objetivo com sete locos indivíduo que contém números diferentes de células. D) Uma metástase distinta em 10X objetiva contendo 10 células cancerosas claramente definidos como um grupo. Figura 5. A análise por PCR de três genes de interesse metastáticas. QRT / PCR foi realizada em amostras tumorais obtidas de ratinhos em seis semanas. Níveis de transcritos de ARNm relativos de MMP-2 (A), MMP-9 (B), e HSP27 (C) são medidos, normalizada para GAPDH. clique aqui para ampliar figura .

Discussion

Neste trabalho, fornecer um modelo murino romance de metástase PCa humano. Neste modelo, o humano CaP linhas celulares PC3-M é ortotopicamente implantado directamente na próstata de Balb / c atímicos ratinhos e permitiram desenvolver tumores durante 4-6 semanas. Na secção de resultados representativos, que mostram exemplos de dados que podem ser recolhidos, incluindo o peso do rato e do consumo de alimentos, o tamanho do tumor e peso, as características moleculares do tumor, e a formação de metástases distinta para o pulmão. Além disso, uma grande variedade de saídas adicionais podem ser estudados de acordo com os interesses particulares de investigação. Um exemplo é a presença do CTC para o sangue e de medula óssea. Como CTCs são um evento relativamente pouco frequentes (observamos CTCs em cerca de 5-20% dos animais do grupo controle), não ficamos surpresos de que nenhum dos cinco ratos nesses experimentos desenvolvidos CTCs. Nosso laboratório também tem usado este modelo para determinar as alterações na adesão celular medindo a morfologia das células nuclear notecido da próstata 10. Temos também utilizado este modelo para avaliar o estado de proliferação e apoptose tumor primário utilizando Ki67 e TUNEL coloração do tumor de próstata 14.

Além da grande variedade de saídas de dados que podem ser obtidos, este modelo pode ser usado para determinar os efeitos de ambas as alterações na expressão de proteínas, bem como pequenas moléculas terapêuticas. Em comparação com muitos modelos espontâneas e induzidas de metástase PCa humano, há um tempo de resposta mais elevada de apenas 4-6 semanas. Outros modelos com um elevado tempo de resposta, como a veia da cauda ou modelos de injeção intercardiac, têm limitações de nenhum tumor primário, portanto, não totalmente recapitulando a clínica cascata metastática. Em nosso modelo, as células tumorais deve escapar o principal local de origem, entrar e sobreviver ao sistema circulatório, e implantar em um site secundário. Isto proporciona passos adicionais em que uma intervenção terapêutica ou alteração na expressão da proteína poderiam proporcionar um efeito. Addinalmente, a presença do tumor primário deve permitir a fácil aplicação do presente modelo de novas tecnologias de imagiologia, tais como à base de luciferase IVIS 16-17.

Apesar da grande variedade de benefícios deste modelo, há também várias limitações a considerar. Um número cada vez maior de estudos mostram a importância do sistema imunológico no microambiente do tumor e o desenvolvimento de metástases 18. Neste modelo, devido ao uso de um roedor atímicos, a capacidade de avaliar os efeitos do sistema imunitário não é possível. A segunda limitação é a falta de responsividade de androgénio em células PC3-M. Após o diagnóstico inicial da APC, os pacientes freqüentemente passará por terapia hormonal como tratamento de primeira linha. No entanto, os doentes irão eventualmente tornar-se resistente ao andrógeno e os tumores começam a crescer novamente. Como as células PC3-M não têm o receptor de andrógeno, este modelo só mede os efeitos do tratamento de drogas ou modulação de proteínas no pós-andrógeno c resistenteancer. Embora esta é uma limitação, andrógeno-sensível PCA é atualmente bem gerenciável e tem uma variedade de opções de tratamento eficazes, e câncer, portanto, resistente à andrógeno tornou-se mais proeminente estudado. Este modelo também usa especificamente uma cepa pura de ratos, o que minimiza o mouse para variabilidade mouse. No entanto, esta estirpe pode ser particularmente sensível a determinadas proteínas ou moléculas pequenas, portanto, deve ser tomado cuidado ao extrapolar esses dados para a clínica.

Embora este modelo proporciona uma medição efetiva da eficácia da droga em um tempo de resposta rápido de 4-6 semanas, isso pode não levar em consideração efeitos de drogas dosagem de longo prazo. Depois de uma exposição prolongada a diversos tratamentos actualmente disponíveis, os pacientes podem voltar com cancros resistentes a fármacos muitos anos de pós-tratamento. A rápida recuperação da técnica não permite a modelagem eficiente da capacidade de um tumor se torne resistente a um tratamento. No entanto, com a modulação da experiment, células de cancro da próstata humanas resistentes ao tratamento pode ser implantado, e a eficácia de uma terapêutica de segunda geração em prevenir o crescimento de tumores e metástase CaP pode ser modelado. Além disso, se um grupo se tentar estudar as alterações moleculares em um tumor primário ao longo do tempo, um modelo de longo prazo, tais como o modelo TRAMP irá provavelmente ser mais eficaz para esses estudos.

Outra limitação deste modelo é a difusão de metástase distinta apenas para os nódulos linfáticos e pulmões dos animais. Ambos os sites são os locais freqüentes e clinicamente relevantes de metástase, como demonstrado por estudos de autópsia quentes humanos 19. No entanto, a metástase óssea clinicamente constitui uma característica proeminente do CaP humana, e, portanto, modelos recapitulando este são de interesse. Infelizmente, estes são difíceis de recapitular em um modelo de rato, com muito poucos modelos mostrando metástase óssea, sem veia da cauda, ​​a injeção intracardíacos, ou implantação direta noao osso 20. Assim, se direcionando para o osso é de fundamental importância experimental, outro modelo pode ser mais eficaz. No entanto, este modelo não fornecer alguma medida de tráfego para o osso na forma de medula óssea células tumorais circulantes.

Apesar destas limitações, esta técnica é um modelo poderoso de CaP humano. A capacidade para medir efeitos sobre tanto do tumor primário, bem como a formação de metástases em um curto tempo de resposta proporciona uma ampla variedade de aplicações. Neste modelo, as células devem escapar do órgão principal, entrar e sobreviver na corrente sanguínea, e implante em um site secundário, recapitulando o processo em seres humanos. A medição adicional de características moleculares do tumor primário, as mudanças na morfologia celular e presença de células tumorais circulantes fornece uma ampla respiração de informações de um modelo. Este procedimento pode ser utilizado tanto no contexto de descoberta de drogas, bem como para estudar alterações na biologia do tumor.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) a RCB, CA122985 e próstata SPORE CA90386, e para JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery Formação em Distúrbios da Age-Related", e pelo Walter S. E Lucienne Programa de Pós-Graduação em Ciências da Vida Driskill na Universidade Northwestern. Gostaríamos também de agradecer ao Rato Fenotipagem e Histologia e Patologia Laboratório Núcleo Facility da Universidade Northwestern.

Materials

Equipment
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip Becton Dickinson 309659
23 G 3/4 Precison Glide Needle Becton Dickinson 305143
30 G 1/2 Precision Glide Needle Becton Dickinson 305106
Alcohol Wipes Triad 10-3001
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel Becton Dickinson 427630
Clips, 9mm VWR 15431-673
Convertors Polyline Towel (Sterile) Cardinal Health 3520
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft Fisher 23-400-125
Curad Sterile Cotton Balls VWR 500043-544
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4″) VWR 95039-192
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PN70
Germinator 500 Cell Point Scientific SN 7030
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle Tyco 1180528012
Medium Heating Pad VWR 100229-094
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2″) VWR 94000-000
Metric/English Vernier Caliper VWR 19155-057
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27″ Ethicon Z304H
VetEquip Inhalation Anesthesia System Contact Your Animal Facility for Availability
VWR Premium Tissue Cassettes VWR 18000-010
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2″) VWR 82027-440
Reagents
Betadine Surgical Scrub Fisher Healthcare 19-027132
Buprenex Controlled Substance – Obtain from Animal Facility
Dako DAB + Chromagen Dako K3468
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit Dako K4003
Dako Envision Kit Protein Block Dako X0909
Formalin VWR 95042-908
GFP Antibody Invitrogen A11122
Hematoxylin Mayer MH580-2.5L
Meloxican Obtain from Animal Facility
Nembutal Controlled Substance – Obtain from Animal Facility
Rneasy RNA Isolation Kit Qiagen 74104
Sterile Saline Obtain from Animal Facility
Taqman Reverse Transcription Reagents Life Technologies N8080234
TaqMan Universal PCR Master Mix Life Technologies 4304437
Trizol Invitrogen 10296
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Riferimenti

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Prostate CancerOrthotopic ModelMetastasisPreclinical ModelCirculating Tumor CellsLung MetastasisTherapeutic Response

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Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (79), e50873, doi:10.3791/50873 (2013).
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