Contextuele en cued Fear Conditioning Test Met behulp van een video analysesysteem in Muizen

Alle van de experimenten moeten worden uitgevoerd volgens de richtlijnen en protocollen vastgesteld door de lokale Animal Care en gebruik comites. 1. Apparaat instellen De inrichting voor het conditioneren en context-test is een vierkante kamer met een electrifiable roostervloer, een geluidsbron, en een gekalibreerd schok generator. Verschillende kamer maten worden gebruikt, met afmetingen variërend van 54 cm x 27 cm x 30 cm 21 tot 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. In dit protocol, het apparaat bestaat uit een acryl vierkante kamer (33 cm x 25 cm x 28 cm, transparant in het voor-en achterwanden, wit in de zijwanden) met metalen roosters (0,2 cm diameter, een afstand van 0,5 cm van elkaar) gedekt een transparant acryl deksel (Figuur 1A). Het is noodzakelijk om de kamer te plaatsen op een wit acryl vloer (Figuur 1B) om het gedrag van zwart, agouti, of verdunde bruine muizen geanalyseerd, omdat een beeld analysesysteem met de ImageFZ software (gratis te downloaden, zie tabel van materialen / reagentia) onderscheidt een donker onderwerp van een witte achtergrond in elk beeld opgenomen video. Albino muizen kunnen ook getest met zwarte metalen roosters en een zwarte acrylaat vloer (Figuur 1B). Light-emitting diode (LED) lampjes aan het plafond boven het apparaat is aangesloten. De roostervloer is verlicht met 100 lux door de LED-verlichting. Een luidspreker verbonden met een witte ruis / toongenerator (figuur 1C) gemonteerd op een plafond 5 cm boven het deksel een auditieve cue (witte ruis, 55 dB) presenteren als een geconditioneerde stimulus (CS). De roosters zijn aangesloten op een schok generator (figuur 1C) om een elektrische footshock leveren zoals de ongeconditioneerde stimulus (US). De testkamer wordt geplaatst in een geluiddichte ruimte (170 cm x 210 cm x 200 cm) (figuur 1D) om externe ruis tijdens de tests te beperken. Deze voorwaarde voorkomt ook de muizen die momenteel niet worden onderworpen aan eentesten van het horen van een auditieve cue of de vocalisatie van de test muizen. De inrichting voor het gecuede proef bestaat uit een kamer die verschillende eigenschappen uit de bovengenoemde kamer heeft, die een nieuwe context. Het is noodzakelijk om de zintuiglijke signalen veranderen zoveel mogelijk, zodat de muis waarneemt roman context als los van de conditioneringskamer. In het algemeen wordt een anders gevormde doos of een driehoekige kamer gebruikt. Daarnaast worden verschillende verlichting en / of olfactorische signalen ook voorzien aan de muis. In dit protocol is het apparaat een acryl driehoekige kamer (33 cm x 29 cm x 32 cm; wit in elke zijwand) met een platte, witte vloer voor zwart, agouti, of verdunde bruine muizen of een platte, zwarte vloer voor albino muizen, bedekt met een transparant acryl deksel (figuur 1E). LED-lampen worden aan het plafond boven het apparaat is aangesloten. De lichtsterkte van de vloer is 30 lux. Een luidspreker aan het plafond 5 cm boven het deksel gemonteerd prESENT een auditieve cue die dezelfde is als die bij de conditionering die aan de muizen. De driehoekige kamer is gelegen in een andere geluiddichte ruimte van de kamer waarin de conditionering en context-test worden uitgevoerd. Elke kamer is uitgerust met een plafond gemonteerde Charge Coupled Device (CCD) camera aansluit op een Windows-computer via quad video splitter en USB beeldvastleginrichting om het gedrag van de muis te controleren, en beelden van de apparatuur en de muis worden opgevangen en geanalyseerd door de applicatiesoftware programma ImageFZ (zie Protocol nr. 6). De witte ruis en footshock generatoren worden automatisch geregeld door het ImageFZ softwareprogramma, de starttijd en de duur van de witte ruis en footshock moet worden geschreven in een tekstbestand (zie een voorbeeld tekstbestand 'eenvoudig-cond' getoond in de video voor de informatie over de parameters worden geschreven in het bestand), die wordt gelezen in de applicatie. Vóór elke test begint, de acryl wandenen vloeren worden afgeveegd met een handdoek gedrenkt in super hypochloorzuur water (pH 6-7), en de roosters worden schoongemaakt met 70% ethanol om een ​​voorspanning op basis olfactorische signalen voorkomen. De roosters worden afgeveegd met ethanol in plaats van super hypochloorzuur water zodat de roosters niet hun elektrische geleidbaarheid verminderen door roest. 2. Bereiding van dieren Over het algemeen zijn 2-4 muizen gehuisvest per kooi in een temperatuurgecontroleerde dierenverblijf (23 ± 2 ° C) met een 12 uur licht / donker-cyclus (bv. lichten aan om 07:00). In dit protocol mogelijke invloeden kooi transport verminderen gedrag en de muizen aan de experimentele omgeving, worden de kooien met de muizen overgedragen van het dierenverblijf in een geluiddichte wachtkamer naast een geluiddichte testkamer tenminste 30 minuten voor elke test begint. Alle experimenten (Figuur 2A) moeten in het s worden uitgevoerdame periode in de lichte of donkere fase elke dag naar de gedrags-varianten geproduceerd door het testen op verschillende tijdstippen 23,24 minimaliseren. In dit protocol alle experimenten worden uitgevoerd tussen 1 uur na het begin van de lichtperiode en 1 uur voor het begin van de donkere fase (8:00-18:00 in de lichte fase). Als er slechts een apparaat beschikbaar is, moet muizen van elk genotype worden getest in een vorkheftruck om de potentiële effecten van de experimentele tijd en de testen te onderwerpen op gedrags-prestaties verminderen. ImageFZ kan maximaal 4 apparaten bedienen. Testen 4 muizen tegelijk met behulp van 4 apparaten in een gecompenseerd orde stelt de onderzoeker om tijd te besparen en vermindert de mogelijke effecten van de experimentele parameters op muisgedrag. 3. Conditioning Muizen worden geplaatst in de conditioneringskamer, en de muizen zijn meestal toegestaan ​​om de ruimte vrij te verkennen voor 120 sec. Daarna worden de auditory cue, zoals een witte ruis, toon, en auditieve clicker, wordt gepresenteerd als een CS voor 30 sec, en een 0,1-0,8 mA footshock wordt gegeven aan de muizen als de VS tijdens de laatste 2 seconden van het geluid. De presentatie van de CS-US paring wordt herhaald om de vereniging te versterken. De muizen worden achtergelaten in de kamer voor een bepaalde tijd na de laatste presentatie aan de associatie tussen de context van de kamer en de aversieve ervaring verder te vestigen. In dit protocol, na 120 sec van vrije exploratie, een auditieve cue (witte ruis, 55 dB) wordt aangeboden voor 30 sec, en een 0,3 mA footshock wordt tijdens de laatste 2 seconden van de witte ruis continu geleverd. Na 90 sec, is de koppeling van de auditieve cue met de footshock die aan de proefpersonen weer. De presentatie van de CS-US herhaalt drie keer per sessie (120, 240, en 360 seconden na het begin van de conditionering) (Figuur 2B). Na de laatste footshock worden de muizen ongestoord gelaten in de kamers voor 90 sec. Vóór de conditionering sessie begint, lopen de ImageFZ applicatie software, selecteert u de plug-in menu 'FZ Conditioning en FZ Online (4 kamer)', en stel de parameter waarden stap-voor-stap als volgt. Stap 1: Project-ID. Geef een map waar u uw gegevens op te slaan. Stap 2: Sessienaam. Typ de woorden, zoals de experimentele datum, in de 'Session' in en selecteer een verwijzing tekstbestand waarin de starttijd en de duur van de witte ruis en footshock zijn geschreven, in de 'Reference' doos. Een voorbeeld tekstbestand in beeld. Stap 3: parameterinstellingen. Voer parameterwaarden in elk vak als volgt. Rate (beeld / sec): frame rate van het beeld acquisitie, bijv. 1 beeld / sec. Duur (sec): in het geval van conditionering, de totale duur van 480 sec. Bin duur (sec): bv 60 sec, de gegevens worden geanalyseerd in elk blok60 sec. Onderwerp formaat – min (pixels): ImageFZ een muis en lawaai als zwarte deeltjes (enkele massa van pixels) op een witte achtergrond in elk beeld detecteert. Wanneer het gebied van de zwarte deeltjes (pixels) kleiner is dan de 'Subject grootte – min (pixels) "waarde (bijvoorbeeld 100 pixels), de deeltjes worden beschouwd als ruis en worden uitgesloten van de beeldanalyse. Onderwerp formaat – max (pixels): wanneer de grootte van de zwarte deeltjes zijn meer dan de grootte van de 'Subject grootte – max (pixels) "waarde, de deeltjes zijn uitgesloten van de analyse. Framemaat – breedte / hoogte (cm): kamer dimensie, dwz 33 cm breed en 25 cm hoog. Invriezen criterium (pixels): bv 30 pixels, zie de details in protocol 6. Invriezen duur – min (sec): bijv. 2 sec, als er geen muis beweging wordt waargenomen voor slechts minder dan 2 seconden, wordt het gedrag niet als 'bevriezen';. Shock-tarief (beeld / sec): zie de details in protocol 6. Stap 4: Onderwerp ID. Voer het onderwerp identificatie. Stap 5: Camera-instellingen. Controle van de helderheid en het contrast van het vastgelegde beeld. Stap 6: Threshold Settings. Pas de drempelwaarden een zwarte muis detecteren als zwarte pixels in een witte achtergrond in elk beeld en muisgedrag oordelen als 'freezing' of 'non-freezing' (zie de details in Protocol nr. 6). Om een ​​albino muis analyseren, klikt u op het selectievakje 'omkeren mode', en de drempelwaarden juiste wijze aan te passen. Stap 7: Stel Cage Field. Geef het gebied van elke kamer die u wilt vastleggen. Na het klikken op de rechthoek knop in de toolbox, trek een rechthoek om de vloer van de kamer op het live-beeld venster. Selecteer vervolgens de kamer in en klik op de knop 'Instellen'. Klik ten slotte op de knop 'Compleet'. <li> Nadat de parameters zijn ingesteld, moet een voorbereidend onderzoek worden gegeven met behulp van de praktijk muizen (muizen niet gebruikt als proefpersonen) voor de eerste test van de dag om te bepalen of het beeld analysesysteem en witte ruis / shock generatoren werken zonder problemen. Verplaats een kooi met daarin de praktijk muizen om de geluidsdichte testkamer van de aangrenzende wachtkamer, en leg elke muis in de conditioneringskamer. Onmiddellijk na het plaatsen van de muizen in de kamer, klikt u op de startknop van ImageFZ. De software zal auditief en / of elektrische footshocks presenteren aan de muizen in de volgorde die u opgeeft in een referentiebestand. Na 480 seconden verstreken, de terugkeer van de muizen naar hun kooi en de terugkeer van de kooi om de plank in de verhoorkamer. Reinig de kamers zorgvuldig. Klik vervolgens op 'Next Analysis' knop, en herhaal de stappen 3.2.4-3.6 voor de test muizen. ImageFZ winkels wonen en traceren afbeeldingen in het TIFF-formaat. Het programma staatons naar een offline analyse uit te voeren om de beelden opnieuw te analyseren met behulp van aangepaste parameterwaarden. Als u een offline analyse uit te voeren, selecteert u de plug-in menu 'Fear Conditioning en FZ Offline' en selecteer de map data die u wilt opnieuw analyseren. Daarna voer de parameterwaarden weer, en klik op de knop 'Compleet'. 4. Context Test Na het conditioneren sessie is voltooid, worden de muizen terug naar dezelfde conditioneringskamer en scoorde voor het invriezen van gedrag contextueel geconditioneerde angst (context test) te meten. Een vertraging interval tussen de conditionering en de context test is over het algemeen vastgesteld op 24 uur. In dit protocol, aan de recente geschiedenis en externe geheugen (gemeten door de test 1 dag en meer dan 28 dagen na deze behandeling, respectievelijk) 25 te beoordelen, worden de muizen blootgesteld aan de context test ongeveer 24 uur en 30 dagen na de conditionering sessie. De muizen worden in de cond geplaatstitioning kamer en mogen de kamer voor 300 sec vrij te verkennen zonder CS en US presentaties (figuur 2C). Voer het ImageFZ softwareprogramma en stel parameterwaarden de applicatie software op dezelfde wijze als in de inrichting (zie paragraaf 3.2.3), maar wijzigt de tijdsduur van de test 300 seconden en selecteer verwezen tekstbestand verband proef . Na het wijzigen van de instelling, moet een voorbereidend onderzoek worden gegeven met behulp van de praktijk muizen om de ImageFZ systeem te controleren. Plaats elke muis in de conditioneringskamer en klik op de startknop. Na 300 seconden verstreken, de terugkeer van de muizen in hun kooi, en totdat de cued test begint laat de kooi ongestoord. Reinig de kamers. Klik vervolgens op 'Next Analysis' knop, en herhaal de stappen 4,3-4,4 in de test muizen. 5. Cued Test Cued test wordt uitgevoerd op dezelfde dag van de proef context of op de volgende dag.In deze test worden muizen geplaatst in een testkamer met zeer verschillende eigenschappen, die een nieuwe context die geen verband houdt met de conditioneringskamer gedurende 3 minuten. Aan het einde van de eerste 3 minuten, wordt het auditieve signaal dat wordt gepresenteerd bij de conditionering gegeven aan muizen gedurende 3 min in de nieuwe context milieu. In dit protocol wordt ingelast uitgevoerde test een paar uur na de context test. Muizen worden toegestaan ​​om de driehoekige ruimte verkennen voor 360 sec. In de eerste 3 min, noch een CS noch de VS wordt gepresenteerd, en daarna, een CS (een 55 dB witte ruis) wordt gepresenteerd voor de laatste 3 minuten. Voer het ImageFZ softwareprogramma en de parameter waarden op dezelfde wijze als in conditionering, behalve de tijdsduur van de proef modificeren tot 360 seconden en selecteer een referentietekst bestand voor de geactiveerde test. Na het instellen moet een voorbereidend onderzoek worden gegeven met behulp van de praktijk muizen om de ImageFZ systeem te controleren. Plaats elke muis in de driehoekige kamer en klik op de startknop. Na 360 seconden verstreken, de terugkeer van de muizen naar hun kooi en de terugkeer van de kooi om de plank van het bedrijf kamer. Reinig de kamers. Klik vervolgens op de 'Next Analysis "knop en herhaal de stappen 5,3-5,4 in de test muizen. Om verder te testen externe geheugen, herhaal de Protocollen 4-5 ongeveer 30 dagen na de conditionering sessie (Figuur 2A). 6. Beeldanalyse Voer data-acquisitie en-analyse automatisch met behulp ImageFZ. Deze applicatie software programma is gebaseerd op het publieke domein ImageJ programma (ontwikkeld door Wayne Rasband bij de National Institutes of Health en die tegen http://rsb.info.nih.gov/ij/), gewijzigd door Tsuyoshi Miyakawa (ImageFZ applicatiesoftware , beschikbaar als gratis download, zie tabel van materialen / reagentia). Voor alle experimenten, beelden vast te leggen op een bepaald frame rate (bijv. 1 fps) met ImageFZ met een USB-video-opname-apparaat, zoals eenvideocamera. Om de afgelegde afstand van de opeenvolgende beelden te meten, waarde van het programma (bijvoorbeeld 80 pixels), die is ingesteld om het segment van de beelden in een zwart deeltje (een muis) en een witte achtergrond de 'drempel min' aan te passen. De afgelegde afstand wordt berekend uit de afstand tussen elke set van de xy-coördinaten van het zwaartepunt van het deeltje in de opeenvolgende beelden. Om de bevriezing gedrag van de opeenvolgende beelden te meten, stel de 'drempel min (xor) "waarde van het programma (bijvoorbeeld 160 pixels), die is ingesteld om het segment van de beelden in een zwart deeltje (muis) en de achtergrond, en berekent vervolgens de hoeveelheid ruimte (pixels) van de overlappende gebieden tussen deeltjes van elk paar opeenvolgende afbeeldingen. Pas de waarde met behulp van de schuifregelaar van de drempel gereedschap totdat de zwarte deeltje in elk beeld overeenkomt met de vorm van het hele lichaam van de muis met uitzondering van de staart. Als het gebied van de nonoverlapping gebied onder de "bevriezing criterium" waarde (bijv. 30 pixels) wordt het gedrag beschouwd als "bevriezing" (figuur 3), die over het algemeen wordt gedefinieerd als een totale afwezigheid van beweging behalve ademhaling en hartslag. Wanneer het gebied boven deze waarde wordt het gedrag als "niet-freezing '(figuur 3) zijn. Het vonnis moet worden gemaakt op basis van de definitie van het vriespunt. Muizen soms vertonen een subtiele beweging en een tijdelijke immobiliteit, die niet kan worden beschouwd als een bevriezing gedrag dat angst weerspiegelt. De immobiliteit dat duurt een korte tijd (bijvoorbeeld minder dan 2 seconden), die waarschijnlijk verschilt van de manifestatie van angst, kan de analyse worden uitgesloten door de tijd drempel van bevriezing. Waarde (bijv. 2 sec) – Om de tijd drempel, input 'min (sec) Invriezen duur' set. De ImageFZ programma automatisch calculates de afgelegde afstand (cm) en het percentage bevriezing. De resultaten worden opgeslagen in tekstbestanden en leven en sporenelementen beelden worden opgeslagen in een TIFF formaat. Voor het meten van de afgelegde afstand (cm) als een index van elektrische footshock gevoeligheid, het ImageFZ programma verwerft ook beelden met een hoge framerate (bijv. 4 fps) voor 6 seconden, gemeten vanaf 2 seconden voordat de levering van een 2 sec footshock tot 2 sec na footshock tijdens online analyse. Om de frame rate voor het vastleggen instellen voor, tijdens, en na footshock, voer een waarde in de 'Shock tarief (beeld / sec)' box. Na de online analyse uitvoeren offline analyse door een plug-in menu 'FZ Shock Offline' om de gegevens voor de afgelegde afstand te verkrijgen selecteren. De parameter waarden van de ImageFZ programma moet worden geoptimaliseerd om de resultaten vergelijkbaar zijn met die verkregen door menselijke waarnemers in de voorbereidende testen genereren. Voor handmatige scoring, wordt de bevriezing gedrag continu gemeten met behulp van een stopwatch en een event-opname programma of een onmiddellijke time-sampling procedure elke 3-10 seconden, tijdens de analyse met behulp van ImageFZ software. Twee waarnemers typisch gedrag van de gedragsobservatie. Om de parameter waarden van de ImageFZ programma 'bevriezen criterium' waarden aan te passen om ervoor te zorgen dat de uitkomsten van de beeldanalyse zijn consistent met die van menselijke waarnemers, voeren een offline analyse van de ImageFZ programma, het aanpassen van de 'drempel min (xor)' en . Om de offline analyses uit te voeren, selecteert u de plug-in menu 'FZ Offline' en voer een parameter waarden. 7. Problemen oplossen Hoe kan het ImageFZ programma worden verkregen en geïnstalleerd? Het ImageFZ programma is gratis te downloaden van onze website (zie tabel van materialen / reagentia) en draait op een Windows-computer. Download de folder rits voor ImageFZ en installeren van de software op uw computer. Zie de 'readme.txt' bestand voor de installatop details en volg de instructies stap-voor-stap. Waarom wordt de foutmelding 'Error instelling capture device' weergegeven? Controleer de aansluiting van de camera kabel en uw installatie van het stuurprogramma van de afbeelding USB-opnameapparaat. Als er geen probleem is met de instellingen en de ImageFZ software werkt mogelijk niet met uw beeldopname apparaat. Zie de 'readme.txt' bestand met betrekking tot het juiste apparaat te gebruiken met ImageFZ software. ImageFZ kan het hele lichaam van de muis niet detecteren als een deeltje. Stel de waarde van de 'drempel min' en / of 'drempel min (xor)' lager dan de huidige waarde. Als ImageFZ de muis niet kan detecteren in een bepaalde plaats, bijvoorbeeld de hoek van een testkamer, dan onvoldoende testomstandigheden, zoals een uniform verlicht vloer of een iets contrasterende verschil tussen de muis en de achtergrond, kunnen bestaan. Om dit probleem op te lossen, stelt u de parameter waarden (bv. </em> helderheid en het contrast van het live-beeld en drempelwaarden) van ImageFZ, controleren het aantal en de positie van het licht, of gebruik een witte achtergrond voor een zwarte muis. Vastleggen van het beeld op een hoge framerate vertraagt ​​de computer tijdens het online analyse. Stel de frame rate op een waarde lager dan de huidige koers, en het uitvoeren van online analyse. De ImageFZ analyse door beeldacquisitie 1 fps, volstaat voor het nauwkeurig meten bevriezen, zie de resultaten representatief gedeelte. De resultaten van de analyse ImageFZ het niet eens met die van de menselijke scoren. Onderzoekt het opgeslagen beeld en oordeel resultaat bestanden. Als ImageFZ overschat bevriezen, stelt u de 'bevriezing criterium' op een waarde lager dan de huidige waarde, en het uitvoeren van offline analyse. Als ImageFZ onderschat bevriezen, stelt u de 'bevriezing criterium' op een waarde hoger dan de huidige waarde. In optogenetical en in vivo elektrofysiologische experiments, de glasvezelkabel aan de kop van de muis interfereert met het oordeel van het vriespunt. De vacht van de kabels in het wit voor een zwarte muis, en verander de positie en de hoek van de camera totdat de kabels niet worden gedetecteerd. Wat nodig voor offline analyse? Maak een map met de naam 'Image_FZ' in de root directory van de ImageFZ programma. In deze map is, maakt de submappen 'Images' en 'Sessions'. Verplaats een Grijswaardenbeeld 8 bit naar de map 'Afbeeldingen', en een tekstbestand waarin de naam van het bestand is geschreven in de map 'Sessions'. Daarna lopen de ImageFZ offline analyse, en volg de instructies van het programma.