אוויר מבחן הקשר ורמז פחד באמצעות מערכת ניתוח וידאו בעכברים
1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science,Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency,Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences,National Institutes of Natural Sciences
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול לבדיקת אוויר קונטקסטואלי ורמז פחד באמצעות מערכת ניתוח וידאו על מנת להעריך פחד למידה וזיכרון בעכברים.
Abstract
בדיקת אוויר הפחד הקונטקסטואלית ורמז היא אחד המבחנים התנהגותיים שמעריך את היכולת של עכברים כדי ללמוד ולזכור קשר בין רמזים הסביבתיים וחוויות של דחייה. בבדיקה זו, עכברים ממוקמים לתוך תא אוויר וניתנים גזירים של גירוי מותנה (רמז שמיעתי) וגירוי מרתיע הבלתי מותנה (footshock חשמלי). לאחר זמן השהיה, העכברים שנחשפו לאותו תא האוויר וחדר מעוצב באופן שונה עם הצגה של האות השמיעתית. הקפאת התנהגות במהלך הבדיקה נמדדת כמדד של זיכרון פחד. כדי לנתח את ההתנהגות באופן אוטומטי, שפיתחנו מערכת לניתוח וידאו באמצעות תוכנת יישום תכנית ImageFZ, שהוא זמין להורדה בחינם בhttp://www.mouse-phenotype.org/. כאן, כדי להראות את הפרטים של הפרוטוקול שלנו, אנחנו מדגימים ההליך שלנו להקשרים ורמז מבחן אוויר פחד בעכברי C57BL/6J באמצעות syst ImageFZאותם. בנוסף, אנו תוקף הפרוטוקול שלנו ואת ביצועי מערכת לניתוח וידאו על ידי השוואת זמן הקפאה שנמדד על ידי מערכת ImageFZ או מערכת מדידת מחשב מבוסס photobeam עם שהובקע על ידי צופה אנושי. כפי שניתן לראות בתוצאות הנציג שלנו, נתונים המתקבלים על ידי ImageFZ היו דומים לאלה נותחו על ידי צופה אנושי, המציין כי הניתוח התנהגותי באמצעות מערכת ImageFZ הוא אמין ביותר. מאמר הסרט הנוכחי מספק מידע מפורט בנוגע להליכי הבדיקה ויקדם את ההבנה של מצב הניסוי.
Introduction
בדיקת אוויר הפחד הקונטקסטואלית ורמז היא הפרדיגמה התנהגותיות המשמשת להערכת פחד אסוציאטיבי למידה וזיכרון במכרסמים 1-3. בדיקה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי להבין את המנגנונים הנוירוביולוגי של למידת פחד וזיכרון בעכברים הטרנסגניים ונוקאאוט 1,4-16. התנהגות הקפאה, אשר מוגדרת כחוסר תנועה מוחלטת למעט נשימה, היא תגובה שכיחה למצבים מפחידים. בפרדיגמה ההתנהגות הזה, אחרי בעלי החיים נחשפים לזיווג של אות שמיעתית עם footshock חשמלי, הם מגיבים לגירוי לייצור הפחד על ידי הצגת התנהגות הקפאה, הנמדדת כמדד ללמידת פחד אסוציאטיבי וזיכרון. בדיקה זו דורשת ציוד פחות משוכלל, פחות מאמץ פיזי על ידי החוקר, והרבה פחות זמן אימון לעכברים מאשר משימות למידה וזיכרון אחרות, זה בדרך כלל דורש כ 5-10 דקות / יום לכל עכבר למשך 2 ימים. למרות הליך הבדיקה הוא סיmple ודורש מעט זמן לביצוע, החוקר חייב להתבונן היטב ולמדוד את התנהגות עכבר, ולכן מספר מערכות מדידה אוטומטית פותחו כדי לנהל את הניתוח התנהגותי 17-20. מערכת וידאו הניתוח שלנו, בו אנו פותח עם תוכנת ImageFZ התכנית, מאפשרת לנו לנתח בקלות הקפאת התנהגות ולהפיק תוצאות אמינות ביותר. מאמר זה מספק מידע מפורט על הליך הבדיקה שלנו, ומתאר כיצד להשתמש בתוכנת ImageFZ התכנית.
Protocol
כל הניסויים צריכים להתבצע על פי ההנחיות ופרוטוקולים שנקבעו על ידי ועדות טיפול בבעלי חיים ושימוש מקומיות. 1. הגדרת מנגנון המנגנון לבדיקת האוויר והקשר הוא חדר מרובע עם רצפת רשת electrifiable, מקור קול, ומחולל הלם מכויל. גדלים קאמריים שונים משמשים, עם ממדים שונים מ54 סנטימטר x 27 סנטימטר x 30 סנטימטר 21-25 סנטימטר x 35 סנטימטר x 30 סנטימטר 22. בפרוטוקול זה, המנגנון מורכב מתא רבוע אקריליק (33 סנטימטר x 25 סנטימטר x 28 סנטימטר; שקוף בקירות הקדמיים ואחוריים; לבן בקירות הצדדיים) עם רשתות מתכת (0.2 קוטר סנטימטר, במרווחים 0.5 סנטימטר) מכוסה על ידי מכסה אקריליק שקוף (איור 1 א). יש צורך למקם את החדר בקומת אקריליק לבנה (איור 1 ב) כדי לנתח את התנהגותם של עכברים חומים שחורים, agouti, או לדלל כי מערכת ניתוח תמונה עימיתוכנת mageFZ (זמינה להורדה בחינם, ראה טבלה של חומרים / חומרים כימיים) מבחינה נושא כהה מרקע לבן בכל תמונת וידאו שנתפס. עכברי אלבינו גם ניתן לבדוק באמצעות רשתות מתכת שחורות ורצפה אקריליק שחורה (איור 1). אורות דיודה פולטת אור (LED) מחוברים לתקרה מעל המנגנון. רצפת הרשת מוארת ב100 סוויטה דה לוקס ידי נורות LED. רמקול המחובר לגנרטור רעש לבן / טון (איור 1 ג) הוא רכוב על תקרה 5 ס"מ מעל המכסה להציג קיו שמיעה (רעש לבן, 55 dB) כגירוי מותנה (CS). הרשתות קווית לגנרטור הלם (איור 1 ג) כדי לספק footshock חשמלי כגירוי בלתי המותנה (US). חדר הבדיקה יוצב בחדר אטום לרעש (170 סנטימטר x 210 200 סנטימטר) (1D איור) כדי למזער את הרעש חיצוני במהלך הבדיקות. מצב זה גם מונע את העכברים שלא נמצאים כעת נתוןלבדוק מלשמוע אות שמיעתית או הניקוד של עכברי המבחן. המנגנון לבדיקת הרמז מורכב מתא שיש לו תכונות שונות מתא האוויר, מתן הקשר חדש. זה הכרחי כדי לשנות את האותות חושיים ככל האפשר, כך שהעכבר תופס את הקשר הרומן כמו להיות קשור לתא האוויר. בדרך כלל, משמשת תיבה בצורה שונה או קאמרית משולשת. בנוסף, רמזי תאורה ו / או ריח שונים ניתנים גם לעכבר. בפרוטוקול זה, המנגנון הוא קאמרי משולש אקרילי (33 סנטימטר x 29 סנטימטר x 32 סנטימטר; לבן בכל קיר בצד) עם רצפה שטוחה, לבנה לעכברים שחורים, agouti, או לדלל חומים או רצפה שטוחה, שחורה לבקן עכברים, מכוסה במכסה שקופה אקרילי (איור 1E). נורות LED מחוברים לתקרה מעל המנגנון. רמת ההארה של הרצפה מוגדרת ב30 סוויטה דה לוקס. דובר הוא רכוב על התקרה 5 ס"מ מעל את המכסה ליחסי ציבורesent קיו שמיעה כי הוא זהה לזה הניתן לעכברים בזמן האוויר. הקאמרית המשולשת נמצא בחדר אטום לרעש שונה מהחדר שבו האוויר ובדיקת הקשר מבוצעים. כל תא מצויד בהתקן טעינה בתיקרה יחד מצלמה (CCD) חיבור למחשב Windows באמצעות מפצל מרובע וידאו ו-USB התקן לכידת תמונה כדי לפקח על התנהגותו של העכבר, ותמונות של המנגנון ואת העכבר שנתפסו ונותח על ידי ImageFZ תוכנת יישום (ראה פרוטוקול 6). מחוללי הרעש וfootshock לבנים נשלטים באופן אוטומטי על ידי תוכנת ImageFZ התכנית; את שעת ההתחלה ומשך הרעש וfootshock הלבנים חייבת להיות כתובה לקובץ טקסט (ראו לדוגמא קובץ טקסט 'פשוט-מנצח "שמוצג בווידאו עבור פרטים על אופן הפרמטרים נכתבים בקובץ), אשר קראו ליישום. לפני כל מבחן מתחיל, קירות אקריליקורצפות ניגבו במגבת הספוגה במי hypochlorous סופר (pH 6-7), והרשתות מנקים עם 70% אתנול כדי למנוע הטיה על בסיס רמזי חוש הריח. הרשתות הם ניגבו עם אתנול במקום מים hypochlorous סופר כדי להבטיח שהרשתות לא להפחית מוליכות החשמלית שלהם עקב חלודה. 2. הכנת בעלי החיים בדרך כלל, שניים עד ארבעה עכברים הם שוכנו בכל כלוב בחדר בטמפרטורה מבוקרת אחזקה (23 ± 2 ° C) עם שעות אור 12 / מחזור כהה (למשל אורות דולקים בשעה 7:00 בבוקר). בפרוטוקול זה, כדי להפחית את ההשפעות אפשריות של תחבורה כלוב על התנהגות ועל מנת להתאים את העכברים לסביבה הניסיונית, הכלובים המכילים העכברים מועברים מחדר ההמתנה של בעלי החיים לחדר המתנה לרעש בסמוך לחדר בדיקות לרעש לפחות 30 דקות לפני כל מבחן מתחיל. כל הניסויים (איור 2 א) יש לבצעו בשנתי התקופת ame זמן באור או שלב כהה בכל יום כדי למזער וריאציות התנהגותיות המיוצרים על ידי בדיקות בזמנים שונים 23,24. בפרוטוקול זה, כל הניסויים שנערכו בין 1 שעות לאחר תחילתו של שלב האור ו1 שעות לפני תחילת השלב הכהה (8:00-18:00 בשלב האור). אם רק אחד מכשירים זמינים, עכברים של כל גנוטיפ צריכים להיבדק בצו מתאזן כדי להפחית את ההשפעות אפשריות של זמן הניסוי וסדר הבדיקה של נושאים שעל ביצועים התנהגותיים. ImageFZ יכול לשלוט מקסימום של 4 מנגנונים. בדיקת 4 עכברים בו זמנית באמצעות 4 מנגנונים בצו מתאזן מאפשרת לחוקר כדי לחסוך זמן ומפחיתה את ההשפעות אפשריות של הפרמטרים הניסיוניים על התנהגות עכבר. 3. התניה עכברים ממוקמים בתא האוויר, והעכברים מותר בדרך כלל לחקור באופן חופשי את החדר ל120 שניות. לאחר מכן, auקיו ditory, כגון רעש לבן, טון, ושלט שמיעתי, מוצג כCS ל30 שניות, וfootshock mA .1-.8 ניתן לעכברים כארה"ב במהלך 2 שניות האחרונות של הקול. המצגת של קילוף CS-US חוזרת על עצמו כדי לחזק את הקשר. העכברים הם השאירו בתא לאורכו של הזמן לאחר המצגת האחרונה להקים את הקשר בין ההקשר של החדר ואת החוויה של דחייה נוספת. בפרוטוקול זה, לאחר 120 שניות של חיפושים בחינם, קיו שמיעה (רעש לבן, 55 dB) מוצג ל30 שניות, וfootshock 0.3 mA מועבר באופן רציף במהלך 2 שניות האחרונות של הרעש הלבן. לאחר 90 שניות, הזיווג של האות השמיעתית עם footshock ניתן לנבדקים שוב. המצגת של CS-US חוזרת שלוש פעמים בכל הפעלה (120, 240, ו360 שניות לאחר תחילת האוויר) (איור 2). בעקבות footshock הסופי, העכברים נותרים ללא הפרעה בתאים ל90 שניות. לפני ישיבת האוויר מתחילה, הפעל את תוכנת יישום ImageFZ התכנית, בחר בתפריט Plug-in 'פ.צ. אוויר ופ.צ. באינטרנט (4 קאמרי)', ולהגדיר את ערכי פרמטרי צעד אחרים הצעד באופן הבא. שלב 1: זיהוי פרויקט. ציין תיקייה שבה אתה רוצה לאחסן את קבצי הנתונים שלך. שלב 2: מושב שם. הקלד כל מילות, לדוגמא: מועד הניסוי, בתיבת 'המושב', ובחר בקובץ טקסט התייחסות שבו זמן ההתחלה ומשך הרעש וfootshock הלבנים נכתבים, בתיבה 'הפניה'. מדגם קובץ טקסט מוצג בסרטון. שלב 3: הגדרות פרמטר. הזן את ערכי פרמטרים בכל תיבה באופן הבא. שיעור (מסגרת / sec): מסגרת שיעור רכישה של תמונה, מסגרת לדוגמא 1 / sec. משך (שניות): במקרה של מיזוג, את משך הזמן הכולל היא 480 שניות. משך סל (שניות): למשל 60 שניות; הנתונים מנותחים בכל בלוק60 שניות. גודל נושא – דקות (פיקסלים): ImageFZ מזהה עכבר ורעש כמו חלקיקים שחורים (קצת מסה של פיקסלים) ברקע לבן בכל תמונה. כאשר השטח של החלקיקים השחורים (פיקסלים) הוא פחות מ 'גודל נושא – דקות (פיקסלים)' ערך (למשל 100 פיקסלים), החלקיקים נחשבים לרעש ואינם נכללים בניתוח התמונה. גודל נושא – מקסימום (פיקסלים): כאשר הגדלים של החלקיקים השחורים הם יותר מגודלו של 'גודל נושא – מקסימום (פיקסלים)' ערך, החלקיקים אינם נכללים בניתוח. גודל מסגרת – רוחב / גובה (סנטימטר): תא ממד, כלומר 33 סנטימטר רחב ו25 סנטימטר גבוה. הקפאת קריטריון (פיקסלים): למשל 30 פיקסלים, ראה פירוט בפרוטוקול 6. הקפאת משך – דקות (שניות): למשל 2 שניות; כאשר אין תנועת עכבר הוא זוהתה רק פחות מ -2 שניות, ההתנהגות שלו לא נספר כ 'ההקפאה';. שיעור הלם (מסגרת / sec): ראה פירוט בפרוטוקול 6. שלב 4: זיהוי נושא. הזן את זיהוי הנושא. שלב 5: הגדרות מצלמה. לשלוט על הבהירות והניגודיות של התמונה שצולמה. שלב 6: הגדרות סף. התאם את ערכי סף לזיהוי עכבר שחור כמו פיקסלים שחורים ברקע לבן בכל תמונה ולשפוט את התנהגות עכבר כמו "הקפאה" או "אי – הקפאה" (ראה פירוט בפרוטוקול 6). כדי לנתח את העכבר לבקן, לחץ על 'המצב הפוך "תיבת הסימון, ולהתאים את ערכי הסף כראוי. שלב 7: Set קייג' שדה. ציין את השדה של כל תא שברצונך ללכוד. לאחר לחיצה על כפתור המלבן בארגז הכלים, צייר מלבן סביב הרצפה של החדר על חלון תמונה בשידור חי. הבא, בחר את מספר התא וללחוץ על הכפתור 'הגדר'. לבסוף, לחץ על כפתור ה 'התמים'. <li> לאחר נקבעות הגדרות הפרמטר, מבחן הכנה צריך להינתן באמצעות עכברים בפועל (עכברים אינם משמשים כנתינים) לפני הבדיקה הראשונה של היום כדי לקבוע אם מערכת ניתוח התמונה ומחוללי רעש / הלם לבנים לעבוד ללא בעיות. הזז כלוב בבית המכיל עכברים בפועל לחדר בדיקות לרעש מחדר ההמתנה הסמוך, ולמקם את כל עכבר בתא האוויר. מייד לאחר להניח את העכברים בחדר, לחץ על לחצן ההתחלה של ImageFZ. תוכנת היישום תציג רמזים שמיעתיים ו / או footshocks החשמלי לעכברים בצו שציינת בקובץ התייחסות. לאחר 480 שניות חלפו, להחזיר את העכברים לכלוב בבית שלהם ולהחזיר את הכלוב למדף בחדר ההמתנה. נקה את התאים בזהירות. לאחר מכן, לחץ על הכפתור "הבא ניתוח", וחזור על שלבי 3.2.4-3.6 לעכברי המבחן. חנויות ImageFZ לחיות ולעקוב אחר תמונות בפורמט TIFF. התכנית מאפשרתלנו לבצע ניתוח מצב לא מקוון כדי לנתח מחדש את התמונות באמצעות ערכי פרמטרים שונה. אם אתה מבצע ניתוח במצב לא מקוון, בחר בתוספת תפריט "מנותק פחד אוויר ופ.צ. 'ובחר את תיקיית הנתונים שברצונך לנתח מחדש. לאחר מכן, קלט ערכי הפרמטרים שוב, ולחצו על כפתור ה 'התמים'. 4. מבחן הקשר לאחר פגישת האוויר הושלמה, העכברים הם חזרו לאותו חדר האוויר וכבש עבור הקפאת התנהגות למדוד פחד מותנה הקשר (מבחן הקשר). מרווח עיכוב בין האוויר ובדיקת ההקשר נקבע בדרך כלל ב24 שעות. בפרוטוקול זה, כדי להעריך את הזיכרון האחרון וזיכרון רחוק (שנמדד על ידי בדיקת יום 1 ויותר מ 28 ימים לאחר מיזוג, בהתאמה) 25, העכברים נבדקו בבדיקת ההקשר כ 24 שעות ו30 ימים לאחר פגישת האוויר. העכברים ממוקמים במנצחitioning קאמרי ומותר לחקור באופן חופשי את החדר ל300 שניות בלי מצגות CS וארה"ב (איור 2 ג). הפעל את תוכנת ImageFZ התכנית ולהגדיר ערכי הפרמטרים של תוכנת היישום באותו אופן כמו באוויר (ראה סעיף 3.2.3), עם זאת, לשנות את משך הזמן של בדיקה זו ל300 שניות ובחר קובץ טקסט התייחסות למבחן ההקשר . לאחר שינוי ההגדרה, מבחן הכנה צריך להינתן באמצעות עכברים בפועל כדי לבדוק את מערכת ImageFZ. מניחים כל עכבר לתוך תא האוויר ולחץ על לחצן ההתחלה. לאחר 300 שניות חלפו, להחזיר את העכברים לכלוב בבית שלהם, ולהשאיר את הכלוב ללא הפרעה עד למבחן הרמז מתחיל. נקה את התאים. לאחר מכן, לחץ על הכפתור "הבא ניתוח", וחזור על השלבים 4.3-4.4 בעכברי המבחן. 5. מבחן רמז מבחן רמז מתבצע באותו היום של מבחן ההקשר או ביום שלמחרת.בבדיקה זו, עכברים ממוקמים לתוך חדר בדיקות אחר עם מאפיינים שונים מאוד, מתן הקשר חדש שאינו קשור לתא האוויר במשך 3 דקות. בסוף 3 דקות הראשונות, האות השמיעתית שמוצגת בזמן האוויר ניתנת לעכברים במשך 3 דקות בסביבת הקשר הרומן. בפרוטוקול זה, מבחן רמז מתבצע כמה שעות לאחר בדיקת ההקשר. עכברים רשאים לחקור את החדר המשולש ל360 שניות. ב3 דקות הראשונות, לא CS ולא בארה"ב מוצג, ולאחר מכן, CS (רעש לבן dB 55) מוצג ל3 דקות האחרונות. הפעל את תוכנת ImageFZ התכנית ולהגדיר את ערכי פרמטרים באותה הצורה כמו באוויר, למעט לשנות את משך הזמן של הבדיקה ל360 שניות ובחר קובץ טקסט התייחסות למבחן הרמז. לאחר התאמת ההגדרה, מבחן הכנה צריך להינתן באמצעות עכברים בפועל כדי לבדוק את מערכת ImageFZ. מניחים כל עכבר לתוך התא המשולש ולחץ על ההתחלהכפתור. לאחר 360 שניות חלפו, להחזיר את העכברים לכלוב בבית שלהם ולהחזיר את הכלוב למדף של חדר ההמתנה. נקה את התאים. לאחר מכן, לחץ על כפתור 'הבא ניתוח "וחזור על שלבים 5.3-5.4 בעכברי המבחן. כדי לבחון עוד יותר זיכרון מרוחק, לחזור על הפרוטוקולים 4-5 על 30 ימים לאחר פגישת האוויר (איור 2 א). 6. ניתוח תמונה לבצע רכישת נתונים וניתוח אוטומטי באמצעות ImageFZ. תוכנת יישום זה מבוססת על תכנית רשות ציבור ImageJ (שפותחה על ידי וויין Rasband במכון הלאומי לבריאות וזמין בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/), שונתה על ידי טסויושי Miyakawa (תוכנת יישום ImageFZ , זמין להורדה בחינם, ראה טבלה של חומרים / חומרים כימיים). לכל הניסויים, ללכוד תמונות בקצב נתון מסגרת (למשל fps 1) עם ImageFZ באמצעות מכשיר USB ללכיד וידאו, ובםמצלמת וידאו. כדי למדוד את המרחק שעבר מהתמונות ברציפות, להתאים את הערך 'דק' סף 'של התכנית (למשל 80 פיקסלים), אשר מוגדרת למגזר התמונות לתוך חלקיקים שחורים (עכבר) ורקע לבן. המרחק נסע מחושב מהמרחק בין כל סט של XY קואורדינטות עבור מרכז כובד של החלקיקים בתמונות רצופות. ערך למדוד את התנהגות הקפאה מהתמונות רצופות, להתאים את 'דק' סף (XOR) 'של התכנית (למשל 160 פיקסלים), אשר מוגדרת למגזר התמונות לתוך חלקיקים שחורים (עכבר) ורקע, ואז לחשב את כמות השטח (פיקסלים) של אזורי nonoverlapping בין החלקיקים של כל זוג של תמונות רצופות. התאם את הערך באמצעות המחוון של כלי הסף עד לחלקיקים השחורים בכל תמונה תואם את הצורה של הגוף כולו של העכבר לא כולל הזנב. אם האזור של nonoverlapping אזור הוא מתחת לערך 'קריטריון הקפאה' (למשל 30 פיקסלים), ההתנהגות נחשבת 'הקפאה' (איור 3), אשר בדרך כלל מוגדר כעדר המוחלט של כל תנועה, פרט לנשימה ופעימות לב. כאשר האזור עולה על ערך זה, ההתנהגות נחשבת 'אינה הקפאה' (איור 3). פסק הדין צריכה להתבצע על בסיס ההגדרה של הקפאה. עכברים לפעמים להפגין תנועה עדינה וחוסר תנועה רגעית, אשר עשוי להיות לא נחשב כהתנהגות הקפאה שמשקפת פחד. חוסר התנועה שנמשכת זמן קצר (לדוגמא, פחות מ -2 שניות), אשר צפוי שונה מהביטוי של פחד, ניתן לשלול מהניתוח על ידי קביעת הסף של הקפאת הזמן. כדי לקבוע את סף הזמן, הקלט 'הקפאת משך – דקות (שניות)' ערך (לדוגמא 2 שניות). התכנית באופן אוטומטי ImageFZ calculאטס המרחק נסע (סנטימטר) ואת האחוז של הקפאה. התוצאות נשמרות בקבצי טקסט, ולחיות ולעקוב אחר תמונות מאוחסנות בפורמט TIFF. כדי למדוד את המרחק שעבר (סנטימטר) כמדד לרגישות footshock חשמלי, תכנית ImageFZ גם רוכשת תמונות בקצב גבוה מסגרת (לדוגמא: 4 תמונות בשניה) במשך 6 שניות, נמדד מ 2 שניות לפני המסירה של footshock 2 שניות עד 2 שניות לאחר footshock במהלך ניתוח באינטרנט. כדי להגדיר את מסגרת הדולר עבור לכידת תמונה לפני, במהלך, ואחרי footshock, תיבת קלט ערך ב'שיעור הלם (מסגרת / שניות) '. לאחר הניתוח באינטרנט, לבצע ניתוח במצב לא מקוון על ידי בחירת תוסף בתפריט 'הלם מנותק פ.צ.' כדי לקבל את הנתונים למרחק. ערכי הפרמטרים של תכנית ImageFZ צריכים להיות מותאמים כדי להפיק תוצאות דומות לאלה שהושגו על ידי משקיפים אנושיים במבחני הכנה. לניקוד ידני, התנהגות ההקפאה היא ברציפות נמדדה באמצעות stopwatcשעות ותכנית אירוע הקלטה או הליך מיידי בזמן דגימה בכל שניות 3-10, במהלך ניתוח באמצעות תוכנת ImageFZ. שני משקיפים בדרך כלל לערוך תצפית התנהגותית. כדי להתאים את ערכי פרמטרים של תכנית ImageFZ כדי להבטיח שהתוצאות של ניתוח התמונה עולות בקנה אחד עם אלה של משקיפים אנושיים, לבצע ניתוח במצב לא מקוון של תכנית ImageFZ, שינוי 'דקות סף (XOR)' וערכים 'קריטריון הקפאה' . כדי לבצע את הניתוח במצב לא מקוון, בחר בתפריט Plug-in 'פ.צ. מנותק' וקלט כל ערכי פרמטרים. 7. פתרון בעיות ניתן להשיג איך תכנית ImageFZ והתקינה? תכנית ImageFZ היא זמינה להורדה בחינם מהאתר שלנו (ראה טבלה של חומרים / חומרים כימיים), והוא פועל על מחשב Windows. הורד את תיקיית ה-zip ImageFZ ולהתקין את התוכנה במחשב שלך. ראה קובץ 'readme.txt "לinstallatiעל פרטים ובצעו את הוראות צעד אחרת הצעד. למה את הודעת השגיאה 'התקן הלכידה הגדרת שגיאה מוצגת? בדוק את החיבור של כבל המצלמה והתקנת מנהל ההתקן שלך להתקן הלכידה תמונת ה-USB. אם אין שום בעיה עם ההגדרות, ולאחר מכן תוכנת ImageFZ לא יכולה לעבוד עם ההתקן הלכידה התמונה שלך. ראה קובץ 'readme.txt' בנוגע למכשיר המתאים לשימוש עם תוכנת ImageFZ. ImageFZ לא יכול לזהות את כל הגוף של העכבר כחלקיקים. הגדר את הערך של 'דק' סף 'ו / או' דק 'סף (XOR)' נמוך מהשווי הנוכחי. אם ImageFZ לא יכול לזהות את העכבר במקום מסוים, למשל בפינה של חדר בדיקה, ולאחר מכן תנאי בדיקה מספיקים, כמו רצפה מוארת באופן אחיד או הבדל מעט מנוגד בין העכבר והרקע, עשויים להתקיים. כדי לפתור בעיה זו, להתאים את ערכי פרמטרים (לדוגמא </eמ '> בהירות והניגודיות של תמונה ואת ערכי סף חיים) של ImageFZ, לשלוט על המספר והמיקום של אורות, או להשתמש ברקע לבן לעכבר שחור. לכידת תמונה בקצב פריימים גבוה מאטה את המחשב במהלך ניתוח באינטרנט. הגדר את מסגרת הדולר לערך נמוך מהשיעור הנוכחי, ולבצע ניתוח באינטרנט. ניתוח ImageFZ, באמצעות רכישת תמונה בfps 1, מספיק למדידה מדויקת של הקפאה, כמוצג בסעיף תוצאות הנציג. תוצאות ניתוח ImageFZ לא מסכימים עם אלה של ניקוד אנושי. לבחון את התמונה המאוחסנת וקבצי תוצאת פסק דין. אם ImageFZ מגזים בהערכה מקפיא, להגדיר את 'קריטריון ההקפאה' לשווי נמוך יותר מהשווי הנוכחי, ולבצע ניתוח במצב לא מקוון. אם ImageFZ ממעיט הקפאה, הגדר את 'קריטריון ההקפאה' לשווי גבוה מהשווי הנוכחי. בoptogenetical ובדואר אלקטרו vivoxperiments, כבל הסיב המחובר לראשו של העכבר מפריע לכושר השיפוט של הקפאה. מעיל הכבלים בלבן לעכבר שחור, ולשנות את המיקום וזווית של המצלמה עד שהכבלים אינם מזוהים. מה שדרוש לניתוח המצב לא המקוון? צור תיקייה בשם "Image_FZ 'בספריית השורש של תכנית ImageFZ. בתיקייה זו, ליצור "תמונות" תיקיות משנה ו 'מושבים'. להעביר תמונה בגוונים אפורים 8 סיביות לתיקייה 'תמונות', וליצור קובץ טקסט שבו את שם קובץ תמונה שכתוב בתיקייה' מושבי '. לאחר מכן, הפעל את הניתוח במצב לא מקוון ImageFZ, ובצע את ההוראות של התכנית.
Representative Results
בבדיקת מיזוג פחד, הנסיינים אנושיים משמשים לכמת את התנהגות ההקפאה באמצעות תצפית ישירה עתירת עבודת 26-29, אבל מערכות מדידה לאחרונה מבוסס photobeam מחשב (לדוגמא: מערכת "הקפא צג ') ודימוי ניתוח היו בשימוש באופן אוטומטי למדוד את התנהגות 26,30-32 ההקפאה. ImageFZ היא מערכת דימוי ניתוח אוטומטי, אשר מפיקה תוצאות דומות לאלה שהושגו באמצעות תצפית אנושית, כפי שיתואר להלן. הנה, אנחנו השווינו את התוצאות של התבוננות אנושית עם אלה של ניתוח ImageFZ תחת פרמטרים שונים: 'שיעור (מסגרת / sec)' ו 'הקפאת קריטריון (פיקסלים).' בניסוי זה, חמישה עכברי זכרי C57BL/6J (משקל גוף ממוצע ± SD (ז), 31.4 ± 3.55; מתכוונים גודל גוף ± SD (פיקסלים), 351.6 ± 62.2) שימשו ב15-27 שבועות של גיל. התצפית האנושית נעשתה באמצעות תכנית אירוע הקלטה (תוכנת מקינטוש OS9); אירוע מרכזי-לחיצה שימשיךד במשך 2 שניות או יותר, כאשר עכבר מוצג התקף של אין תנועה נחשב 'הקפאה'. האחוז של הקפאה חושבה כל 60 שניות בכל בדיקה ומשמש למתאם ניתוחים. אחוזים של הקפאה, נכבש על ידי 2 המשקיפים (אמינות interobserver, לאוויר, r = .879; לבדיקת קשר, r = 0.957; למבחן רמז, r = 0.866, בכל המקרים, r = 0.888) היה בממוצע ליצירה אנושי להבקיע. מתאמים בין אחוזי ההקפאה נמדדו באמצעות ImageFZ עם כל מסגרת הדולר (כלומר 1, 2, ו -4 תמונות בשניה) ואלה שהושגו באמצעות תצפיות אדם נבחנו. כפי שמודגם באיור 4, אחוזי ההקפאה מחושבים באמצעות ImageFZ (1, 2, ו -4 תמונות בשניה) היו בקורלציה גבוהה עם הערך הממוצע המתקבל מהמדידות של 2 משקיפים. יש לציין, לכידת תמונות בקצב פריימים גבוהים יותר לא תמיד מייצרת את המתאם הטוב ביותר. ניתוח תמונה ב1 תוצאות fps שנוצר דומות לאלו שהתקבלו ממשקיפי אדם בדוארמבחן אח. מתאמים בין אחוזי ההקפאה נמדדים באמצעות תצפיות אנושיות ושימוש ImageFZ תחת כל מצב של 'הקריטריון מקפיא (פיקסלים)' (כלומר 20, 30, ו40 פיקסלים) נבדקו. אחוזי ההקפאה מחושבים באמצעות ImageFZ ב'הקריטריון מקפיא (פיקסלים) '30, 20, ו40 פיקסלים היו, בכל המקרים, מתואמים מאוד עם אלו שהושגו באמצעות תצפיות אנושיות (איור 5). כפי שניתן לראות באיור 5D, כאשר קריטריון ההקפאה מוגדר ערך נמוך, התנועה העדינה של עכבר, נחשב 'מקפיא' על ידי משקיפים אנושיים, ייחשב "שאינו מקפיא" באמצעות ImageFZ. לעומת זאת, אם הקריטריון מוגדר ערך גבוה, התנועה של עכבר, הבקיע 'בלתי שהקפאה "על ידי משקיפים אנושיים, ייחשב' הקפאה 'באמצעות ImageFZ (5 ג דמויות, 5F, ו5I). לכן, כדי להשיג את התוצאות הכי אמינות, כל פרמטר של תכנית ImageFZ יש לכייל אותנוing נתונים הבקיע דרך תצפיות אדם בכל סביבת בדיקות. בנוסף, השווינו את התוצאות שנוצרו על ידי צופה אנושי, תוך שימוש במערכת מבוסס photobeam מדידת מחשב (מערכת ההקפאה Monitor), לאלה שהושגו באמצעות ImageFZ (ראה איור 6). הצופה האנושי היה עיוור לקבוצת הטיפול ואת תוצאות ניקוד ImageFZ. להגדרות הפרמטר של מערכת הקפאת הצג, השתמשנו 3 מדדים של אחוז של הקפאה ממערכת תוקף בעבר 30. בקצרה, מספר מרווחי 10-sec בי החיות הנדרשות שניות יותר מ 1 או 2 לחצות את הקרן החדשה הראשונה של המרווח (10sec 1sec ו10sec 2sec, בהתאמה) וההשהיה בין תחילת כל מרווח 5 שניות ו ההפרעה הקרן החדשה השלישית בתוך פרק זמן זה (Latency3) נמדדה. אחוזי המרווחים שבמהלכו העכבר היה הקפאה או אחוז מהסכום הכולל של r הזמןequired לשבור photobeam השלישית חושבה. האחוזים של הקפאה נמדדים בכל מערכת הם באיור 6. הקבוצות הושוו באמצעות דו סטרי צעדים חוזרים ונשנים ANOVA ואחרי מבחני t (ראה טבלה 1). אחוזי ההקפאה נמדדו באמצעות ImageFZ (איור 6) היו יותר דומים לאלה הבקיע באמצעות תצפית אנושית (איור 6 א) מהנתונים המתקבלים באמצעות מערכת מבוססת photobeam (איורים 6C-E). אחוזי ההקפאה נמדדו באמצעות תכנית ImageFZ בכל בדיקה היו בקורלציה גבוהה עם אלה הבקיע באמצעות תצפית אנושית (אוויר, r = 0.947; מבחן הקשר, r = 0.970; מבחן רמז, r = 0.934), ואילו המתאמים בין אחוזי ההקפאה נמדדו באמצעות המערכת מבוססת photobeam מדידת מחשב (10sec 1sec, 10sec 2sec, או Latency3) והצופה האנושי היו נמוך (אוויר, r = .503, 0.593, ו.761; לא הקשרest, r = 0.772, 0.819, ו0.912) בהשוואה למתאמים בין אחוזי ההקפאה נמדדו באמצעות ImageFZ והתבוננות אנושית (7 א דמויות ו7 ב). בנוסף, איור 7 מגלה כי ההבדלים בין אחוזי ההקפאה הושגו באמצעות תצפית אנושית ושימוש ImageFZ בכל עכבר היו ההבדלים הקטנים ביותר. תוצאות אלו מצביעות על כך שאחוזי ההקפאה נמדדו באמצעות ImageFZ היו דומים לאלה שהושגו באמצעות תצפית אנושית וImageFZ כי הוא מדויק מאוד כאשר מודדים את הכמות של הקפאה. איור 1. מכשירי הקשר ורמז מבחן אוויר פחד. () תא אקריליק מרובע לבדיקת האוויר והקשר, ( <strאונג> B) רשתות מתכת על רצפת פלסטיק לבנה לעכברים שחורים, agouti, או לדלל חום (למעלה) ורשתות מתכת שחורה electrifiable על רצפת פלסטיק שחורה לעכברים לבנים (תחתון); תמונות מוגדלות של הרשתות מוצגות בצד הימין פנל, (C) מחולל רעש / טון לבן ומחולל הלם, חדר אטום לרעש (ד '), וכן (ה) קאמרי משולש אקריליק עם רצפה שטוחה למבחן הרמז. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 2. , ג סקירת ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. () של הקשר ורמז מבחן אוויר מיזוג פחד (ב), (ג)מבחן ontext, ו( ד ') רמז בדיקה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 3. ניתוח תמונה על ידי תוכנת ImageFZ התכנית. לכל זוג של תמונות רצופות, בסך של אזור (פיקסלים) שדרכו העביר את העכבר מחושב על ידי ImageFZ. כאשר אזור זה הוא מתחת לסף מסוים (לדוגמא 30 פיקסלים), ההתנהגות נשפטת להיות 'הקפאה'. כאשר כמות השטח שווה או עולה על הסף, ההתנהגות נחשבת 'אינה הקפאה'. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 4. השוואות של אחוזי ההקפאה מחושבים מתמונות במסגרת שיעורים שונים באמצעות ImageFZ עם אלה שנמדדו באמצעות תצפית אנושית. בדיקות אוויר הפחד נערכו באמצעות עכברי C57BL/6J גברים (n = 5). במהלך הבדיקות, שני משקיפים הבקיעו את התנהגות ההקפאה. במקביל, תמונות חיות נתפסו ב4 תמונות בשניה באמצעות תכנית ImageFZ. הקבצים שנתפסו בשעה 4 fps היו צמצומים לאחר חילוץ המסגרות למתאימות לתמונות שנתפסו ב1 fps או 2 תמונות בשניה. ערכי הפרמטרים של 'דרג (פריים / שניות)' נקבעו ל -1, 2 או 4 תמונות בשניה, ואחוזי הקפאה בכל 60-sec בן חושבו מתוך קבצי תמונה באמצעות ניתוח מחובר ImageFZ. כל נקודה מייצגת אחוז הקפאה של כל סל 60-sec. מקדמי המתאם של פירסון בין הנתונים המתקבלים מתצפית אנושית וניתוח ImageFZ חושבו.לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 5. אחוזי ההקפאה מחושבים מהתמונות בערכי קריטריון הקפאה שונות באמצעות ImageFZ ואלה שנמדדו באמצעות תצפיות אנושיות הושוו. בדיקות אוויר הפחד נערכו באמצעות עכברי C57BL/6J גברים (n = 5). במהלך הבדיקות, שני משקיפים הקליטו את התנהגות ההקפאה, ותמונות חיות נתפסו באמצעות תכנית ImageFZ. אחוזי ההקפאה בכל סל שניות 60 חושבו מתוך התמונות (מסגרת 1 / sec) באמצעות ניתוח מחובר ImageFZ, הגדרת ערכי פרמטרים של 'קריטריון מקפיא (פיקסלים)' ל20, 30, או 40 פיקסלים. כל נקודה מייצגת אחוז הקפאה של כל סל 60-sec. שיתוף המתאם של פירסוןefficients בין הנתונים המתקבלים מתצפית אנושית וניתוח ImageFZ חושבו בכל בדיקה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 6. האחוזים של הקפאה נמדדו באמצעות מערכות אוטומטיות והתבוננות אנושית בקבוצות הבלתי מותנית ומותנות של עכברי C57BL/6J זכר (n = 5, כל קבוצה). ImageFZ () תצפית אדם, (ב), (ג) הקפאת מערכת Monitor 1 (10sec 1sec), (ד ') להקפיא מערכת צג 2 (10sec 2sec), וכן (ה) להקפיא מערכת Monitor 3 (Latency3). השוואות קבוצה בוצעו באמצעות מדידות החוזרות אנובה דו כיוונית ואחרי מבחני t (שאינו מתיישב זוקבוצת nditioned קבוצה מול מזגן, *, P <0.05; †, p <0.01). הנתונים המתקבלים באמצעות ImageFZ היו דומה לאלה הבקיע באמצעות תצפית אנושית. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 7. מתאם וחלוקת תדר של ההבדלים בין אחוזי ההקפאה, נמדדו באמצעות מערכות אוטומטיות והתבוננות אנושית. (AB) מגרשי פיזור ומקדמי המתאם של פירסון בין אחוזי הקפאת הבקיע באמצעות מערכות אוטומטיות והתבוננות אנושית מוצגים. אחוזי ההקפאה, מחושבים באמצעות ImageFZ, היו בקורלציה גבוהה עם אלו המתקבלות באמצעות תצפית אנושית. מופעים (CF) של פחות מ dif 10%פרנץ בין אחוזי ההקפאה המתקבלים ממערכות אוטומטיות לעומת תצפית אנושית היו הגבוה ביותר כאשר הנתונים נותחו באמצעות ImageFZ הושווה לאלה נותחו באמצעות תצפית אנושית. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. ANOVAs מצב זמן מצב x זמן יום 1 (אוויר) אנושי F (1,8) = 28.53, p = 0.0007 F (7,56) = 20.79, p <0.0001 F (7,56) = 16.58, p <0.0001 ImageFZ F (1,8) = 13.97, p = 0.0057 F (7,56) = 21.40, p <0.0001 F (7,56) = 11.69, p <0.0001 הקפאת צג (1sec10sec) F (1,8) = 5.16, p = .0528 F (7,56) = 2.39, p = .0329 F (7,56) = 0.72, p = .6572 הקפאת צג (2sec10sec) F (1,8) = 4.07, p = .0782 F (7,56) = 3.44, p = 0.0039 F (7,56) = 1.52, p = 0.1803 הקפאת צג (Latency3) F (1,8) = 4.44, p = 0.0682 F (7,56) = 9.94, p <0.0001 F (7,56) = 4.33, p = 0.0007 יום 2 (הקשר) אנושי F (1,8) = 42.94, p = 0.0002 F (4,32) = 1.91, p = 0.1336 F (4,32) = 1.48, p = .2302 ImageFZ F (1,8) = 49.61, p = 0.0001 F (4,32) = 2.06, p = 0.1087 F (4,32) = 0.83, p = .5174 הקפאת צג (1sec10sec) F (1,8) = 20.28, p = 0.002 F (4,32) = 1.63, p = 0.1918 F (4,32) = 0.55, p = .6997 הקפאת צג (2sec10sec) F (1,8) = 40.20, p = 0.0002 F (4,32) = 2.66, p = 0.0504 F (4,32) = 1.20, p = 0.3306 הקפאת צג (Latency3) F (1,8) = 35.30, p = 0.0003 F (4,32) = 2.49, p = 0.0626 F (4,32) = 1.09, p = .3793 טבלת 1. השוואות של נתונים סטטיסטיים.
Discussion
בדיקת אוויר הפחד הקונטקסטואלית ורמז היא אחד מפרדיגמות הנפוצות ביותר להערכת למידה וזיכרון. בדיקה זו היא סוג של אוויר הפבלובית שבעמותה מורכבת בין הקשר ו / או גירוי מותנה (רמז שמיעתי) וגירוי מרתיע (footshock החשמלי). אחרי שאפילו זיווג אחד של ההקשר / קיו וfootshock השמיעתיים, עכברי תערוכת הקפאה ארוכה טווח כאשר הוא מתמודד גם עם הקשר או הרמז. במבחן זה, התנהגות הקפאה משמשת כמדד לזכרון פחד. מחקרים פרמקולוגיים ונגע גילו כי היווצרות זיכרון, איחוד, ואחזור מוסדרים על ידי מספר אזורים במוח, כגון האמיגדלה, ההיפוקמפוס, וקליפת מוח הקדם חזיתית 3,33-35. בנוסף, מחקרי גנטיקה מולקולריים הדגימו את התפקיד של גנים ומולקולות מעורבות בלמידה ובזיכרון באזורי המוח אלה באמצעות עכברים מהונדסים גנטי 36 ספציפיים. לכן, המבחן הזה הוא simplדואר ושימושי לחקר למידת הבסיס הנוירוביולוגי בסיסית פחד וזיכרון. במאמר את הסרט הזה, הצגנו הפרוטוקול שלנו כדי לספק הנסיינים עם מידע מפורט כדי להבין ובקלות לבצע את הבדיקה.
התנהגות הקפאה הייתה לכמת באמצעות תצפית ישירה על ידי הנסיינים אנושיים. הנסיין מאומן היטב צפוי להניב תוצאות אמינות, יציבה על פני תצפיות. עם זאת, שיטה זו כרוכה בבעיות פוטנציאליות, כגון הבדלים בשיטת התצפית, הטיות הצופה, וטעויות כימות פשוטות, ולכן קשה להשוות ישירות תוצאות מהנסיינים עצמאיים ומעבדות שונות. מערכת מדידת מחשב מבוסס photobeam אוטומטית שימשה גם 26,30-32. עם זאת, מערכת זו מציגה גם בעיות פוטנציאליות במדידת התנהגויות הקפאה. בגלל הסדר החיישן, מערכת זו עשויה להיות מסוגלת לזהות תנועות ראש קטנות שהייתי typically להיות הבקיע כ 'פעיל' באמצעות תצפית אנושית. בנוסף, רועד במהלך ההקפאה עשוי להיחשב כnonfreezing כי כאשר קופא בעלי חיים, הפרעות לסירוגין בphotobeam הם נצפו כתוצאה מרעידה. כשיטת חלופית, מערכות אוטומטיות דימוי ווידאו ניתוח פותחו 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 תיארו כמה מערכות עם תוכנת ניתוח תמונת תוכניות שיש לי תוקף טוב ולהבקיע הקפאה גם 17,20,37-38. עם זאת, רוב המערכות האלה ותוכניות ניתוח צריך לקבל מהספקים מסחריים והם בדרך כלל יקרים. אנחנו פיתחנו את תוכנת ImageFZ התכנית לניתוח התנהגות הקפאה, ותכנית זו מופצת כתוכנה חופשית תכנית. ImageFZ מזהה את העכבר כגוף של פיקסלים (חלקיקים) ומפלה תנועת עכבר עדינה כמו "הקפאה" או "אי – הקפאה 'בהתאם לכמות שלשטח של אזורי nonoverlapping בין החלקיקים של כל זוג של תמונות רצופות. כפי שניתן לראות בתוצאות הנציג, מדידות באמצעות תכנית ImageFZ עולות בקנה אחד עם או יותר מדויקות שהושג תוך שימוש בשיטות אחרות. לפיכך, תכנית ImageFZ באופן אוטומטי מודדת את ההתנהגות שמשקיפי אדם לשפוט כהקפאה תוך שימוש בקריטריונים מוגדרים. בנוסף, תכנית ImageFZ מחשבת את המרחק שעבר (סנטימטר) לפני, במהלך, ואחרי חשיפת footshock, לאפשר בחינה של רגישות ההלם והניתוח של ההתנהגות מנקודת הקיפאון.
הבדלים מתודולוגיים קיימים בין מעבדות. הבדלים אלה עשויים לגרום לקושי בהשוואת הנתונים בין מעבדות ובמשכפלים את התוצאות במעבדות שונות. כדי לקבל נתונים יציבים יותר ודומים, יש צורך לתקנן את פרוטוקול הבדיקה ככל האפשר. מערכת הניתוח עם ImageFZ מובילה לאוטומציה של נהלי בדיקה, אשר יכול לתרום לסטנדרטיזציה של פרוטוקולים המשמשת בכל מעבדות.
כמה תגובות התנהגותיות יש לקחת בחשבון בעת ניתוח התנהגות הקפאה. ראשית, כאשר בעלי חיים להתמודד עם מצב מפחיד, הם עלולים לברוח במקום הקפאת 39. בריחה היא אחת תגובות הפחד, והמופע שלה יוביל ללהמעיט זיכרון פחד. שנית, הקפאה עשויה להיות תלויה ברמה פעילות כללית, ורמת הפעילות בעכברי ניסוי ושליטה צריכה להיבחן. לדוגמא, אם כי עכברים שחסרו את הקולטן אצטילכולין מוסקריניים M1 הראו רמות נמוכות של הקפאה בהשוואה לעכברי wild-type, בדיקות התנהגותיות שונות הצביעו על כך שהתוצאות ניתן לייחס לפנוטיפ היפראקטיביות שלהם במקום הפגיעה בזכרונם 18. ImageFZ מחשב את המרחק (סנטימטר) נסע בנושאים. הנתונים זמינים כדי לבחון אם קיימים הבדלים ברמות הפעילות הכלליות בין נושאים. אם יש הבדל בקבוצההמרחק שעבר, גישה אפשרית אחד לבעיה היא לקחת בחשבון את המרחק שעבר במהלך 2 דקות הראשונות של אימון כפעילות הבסיסית ולהשתמש יחס דיכוי (יחס דיכוי = (פעילות במהלך בדיקה) / (פעילות במהלך בסיסי + פעילות במהלך בדיקות)) כמדד המשני של פחד 17,40. לבסוף, הבדל ברגישות לכאב, גרימת השינויים בתגובתיות לfootshock חשמלי, אם בכלל, עלול לגרום לשינויים בהתנהגות הקפאה. ImageFZ גם מחשב את המרחק שעבר (סנטימטר) בפירוט מ2 שניות לפני חשיפה של footshock 2 שניות עד 2 שניות לאחר חשיפתה (עבור 6 שניות), שיכול לשמש כמדד של רגישות footshock.
מערכות וידאו ניתוח פותחו כדי למדוד את התנהגות הקפאת בקן, שחור, agouti, ולדלל עכברים חומים. ImageFZ משתמש מגש רצפה שחור ורשתות שחורות לבחון עכברים לבנים (ראה איור 1). הרשתות השחורות עשויות מspeci ברית עיבוד מתכות בצבע שחור מצופה ויש מוליכות חשמלית דומות לזה של רשתות מתכת noncoated, שמשמשים בדרך כלל לעכברים שחורים. ImageFZ גם מנתח את התנהגות ההקפאה בחולדות ומכרסמים אחרים באמצעות התאמות של הפרמטרים התכנית. בגרסה הנוכחית של ImageFZ, ההתנהגות של הנושא מתועד באמצעות מצלמת וידאו מהקיר העליון לנתח מנקודת הקיפאון. ImageFZ יכול לשמש גם בהגדרה שבו התמונות שנתפסו מהצד השני של החדר. בנוסף, ImageFZ שולט מרבי של 4 מנגנונים. תכונה זו מאפשרת לחוקר לבחון בו זמנית 4 עכברים, חיסכון בזמן וצמצום ההשפעות הפוטנציאליות מהבדלים בזמן ביצוע של כל נושא ואת סדר בדיקות על התנהגות. לפיכך, ImageFZ מפשט את הליך הבדיקה וניתוח של התנהגות הקפאה, ותכנית זו מאפשרת בדיקה עם פחות עבודה וללא הכשרה בשום צורה לניסויים התנהגותיים.
e_content "> במעבדה Miyakawa, יש לנו להעריך יותר מ 110 זנים של עכברים מהונדסים גנטי ועכברי שליטת wild-type בבדיקת אוויר הפחד הקונטקסטואלית ורמז באמצעות מערכת ניתוח וידאו על מנת להבהיר את ההשפעות של גן מסוים על למידה וזיכרון 41-42 יש לנו להשיג סט גדול של נתונים גולמיים ליותר מ -5,000 עכברי נתונים הגולמיים ששימש למאמרי מחקר שפורסמו 4-16 כלולים ב 'מסד העכבר הפנוטיפ' כמאגר מידע ציבורי (כתובת אתר:.. Http: / / Www.mouse-phenotype.org/). מאמר הסרט הנוכחי מספק מידע מפורט בנוגע לפרטים של ההליך ניסיוני שלנו ומקדם את ההבנה של מצב הבדיקה.Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חלק מהנתונים המוצגים כאן התקבלו במעבדתו של ד"ר ז'קלין נ קרולי במכון האמריקאי הלאומי לבריאות נפש ואנחנו רוצים להודות לה על שאפשרתם לנו להציג את הנתונים בעיתון. אנו מודים גם קזואו נאקאנישי על עזרתו בפיתוח תכנית ImageFZ לניתוח התנהגות. מחקר זה נתמך על ידי גרנט-in-Aid למחקר מדעי (ב) (21,300,121), גרנט-in-Aid למחקר מדעי על תחומי חדשניים (מדע רשת מקיפה מוח) ממשרד החינוך, מדע, תרבות וספורט של יפן , להעניק ממרכז Neuroinformatics יפן (NIJC), ומענקים מCREST של יפן מדע וטכנולוגית סוכנות (JST).
Materials
| ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
| Conditioning chamber | O'Hara & co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
| Cued test chamber | O'Hara & co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
| Interface | O'Hara & co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
| Scrambled shock generator | O'Hara & co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
| Shock grid tester (ammeter) | O'Hara & co., Japan | SG-T | |
| USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
| Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
| Soundproof room | O'Hara & co., Japan | CL-4210 | |
| Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |
Riferimenti
- Crawley, J. N. . What’s wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , (2007).
- Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
- Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
- Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
- Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
- Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
- Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
- Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
- Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
- Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
- Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
- Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
- Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
- Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
- Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
- Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
- Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
- Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
- Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
- Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
- Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
- Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
- Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
- Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).
Citazione di questo articolo
Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. J. Vis. Exp. (85), e50871, doi:10.3791/50871 (2014).