السياقية وملقن الخوف تكييف اختبار باستخدام نظام تحليل الفيديو في الفئران
1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science,Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency,Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences,National Institutes of Natural Sciences
Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكول لالسياقية وملقن الخوف تكييف الاختبار باستخدام نظام تحليل الفيديو لتقييم الخوف التعلم والذاكرة في الفئران.
Abstract
الخوف تكييف اختبار السياقية وملقن هي واحدة من الاختبارات السلوكية التي يقيم قدرة الفئران على التعلم والتذكر وجود ارتباط بين العظة البيئية والخبرات مكره. في هذا الاختبار، يتم وضع الفئران في غرفة تكييف وتعطى قصاصات من المثير الشرطي (وهو جديلة السمعية)، والتحفيز دون شروط مكره (وهي footshock الكهربائية). بعد تأخير الوقت، تتعرض الفئران لنفس تكييف غرفة وغرفة على شكل مختلف مع عرض جديلة السمعية. تجميد السلوك أثناء الاختبار يتم قياس بمثابة مؤشر للذاكرة الخوف. لتحليل السلوك تلقائيا، قمنا بتطوير نظام تحليل الفيديو باستخدام برنامج حاسوبي تطبيق ImageFZ، والذي يتوفر للتنزيل مجانا في http://www.mouse-phenotype.org/. هنا، لتظهر تفاصيل بروتوكول لدينا، ونحن لشرح الإجراء لدينا لالسياقية وملقن تكييف الخوف في الفئران C57BL/6J اختبار باستخدام SYST ImageFZم. بالإضافة إلى ذلك، ونحن لدينا بروتوكول التحقق من صحتها وتحليل أداء النظام الفيديو بمقارنة الوقت تجميد قياسها من قبل النظام ImageFZ أو نظام قياس الكمبيوتر المستندة إلى photobeam مع أن سجلها مراقب الإنسان. كما هو مبين في نتائج ممثلنا، كانت البيانات التي حصلت عليها ImageFZ مماثلة لتلك التي حللت من قبل المراقب الإنسان، مشيرا إلى أن التحليل السلوكي باستخدام نظام ImageFZ هو موثوق بها للغاية. تنص المادة الفيلم على معلومات مفصلة عن إجراءات الاختبار وسوف تعزز فهم الوضع التجريبية.
Introduction
الخوف تكييف اختبار السياقية وملقن هو النموذج السلوكي المستخدمة لتقييم الخوف النقابي التعلم والذاكرة في القوارض 1-3. وقد تم هذا الاختبار يستخدم على نطاق واسع لفهم الآليات العصبية للتعلم والذاكرة في الخوف المعدلة وراثيا وخروج المغلوب الفئران 1،4-16. تجميد السلوك، الذي يعرف بأنه الجمود كاملة باستثناء التنفس، هو استجابة مشتركة لحالات الخوف. في هذا النموذج السلوكي، وبعد تتعرض الحيوانات إلى الاقتران من جديلة السمعية مع footshock الكهربائية، فإنها تستجيب لتحفيز إنتاج الخوف عن طريق عرض تجميد السلوك، والتي تقاس وذلك في مؤشر التعلم الخوف النقابي والذاكرة. هذا الاختبار يتطلب معدات أقل تفصيلا، أقل مجهود بدني من قبل المحقق، وأقل الكثير من الوقت لتدريب الفئران من غيرها من مهام التعلم والذاكرة، بل يتطلب عادة حوالي 5-10 دقيقة / يوم في الماوس لمدة 2 ايام. على الرغم من أن إجراء الاختبار هو الاشتراكيةmple ويتطلب القليل من الوقت للتنفيذ، يجب على المحقق مراقبة بعناية وقياس سلوك الماوس، وبالتالي، وضعت العديد من أنظمة القياس الآلي لإجراء التحليل السلوكي 17-20. لدينا نظام تحليل الفيديو، والتي قمنا بتطويرها مع برنامج حاسوبي ImageFZ، يتيح لنا تحليل السلوك بسهولة تجميد ونتائج موثوق بها للغاية. توفر هذه المقالة معلومات مفصلة عن إجراء اختبار لدينا ويصف كيفية استخدام برنامج حاسوبي ImageFZ.
Protocol
جميع التجارب يجب أن يتم تنفيذ وفقا لتوجيهات والبروتوكولات التي وضعتها لجان رعاية الحيوان واستخدام المحلي. 1. إعداد جهاز جهاز لتكييف والسياق الاختبار هو غرفة مربعة مع الكلمة شبكة electrifiable، وهو مصدر الصوت، ومولد صدمة معايرة. وتستخدم الأحجام غرفة مختلفة، ذات أبعاد متفاوتة من 54 سم × 27 سم × 30 سم 21-25 سم × 35 سم × 30 سم 22. في هذا البروتوكول، ويتكون الجهاز من غرفة مربعة الاكريليك (33 سم × 25 سم × 28 سم؛ شفافة في الجدران الأمامية والخلفية؛ الأبيض في الجدران الجانبية) مع شبكات معدنية (0.2 سم القطر، 0.5 سم وبصرف النظر متباعدة) غطت بواسطة غطاء الاكريليك الشفاف (الشكل 1A). فمن الضروري أن تضع الغرفة في الطابق الاكريليك بيضاء (الشكل 1B) لتحليل سلوك الأسود، آغوطي، أو تمييع الفئران البني لنظام تحليل الصورة مع أناmageFZ برنامج حاسوبي (متوفر للتحميل مجانا، انظر جدول المواد / الكواشف) يميز موضوع الظلام من خلفية بيضاء في كل صورة الفيديو التي تم التقاطها. كما يمكن اختبار الفئران البيضاء باستخدام شبكات معدنية سوداء وأرضية الاكريليك الأسود (الشكل 1B). وترد التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED) أضواء على السقف فوق الجهاز. يضيء الشبكة في الطابق 100 لوكس بواسطة أضواء LED. هي التي شنت متحدث متصلة الأبيض ضجيج المولدات / لهجة (الشكل 1C) على السقف 5 سم فوق الغطاء لتقديم جديلة السمعي (الضوضاء البيضاء، 55 ديسيبل) كحافز مكيفة (CS). والسلكية وشبكات لمولد صدمة (الشكل 1C) لتقديم footshock الكهربائية والتحفيز دون شروط (الولايات المتحدة). وضعت غرفة الاختبار في غرفة عازلة للصوت (170 سم × 210 سم × 200 سم) (الشكل 1D) للحد من الضوضاء الخارجية خلال الاختبارات. هذا الشرط أيضا يمنع الفئران التي لم تتعرض حاليا لاختبار من سماع جديلة السمعية أو النطق من الفئران الاختبار. ويتكون الجهاز لاختبار ملقن للغرفة الذي له خصائص مختلفة من غرفة تكييف، وتوفير سياق جديد. لا بد من تغيير العظة الحسية قدر الإمكان بحيث الماوس يدرك سياق الرواية بأنها لا علاقة لها غرفة تكييف. عموما، يتم استخدام مربع على شكل مختلف أو غرفة الثلاثي. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير الإضاءة و / أو حاسة الشم العظة مختلفة أيضا في الماوس. في هذا البروتوكول، وجهاز هو غرفة الثلاثي الاكريليك (33 سم × 29 سم × 32 سم؛ بيضاء في كل جدار الجانب) مع الطابق الأبيض شقة للأسود، آغوطي، أو تمييع الفئران البني أو، الطابق الأسود شقة للالبيضاء الفئران، مع تغطية غطاء الاكريليك الشفاف (الشكل 1E). وترد أضواء LED في السقف فوق الجهاز. يتم تعيين مستوى الإضاءة من الكلمة في 30 لوكس. هي التي شنت متحدث على السقف 5 سم فوق غطاء لالعلاقات العامةESENT جديلة السمعية التي هي نفسها التي قدمت للفئران في وقت تكييف. يقع غرفة الثلاثي في غرفة عازلة للصوت مختلفة من الغرفة التي يتم تنفيذ تكييف واختبار السياق. وقد تم تجهيز كل غرفة مع المركبة على السقف تهمة جانب جهاز (CCD) وكاميرا الاتصال بجهاز كمبيوتر ويندوز عن طريق رباعية الخائن الفيديو وUSB التقاط الصور جهاز لرصد سلوك الماوس،، والصور من أجهزة والماوس يتم التقاطها وتحليلها من قبل برنامج تطبيق البرمجيات ImageFZ (انظر البروتوكول 6). يتم التحكم في مولدات الضجيج الأبيض وfootshock تلقائيا باستخدام برنامج حاسوبي ImageFZ؛ يجب كتابة وقت البدء ومدة الضوضاء البيضاء وfootshock في ملف نصي (انظر ملف نصي عينة 'كوند بسيطة "يظهر في شريط الفيديو ل التفاصيل حول كيفية كتابة المعلمات في الملف)، وهو يقرأ في التطبيق. قبل كل اختبار تبدأ، والجدران الاكريليكويتم محو طوابق مع منشفة غارقة في المياه تحت الكلور السوبر (الرقم الهيدروجيني 6-7)، ويتم تنظيف شبكات مع الايثانول 70٪ لمنع تحيز على أساس العظة حاسة الشم. يتم محو الشبكات مع الإيثانول بدلا من الماء تحت الكلور السوبر لضمان أن الشبكات لا يقلل التوصيل الكهربائي بسبب الصدأ. 2. إعداد الحيوان عموما، يتم إيواء 2-4 الفئران في قفص في غرفة عقد التحكم في درجة حرارته (23 ± 2 درجة مئوية) لمدة 12 ساعة ضوء / دورة الظلام (مثل أضواء على الساعة 7:00 AM). في هذا البروتوكول، للحد من التأثيرات المحتملة لنقل القفص على السلوك والتكيف مع الفئران في البيئة التجريبية، يتم نقل الأقفاص التي تحتوي على الفئران من غرفة عقد الحيوان في غرفة الانتظار عازلة للصوت المجاورة لغرفة عازلة للصوت اختبار لا يقل عن 30 دقيقة قبل بدء كل اختبار. كل التجارب (الشكل 2A) ينبغي أن يؤديها خلال لياليالفترة الزمنية AME في ضوء أو مرحلة مظلمة كل يوم لتقليل الاختلافات السلوكية التي تنتجها اختبار في أوقات مختلفة 23،24. في هذا البروتوكول، ويتم إجراء جميع التجارب بين 1 ساعة بعد بدء المرحلة الخفيفة و1 ساعة قبل بدء المرحلة المظلمة (8:00 حتي 6:00 في المرحلة ضوء). إذا جهاز واحد فقط هو متاح، وينبغي اختبار الفئران من كل الوراثي في ترتيب رباعية للحد من الآثار المحتملة للمرة تجريبية واختبار النظام من الموضوعات على الأداء السلوكي. ImageFZ يمكن السيطرة بحد أقصى 4 أجهزة. 4 اختبار الفئران في وقت واحد باستخدام 4 أجهزة في ترتيب يوازن يسمح الباحث لتوفير الوقت ويقلل من الآثار المحتملة للالمعلمات التجريبية على السلوك الماوس. 3. تكييف يتم وضع الفئران في غرفة تكييف، وعادة ما يتم السماح الفئران لاستكشاف بحرية الغرفة لمدة 120 ثانية. بعد ذلك، يقوم الاتحاد الافريقيجديلة ditory، مثل الضوضاء البيضاء، لهجة، والفرس السمعية، وقدمت على انها CS لمدة 30 ثانية، ويتم إعطاء 0،1-0،8 أمبير footshock للفئران باعتباره الولايات المتحدة خلال ثانية 2 مشاركة من الصوت. يتم تكرار عرض التقشير CS-US لتعزيز تكوين الجمعيات. يتم ترك الفئران في الغرفة لفترة من الوقت بعد العرض الأخير لمزيد من إنشاء علاقة بين سياق الغرفة وتجربة مكره. في هذا البروتوكول، بعد 120 ثانية من التنقيب الحرة، ويرد على جديلة السمعي (الضوضاء البيضاء، 55 ديسيبل) لمدة 30 ثانية، ويتم تسليم footshock 0.3 مللي أمبير مستمر خلال ثانية 2 الأخير من الضوضاء البيضاء. بعد 90 ثانية، ونظرا لالاقتران من جديلة السمعية مع footshock على المواضيع مرة أخرى. عرض CS-US يكرر ثلاث مرات في كل دورة (120، 240، و 360 ثانية بعد بداية تكييف) (الشكل 2B). بعد footshock النهائي، يتم ترك الفئران دون عائق في غرف لمدة 90 ثانية. قبل أن تبدأ الدورة تكييف، قم بتشغيل برنامج تطبيق البرمجيات ImageFZ، حدد القائمة المكونات في 'تكييف وFZ FZ عبر الإنترنت (4 غرفة) "، وتعيين قيم المعلمة خطوة بخطوة على النحو التالي. الخطوة 1: معرف المشروع. تحديد مجلد حيث تريد تخزين ملفات البيانات الخاصة بك. الخطوة 2: الدورة اسم. اكتب أي كلمة، مثل تاريخ التجريبية، في خانة 'الدورة'، وحدد ملف نصي المرجعية التي كتبت وقت البدء ومدة الضوضاء البيضاء وfootshock، في خانة "مرجع". ويظهر ملف نصي عينة في الفيديو. الخطوة 3: إعدادات المعلمة. إدخال قيم المعلمة في كل مربع على النحو التالي. معدل (إطار / ثانية): معدل الإطار من الحصول على الصور، على سبيل المثال 1 إطار / ثانية. مدة (ثانية): في حالة تكييف، المدة الإجمالية هو 480 ثانية. بن مدة (ثانية): على سبيل المثال 60 ثانية، ويتم تحليل البيانات في كل كتلةمن 60 ثانية. موضوع حجم – دقيقة (بكسل): ImageFZ بالكشف عن الماوس والضوضاء كما الجزيئات السوداء (بعض كتلة بكسل) في خلفية بيضاء في كل صورة. عندما مجال الجسيمات الأسود (بكسل) أقل من 'موضوع حجم – دقيقة (بكسل) "القيمة (على سبيل المثال 100 بكسل)، وتعتبر الجزيئات من الضوضاء ويتم استبعادها من تحليل الصور. عندما أحجام الجزيئات السوداء هي أكثر من حجم 'موضوع حجم – ماكس (بكسل) "القيمة، يتم استبعاد الجزيئات من التحليل: ماكس (بكسل) – حجم الموضوع. حجم الإطار – عرض / ارتفاع (سم): البعد الغرفة، أي 33 سم و 25 سم ارتفاع. تجميد المعيار (بكسل): مثلا 30 بكسل، راجع التفاصيل في البروتوكول 6. تجميد مدة – دقيقة (ثانية): على سبيل المثال 2 ثانية، وعندما يتم الكشف عن أي حركة الماوس فقط أقل من 2 ثانية، لا تحسب سلوكها ب "تجميد"؛ معدل صدمة (إطار / ثانية): انظر التفاصيل في البروتوكول 6. الخطوة 4: موضوع الهوية. أدخل هوية الموضوع. الخطوة 5: إعدادات الكاميرا. التحكم في السطوع والتباين في الصورة الملتقطة. الخطوة 6: إعدادات عتبة. ضبط القيم الحدية للكشف عن ماوس أسود كما بكسل السوداء في خلفية بيضاء في كل صورة والحكم على السلوك الماوس باسم 'تجميد' أو 'غير تجميد "(انظر التفاصيل في البروتوكول 6). لتحليل الفأرة البيضاء، انقر على مربع 'الوضع المقلوب "، وضبط القيم عتبة مناسب. خطوة 7: تعيين قفص الميدان. تحديد مجال كل من المجلسين الذي تريد التقاطه. بعد النقر على الزر المستطيل في مربع الأدوات، رسم مستطيل حول أرضية الغرفة على نافذة الصورة الحية. المقبل، حدد عدد غرفة وانقر على زر 'مجموعة'. أخيرا، انقر على زر 'كاملة'. <لى> بعد أن يتم تعيين إعدادات المعلمة، ينبغي إيلاء اختبار التحضيرية باستخدام الفئران الممارسة (الفئران لا تستخدم كمواد) قبل أول اختبار اليوم لتحديد ما إذا كان نظام تحليل الصورة ومولدات الضجيج / صدمة بيضاء تعمل دون مشاكل. نقل قفص المنزل تحتوي على الفئران الممارسة إلى غرفة الاختبار عازلة للصوت من غرفة الانتظار المجاورة، ووضع كل فأر في غرفة تكييف. على الفور بعد وضع الفئران في الغرفة، انقر فوق الزر بدء ImageFZ. فإن تطبيق البرمجيات تقديم العظة السمعية و / أو footshocks الكهربائية للفئران في الترتيب الذي تحدده في ملف المرجعية. بعد مرور 480 ثانية، والعودة إلى قفص الفئران وطنهم والعودة إلى القفص الرف في غرفة القابضة. تنظيف غرف بعناية. ثم، انقر فوق الزر "التالي تحليل"، وكرر الخطوات 3.2.4-3.6 للفئران الاختبار. مخازن ImageFZ العيش وتتبع الصور في تنسيق TIFF. يسمح البرنامجلنا لإجراء التحليل حاليا لreanalyze الصور باستخدام قيم المعلمة تعديل. إذا كنت إجراء تحليل حاليا، حدد المكونات في القائمة 'تكييف الخوف وFZ متصل' وحدد مجلد البيانات التي تريد reanalyze. بعد ذلك، إدخال القيم المعلمة مرة أخرى، وانقر على زر 'كاملة'. 4. سياق اختبار بعد أن تم الانتهاء من الدورة تكييف، يتم إرجاع الفئران لنفس غرفة تكييف وسجل لتجميد السلوك لقياس الخوف مكيفة السياق (سياق الاختبار). والفاصل الزمني بين تأخير تكييف والاختبار السياق تم تعيين عموما في 24 ساعة. في هذا البروتوكول، لتقييم الذاكرة الحديثة والذاكرة البعيدة (تقاس اختبار 1 يوم، وأكثر من 28 يوما بعد تكييف، على التوالي) 25، يتعرضون الفئران لاختبار سياق ما يقرب من 24 ساعة وبعد الدورة تكييف 30 يوما. يتم وضع الفئران في كوندitioning غرفة ويسمح بحرية لاستكشاف الغرفة لمدة 300 ثانية دون CS والولايات المتحدة عروضا (الشكل 2C). تشغيل برنامج حاسوبي ImageFZ وتعيين قيم المعلمة البرنامج التطبيق بنفس الطريقة كما في تكييف (انظر القسم 3.2.3)، ومع ذلك، تعديل الوقت مدة هذا الاختبار إلى 300 ثانية وحدد ملف النص المرجعي لاختبار السياق . بعد تغيير الإعداد، يجب أن يعطى اختبار التحضيري باستخدام الفئران الممارسة للتحقق من نظام ImageFZ. وضع كل فأر في غرفة تكييف وانقر على زر البداية. بعد مرور 300 ثانية، والعودة إلى قفص الفئران وطنهم، وترك القفص دون عائق حتى يبدأ الاختبار ملقن. تنظيف الغرف. ثم، انقر فوق الزر "التالي تحليل"، وكرر الخطوات من 4،3-4،4 في الفئران الاختبار. 5. اختبار ملقن ويجري اختبار ملقن على نفس يوم الاختبار السياق أو في اليوم التالي.في هذا الاختبار، يتم وضع الفئران في غرفة اختبار آخر مع خصائص مختلفة جدا، وتوفير السياق الجديد الذي لا صلة له غرفة تكييف لمدة 3 دقائق. في نهاية أول 3 دقائق، يتم إعطاء جديلة السمعية التي يتم تقديمها في وقت لتكييف الفئران لمدة 3 دقائق في بيئة سياق الرواية. في هذا البروتوكول، يتم تنفيذ اختبار ملقن بعد ساعات قليلة من الاختبار السياق. ويسمح الفئران لاستكشاف غرفة الثلاثي ل 360 ثانية. في أول 3 دقائق، وتقدم يست CS ولا الولايات المتحدة، وبعد ذلك، يتم تقديم CS (55 ديسيبل الضوضاء البيضاء) لمدة 3 دقائق الماضي. تشغيل برنامج حاسوبي ImageFZ وتعيين قيم المعلمة في نفس الطريقة كما في تكييف، باستثناء تعديل الوقت مدة الاختبار إلى 360 ثانية وحدد ملف النص المرجعي لاختبار ملقن. بعد ضبط الإعداد، يجب أن يعطى اختبار التحضيري باستخدام الفئران الممارسة للتحقق من نظام ImageFZ. وضع كل فأر في غرفة الثلاثي، وفوق بدايةالزر. بعد مرور 360 ثانية، والعودة إلى قفص الفئران وطنهم والعودة إلى القفص الرف من الغرفة القابضة. تنظيف الغرف. ثم، انقر فوق الزر "التالي تحليل" وكرر الخطوات من 5،3-5،4 في الفئران الاختبار. لمزيد من اختبار الذاكرة عن بعد، كرر البروتوكولات بعد 4-5 حوالي 30 يوما دورة تكييف (الشكل 2A). 6. تحليل صورة أداء الحصول على البيانات وتحليلها تلقائيا باستخدام ImageFZ. ويستند هذا البرنامج تطبيق البرمجيات على برنامج يماغيج المجال العام (التي وضعتها اين Rasband في المعاهد الوطنية للصحة ومتاحة في http://rsb.info.nih.gov/ij/)، المعدلة Miyakawa تسويوشي (تطبيق البرمجيات ImageFZ ، وهي متاحة للتحميل مجانا، انظر جدول المواد / الكواشف). لجميع التجارب، التقاط الصور بمعدل معطى الإطار (على سبيل المثال 1 في الثانية) مع ImageFZ باستخدام جهاز التقاط الفيديو USB، بما في ذلككاميرا فيديو. لقياس المسافة سافر من الصور المتتالية، وضبط قيمة "عتبة دقيقة 'من البرنامج (على سبيل المثال 80 بكسل)، التي من المقرر أن شريحة الصور في الجسيمات الأسود (ماوس) وخلفية بيضاء. يتم حساب المسافة المقطوعة من المسافة بين كل مجموعة من إحداثيات س ص لمركز الثقل للجسيمات في الصور التوالي. لقياس السلوك تجميد من الصور على التوالي، وضبط "عتبة دقيقة (XOR) 'قيمة البرنامج (على سبيل المثال 160 بكسل)، والتي من المقرر أن شريحة الصور في الجسيمات الأسود (الماوس) والخلفية، ومن ثم حساب مقدار المساحة (بكسل) من المناطق غير المتداخلة بين الجسيمات من كل زوج من الصور التوالي. ضبط قيمة باستخدام شريط التمرير من أداة عتبة حتى الجسيمات السوداء في كل صورة يطابق شكل الجسم بأكمله من الفأرة باستثناء الذيل. إذا كانت المنطقة من nonoverlaشي pping المنطقة هي أقل من قيمة "المعيار تجميد '(على سبيل المثال 30 بكسل)، ويعتبر السلوك لتكون' تجميد '(الشكل 3)، الذي يعرف عموما باسم الغياب الكامل لأي حركة باستثناء التنفس وضربات القلب. عندما يتجاوز مجال هذه القيمة، ويعتبر السلوك لتكون "غير تجميد" (الشكل 3). يجب أن يكون الحكم على أساس تعريف التجمد. الفئران في بعض الأحيان يحمل حركة خفية والجمود لحظة، والتي قد لا تعتبر سلوك تجميد يعكس الخوف. الجمود الذي يستمر لفترة قصيرة (على سبيل المثال أقل من 2 ثانية)، والتي تختلف من المرجح مظهر من مظاهر الخوف، يمكن أن تستبعد من التحليل عن طريق تحديد عتبة وقت التجمد. لضبط عتبة الوقت، ومدخلات 'التجميد مدة – دقيقة (ثانية) "القيمة (على سبيل المثال 2 ثانية). برنامج ImageFZ calcul تلقائياآتش المسافة المقطوعة (سم) والنسبة المئوية للتجميد. يتم حفظ نتائج البحث في ملفات نصية، والعيش وتتبع وتخزين الصور في شكل TIFF. لقياس سافر مسافة (سم) وذلك في مؤشر حساسية footshock الكهربائية، وبرنامج ImageFZ يكتسب أيضا الصور بمعدل إطارات عالية (على سبيل المثال 4 إطارا في الثانية) لمدة 6 ثانية، وتقاس من 2 ثانية قبل تسليم footshock 2 ثانية حتى 2 ثانية بعد footshock خلال تحليل على الانترنت. لضبط معدل الإطار لالتقاط الصور قبل وأثناء وبعد footshock، 'معدل صدمة (إطار / ثانية)' مربع إدخال قيمة في. بعد تحليل على الانترنت، تنفيذ تحليل غير متصل عن طريق اختيار المكونات في القائمة 'FZ صدمة غير متصل "للحصول على البيانات لمسافة المقطوعة. ينبغي أن يكون الأمثل القيم المعلمة من برنامج ImageFZ لتوليد نتائج مماثلة لتلك التي حصلت مراقبون الإنسان في اختبارات التحضيرية. للتسجيل اليدوي، يتم قياس سلوك تجميد مستمر باستخدام stopwatcح وبرنامج الحدث تسجيل أو إجراء الوقت أخذ العينات لحظية كل 3-10 ثانية، أثناء التحليل باستخدام برنامج ImageFZ. اثنين من المراقبين عادة إجراء الملاحظة السلوكية. لضبط القيم المعلمة من برنامج ImageFZ للتأكد من أن نتائج تحليل الصور متوافقة مع تلك مراقبين الإنسان، إجراء تحليل حاليا لبرنامج ImageFZ، تعديل 'دقيقة عتبة (XOR) "والقيم" المعيار تجميد' . لإجراء تحليل غير متصل، حدد القائمة المكونات في 'FZ متصل' وإدخال أية قيم المعلمة. 7. استكشاف الأخطاء وإصلاحها كيف يمكن الحصول على برنامج ImageFZ وتثبيتها؟ برنامج ImageFZ متاح للتحميل مجانا من موقعنا على الانترنت (انظر الجدول المواد / الكواشف)، ويعمل على جهاز كمبيوتر ويندوز. تحميل مجلد مضغوط لImageFZ وتثبيت البرنامج على جهاز الكمبيوتر الخاص بك. راجع الملف "README.TXT" لINSTALLATIعلى التفاصيل واتبع التعليمات خطوة بخطوة. لماذا رسالة الخطأ "خطأ وضع جهاز التقاط" عرض؟ تحقق من توصيل الكابل الكاميرا وتثبيت برنامج التشغيل الخاص بك من جهاز التقاط صورة USB. إذا لم يكن هناك مشكلة مع إعدادات، ثم البرنامج ImageFZ قد لا تعمل مع جهاز التقاط الصورة. رؤية 'README.TXT' ملف بشأن الجهاز المناسب لاستخدامه مع برنامج ImageFZ. ImageFZ لا يمكن الكشف عن مجموعة كاملة من الماوس بوصفه الجسيمات. تعيين قيمة "دقيقة عتبة" و / أو "عتبة دقيقة (XOR) 'أقل من القيمة الحالية. إذا ImageFZ لا يمكن الكشف عن الماوس في مكان معين، مثل ركن من غرفة الاختبار، ثم عدم كفاية شروط الاختبار، مثل أرضية مضيئة بشكل موحد أو فرقا قليلا المتناقضة بين الماوس والخلفية، قد تكون موجودة. لحل هذه المشكلة، وضبط القيم المعلمة (على سبيل المثال </eم> السطوع والتباين في الصورة وعتبة القيم الحية) من ImageFZ، والسيطرة على عدد ومواقع الأضواء، أو استخدام خلفية بيضاء لفأر أسود. التقاط صورة في ارتفاع معدل الإطار يبطئ الكمبيوتر أثناء التحليل على الانترنت. تعيين معدل الإطار إلى قيمة أقل من المعدل الحالي، وإجراء تحليل على الانترنت. تحليل ImageFZ، من خلال الحصول على الصور في 1 إطارا في الثانية، ويكفي لقياس بدقة التجمد، كما هو مبين في القسم نتائج ممثل. نتائج تحليل ImageFZ لا أتفق مع تلك التهديف الإنسان. دراسة الصورة المخزنة وملفات نتيجة الحكم. إذا يغالي ImageFZ تجميد، تعيين 'المعيار تجميد "إلى قيمة أقل من القيمة الحالية، وإجراء تحليل غير متصل. ، إذا ما قلل ImageFZ تجميد، تعيين 'المعيار تجميد "إلى قيمة أعلى من القيمة الحالية. في optogenetical والمجراة البريد الكهربيةxperiments، كابل الألياف تعلق على الرأس من الفأرة يتداخل مع الحكم من التجمد. معطف الكابلات باللون الأبيض للماوس الأسود، وتغيير موضع وزاوية الكاميرا حتى لا يتم الكشف عن الكابلات. ما هو مطلوب حاليا للتحليل؟ إنشاء مجلد اسمه 'Image_FZ' في الدليل الجذر من برنامج ImageFZ. في هذا المجلد، إنشاء المجلدات الفرعية 'الصور' و 'جلسات'. نقل 8 بت صورة مقياس الرمادية إلى مجلد 'الصور'، وإنشاء ملف نصي الذي يتم كتابة اسم ملف الصورة في مجلد 'دورات'. بعد ذلك، قم بتشغيل تحليل غير متصل ImageFZ، واتبع تعليمات البرنامج.
Representative Results
في اختبار تكييف الخوف، المجربون الانسان يستخدم لقياس السلوك من خلال تجميد كثيفة العمالة الملاحظة المباشرة 26-29، ولكن تم استخدام أنظمة قياس الكمبيوتر مؤخرا على أساس photobeam (مثل نظام "مراقب تجميد ') وصورة، تحليل تلقائيا قياس السلوك تجميد 26،30-32. ImageFZ هو نظام تحليل الصورة-الآلي، والتي تنتج نتائج مماثلة لتلك التي حصلنا عليها من خلال الملاحظة البشرية، كما هو موضح أدناه. هنا، ونحن مقارنة نتائج المراقبة الإنسان مع تلك التحليل ImageFZ تحت معلمات متفاوتة: 'معدل (إطار / ثانية)' و 'تجميد المعيار (بكسل).' في هذه التجربة، وخمسة الفئران C57BL/6J الذكور (يعني وزن الجسم ± SD (ز)، 31.4 ± 3.55؛ يعني حجم الجسم ± SD (بكسل)، 351.6 ± 62.2) واستخدمت في 15-27 أسابيع من العمر. أبديت ملاحظة الإنسان باستخدام برنامج الحدث تسجيل (برنامج حاسوبي ماكنتوش OS9)؛ حدثا رئيسيا الملحة التي تستمرواعتبر د لمدة 2 ثانية أو أكثر عندما ماوس عرض نوبة من أي حركة 'تجميد'. تم حساب النسبة المئوية للتجميد كل 60 ثانية في كل اختبار وتستخدم لتحليل الارتباط. في المئة من تجميد وسجل المراقبون 2 (الموثوقية بين الفاحصين، لتكييف، ص = 0.879؛ لاختبار السياق، ص = 0.957؛ لاختبار ملقن، ص = 0.866، لجميع الحالات، ص = 0.888) وكان متوسط لتوليد الإنسان يسجل. تم فحص الارتباط بين النسب المئوية التي تقاس من خلال تجميد ImageFZ مع كل معدل الإطار (أي 1، 2، و 4 في الثانية) وتلك التي حصلنا عليها من خلال الملاحظات الإنسان. كما هو موضح في الشكل (4)، والنسب المئوية محسوبة من خلال تجميد ImageFZ (1، 2، و 4 في الثانية) ويرتبط ارتباطا وثيقا متوسط القيمة التي تم الحصول عليها من قياسات المراقبين 2. والجدير بالذكر أن التقاط الصور بمعدل أعلى الإطار لا تنتج دائما أفضل الارتباط. تحليل الصور في 1 في الثانية ولدت نتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من المراقبين الإنسان في البريداختبار منظمة العمل ضد الجوع. تم فحص الارتباط بين نسب تجميد قياسها من خلال الملاحظات الإنسان واستخدام ImageFZ تحت كل حالة من 'معيار التجميد (بكسل)' (أي 20، 30، و 40 بكسل). النسب المئوية تجميد حسابها باستخدام ImageFZ في "المعيار التجميد (بكسل)" 20، 30، و 40 بكسل تم، في جميع الحالات، مرتبطة إلى حد كبير مع تلك التي تم الحصول عليها من خلال الملاحظات الإنسان (الشكل 5). كما هو مبين في الشكل 5D، عندما يتم تعيين المعيار التجميد إلى قيمة منخفضة، وحركة خفية على فأرة الحاسوب، نظرت إلى أن 'تجميد' مراقبون الإنسان، يعتبر "غير تجميد 'باستخدام ImageFZ. على العكس، إذا تم تعيين المعيار إلى قيمة عالية، حركة الماوس، وسجل باسم 'غير تجميد' مراقبون الإنسان، سينظر 'تجميد' باستخدام ImageFZ (أرقام 5C، 5F، و5I). وبالتالي، للحصول على النتائج الأكثر موثوقية، يجب معايرة لنا كل معلمة من برنامج ImageFZجي من خلال البيانات وسجل الملاحظات الإنسان في كل بيئة الاختبار. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بمقارنة النتائج التي تم إنشاؤها بواسطة مراقب الإنسان، وذلك باستخدام نظام قائم على القياس photobeam الكمبيوتر (نظام مراقبة تجميد)، لتلك التي حصلنا عليها باستخدام ImageFZ (انظر الشكل 6). أصيب بالعمى المراقب الإنسان لمجموعة العلاج ونتائج ImageFZ التهديف. لإعدادات المعلمة من نظام مراقبة تجميد، كنا 3 تدابير من النسبة المئوية للتجميد من نظام التحقق من صحة سابقا 30. لفترة وجيزة، وعدد من فترات 10 ثانية في الحيوانات التي يتطلب أكثر من 1 أو 2 ثانية لعبور أول شعاع جديد من الفاصل الزمني (10sec و1sec الجيش و2sec 10sec و، على التوالي) والكمون بين بداية كل فترة 5 ثوانى و تم قياس ثالث انقطاع شعاع جديد في هذا الفاصل الزمني (Latency3). النسب المئوية لفترات خلالها الماوس تم تجميد أو نسبة من المبلغ الإجمالي من الوقت صequired لكسر حسبت photobeam الثالث. ويوضح النسب المئوية للتجميد قياس في كل نظام في الشكل 6. وتمت مقارنة المجموعات باستخدام اتجاهين التدابير المتكررة ANOVA تليها تي الاختبارات (انظر الجدول 1). وكانت النسب المئوية تجميد قياسها باستخدام ImageFZ (الشكل 6B) أكثر مماثلة لتلك التي سجلت خلال الملاحظة البشرية (الشكل 6A) من البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام نظام قائم على photobeam (أرقام 6C-E). النسب المئوية تجميد قياسها باستخدام برنامج ImageFZ في كل اختبار كانت مرتبطة إلى حد كبير مع تلك أحرز من خلال الملاحظة الإنسان (تكييف، ص = 0.947؛ اختبار السياق، ص = 0.970؛ ملقن الاختبار، ص = 0.934)، في حين أن العلاقات المتبادلة بين النسب المئوية تجميد قياس باستخدام نظام قياس الكمبيوتر المستندة إلى photobeam (10sec و1sec الجيش، 2sec 10sec و، أو Latency3) وكان المراقب الإنسان أقل (تكييف، ص = 0.503، 0.593، 0.761 و؛ سياق ربتوقيت شرق الولايات المتحدة، ص = 0.772، 0.819، 0.912 و) مقارنة مع الارتباطات بين النسب المئوية تجميد قياسها باستخدام ImageFZ والمراقبة الإنسان (أرقام 7A و7B). بالإضافة إلى ذلك، يكشف الشكل 7 أن الاختلافات بين النسب المئوية تجميد الحصول عليها من خلال الملاحظة البشرية واستخدام الماوس في كل ImageFZ كانت أصغر الخلافات. وأشارت هذه النتائج إلى أن نسب تجميد قياسها باستخدام ImageFZ كانت مشابهة لتلك التي حصلنا عليها من خلال الملاحظة البشرية والتي ImageFZ هو درجة عالية من الدقة عند قياس كمية التجمد. الشكل 1. أجهزة لالسياقية وملقن تكييف الخوف الاختبار. (A) دائرة مربع الاكريليك لتكييف وسياق الاختبار، ( <strأونج> B) شبكات معدنية على أرضية من البلاستيك الأبيض للأسود، آغوطي، أو تمييع الفئران البني (أعلى) وelectrifiable شبكات معدنية سوداء على أرضية من البلاستيك الأسود للفئران البيضاء (أسفل)، ويتم عرض صور مكبرة للشبكات في الحق لوحة، (C) بيضاء ضجيج المولدات / لهجة ومولد الصدمة، (D) غرفة عازلة للصوت، و (E) وغرفة الثلاثي الاكريليك مع أرضية مسطحة لاختبار ملقن. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. الشكل 2. التمثيل التخطيطي للبروتوكول. (A) لمحة عامة عن السياقية وملقن تكييف الخوف الاختبار، (B) تكييف، (C) جاختبار ontext، و (D) ملقن الاختبار. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. الرقم 3. تحليل الصور بواسطة برنامج حاسوبي ImageFZ. لكل زوج من الصور المتعاقبة، يتم حساب مقدار المساحة (بكسل) التي من خلالها تحريك الماوس عن طريق ImageFZ. عندما يكون هذا المجال هو دون عتبة معينة (مثلا 30 بكسل)، والحكم على السلوك أن 'تجميد'. عندما كمية من مساحة تساوي أو تتجاوز عتبة، ويعتبر السلوك لتكون "غير تجميد '. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. الشكل 4. وأجريت مقارنات بين نسب تجميد حسابها من الصور في الإطار معدلات مختلفة باستخدام ImageFZ مع تلك التي تقاس من خلال الملاحظة البشرية. الاختبارات تكييف الخوف باستخدام C57BL/6J الفئران الذكور (ن = 5). خلال الاختبارات، وسجل اثنين من المراقبين سلوك تجميد. في الوقت نفسه، تم القبض على الصور الحية في 4 إطارا في الثانية باستخدام برنامج ImageFZ. تم تقليص حجم الملفات التي استولت في 4 إطارا في الثانية بعد استخراج إطارات لتتوافق مع الصور التي تم التقاطها في 1 أو 2 إطارا في الثانية في الثانية. قيم المعلمات من 'معدل (إطار / ثانية)' تم تعيين إلى 1 أو 2 أو 4 إطارا في الثانية، وحسبت النسب المئوية تجميد في كل 60 ثانية من بن ملفات الصور باستخدام ImageFZ تحليل غير متصل. تمثل كل نقطة مئوية تجميد كل 60 ثانية بن. تم حساب معاملات ارتباط بيرسون بين البيانات التي تم الحصول عليها من الملاحظة البشرية وتحليل ImageFZ.انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر. الرقم 5. وتمت مقارنة نسب تجميد حساب من الصور في مختلف القيم معيار التجميد باستخدام ImageFZ وتلك التي تقاس من خلال الملاحظات الإنسان. وأجريت اختبارات تكييف الخوف باستخدام C57BL/6J الفئران الذكور (ن = 5). خلال الاختبارات، وسجلت اثنين من المراقبين سلوك تجميد، وتم القبض على الصور الحية باستخدام برنامج ImageFZ. تم حساب النسب المئوية تجميد في كل 60 ثانية بن من الصور (1 إطار / ثانية) من خلال ImageFZ حاليا تحليل، وتحديد القيم المعلمة من 'معيار التجميد (بكسل)' إلى 20، 30، أو 40 بكسل. تمثل كل نقطة مئوية تجميد كل 60 ثانية بن. بيرسون الارتباط المشتركحسبت efficients بين البيانات التي تم الحصول عليها من الملاحظة البشرية وتحليل ImageFZ في كل اختبار. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. الرقم 6. تم قياس نسب التجميد باستخدام النظم الآلية والمراقبة الإنسان في مجموعات دون شروط ومكيفة من الفئران C57BL/6J الذكور (ن = 5، كل مجموعة). (A) الملاحظة الإنسان، (B) ImageFZ، (C) تجميد نظام مراقبة 1 (1sec الجيش 10sec و)، (D) تجميد نظام مراقبة 2 (2sec 10sec و)، و (E) تجميد نظام مراقبة 3 (Latency3). وأجريت مقارنات المجموعة باستخدام اتجاهين التدابير المتكررة ANOVA تليها تي اختبارات (غير متحدمجموعة nditioned مقابل مجموعة مكيفة، *، P <0.05؛ †، ف <0.01). البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام ImageFZ كانت مشابهة لتلك التي سجلت خلال الملاحظة البشرية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. الرقم 7. وتظهر علاقة وتوزيع الترددات للفروق بين النسب المئوية التجميد، وتقاس باستخدام النظم الآلية والمراقبة الإنسان. (AB) المؤامرات مبعثر ومعاملات ارتباط بيرسون بين النسب المئوية تجميد سجل من خلال النظم الآلية والمراقبة الإنسان. نسب التجميد، وتحسب باستخدام ImageFZ، كانت مرتبطة إلى حد كبير مع تلك التي تم الحصول عليها من خلال الملاحظة البشرية. (CF) تكرارات أقل من 10٪ المتنوعةference بين النسب المئوية تجميد الحصول عليها من النظم الآلية مقابل الملاحظة البشرية كانت أعلى عند تحليل البيانات باستخدام قورنت مع تلك ImageFZ تحليلها من خلال الملاحظة البشرية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. ANOVAs حالة وقت حالة X مرة يوم 1 (تكييف) بشري F (1،8) = 28.53، ع = 0.0007 F (7،56) = 20.79، ع <0.0001 F (7،56) = 16.58، ع <0.0001 ImageFZ F (1،8) = 13.97، ع = 0.0057 F (7،56) = 21.40، ع <0.0001 F (7،56) = 11.69، ع <0.0001 مراقب تجميد (1sec10sec) F (1،8) = 5.16، ع = 0.0528 F (7،56) = 2.39، ع = 0.0329 F (7،56) = 0.72، ع = 0.6572 مراقب تجميد (2sec10sec) F (1،8) = 4.07، ع = 0.0782 F (7،56) = 3.44، ع = 0.0039 F (7،56) = 1.52، ع = 0.1803 مراقب تجميد (Latency3) F (1،8) = 4.44، ع = 0.0682 F (7،56) = 9.94، ف <0.0001 F (7،56) = 4.33، ع = 0.0007 يوم 2 (السياق) بشري F (1،8) = 42.94، ع = 0.0002 F (4،32) = 1.91، ع = 0.1336 F (4،32) = 1.48، ع = 0.2302 ImageFZ F (1،8) = 49.61، ع = 0.0001 F (4،32) = 2.06، ع = 0.1087 F (4،32) = 0.83، ع = 0.5174 مراقب تجميد (1sec10sec) F (1،8) = 20.28، ع = 0.002 F (4،32) = 1.63، ع = 0.1918 F (4،32) = 0.55، ع = 0.6997 مراقب تجميد (2sec10sec) F (1،8) = 40.20، ع = 0.0002 F (4،32) = 2.66، ع = 0.0504 F (4،32) = 1.20، ع = 0.3306 مراقب تجميد (Latency3) F (1،8) = 35.30، ع = 0.0003 F (4،32) = 2.49، ع = 0.0626 F (4،32) = 1.09، ع = 0.3793 الجدول 1. مقارنات بين الإحصاءات.
Discussion
الخوف تكييف اختبار السياقية وملقن هي واحدة من الأكثر استخداما على نطاق واسع نماذج لتقييم التعلم والذاكرة. هذا الاختبار هو شكل من أشكال تكييف بافلوف التي يتم فيها وجود ارتباط بين السياق و / أو حافزا مكيفة (جديلة السمعية) وحافزا مكره (footshock الكهربائية). حتى بعد الاقتران واحدة من سياق / جديلة السمعية وfootshock والفئران يحمل تجميد طويلة الأمد عندما تواجه مع أي سياق أو جديلة. في هذا الاختبار، يتم استخدام السلوك تجميد بمثابة مؤشر للذاكرة الخوف. وقد كشفت الدراسات الدوائية والآفة التي تكوين الذاكرة، وتوحيد، واسترجاعها ويتم تنظيم العديد من مناطق الدماغ مثل اللوزة، الحصين، وقشرة الفص الجبهي 3،33-35. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات علم الوراثة الجزيئية دور الجينات والجزيئات المشاركة في التعلم والذاكرة في هذه المناطق في الدماغ باستخدام الفئران المهندسة وراثيا 36 محددة. لذلك، هذا الاختبار هو بسيط داخه ومفيدة لاستكشاف أساس العصبية الحيوية الكامنة التعلم الخوف والذاكرة. في هذه المقالة الفيلم، قدمنا بروتوكول جهدنا لتوفير المجربون مع معلومات تفصيلية لفهم وسهولة إجراء الاختبار.
وكان كميا السلوك من خلال الملاحظة المباشرة تجميد من قبل المجربون الإنسان. ومن المتوقع أن تنتج موثوق بها، نتائج مستقرة عبر الملاحظات ومجرب المدربين تدريبا جيدا. ومع ذلك، وهذه الطريقة تنطوي على المشاكل المحتملة، مثل الاختلافات في طريقة الرصد، والتحيز ضد مراقب، وأخطاء بسيطة الكمي، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج مباشرة من المجربون مستقلة ومختبرات مختلفة. كما تم استخدام نظام قياس الكمبيوتر المستندة إلى photobeam الآلي 26،30-32. ومع ذلك، فإن هذا النظام يقدم أيضا المشاكل المحتملة في قياس السلوكيات تجميد. بسبب ترتيب الاستشعار، قد يكون هذا النظام غير قادر على الكشف عن الحركات رأس صغير من شأنه أن typicaLLY أن سجل باسم 'نشطة' من خلال الملاحظة البشرية. بالإضافة إلى ذلك، يرتجف خلال تجميد يمكن اعتبارها nonfreezing لأنه عندما لوحظ على تجميد الحيوان، انقطاع متقطع في photobeam نتيجة ليرتجف. كطريقة بديلة، وقد وضعت المؤتمتة الصورة والفيديو تحليل النظم 17-20،37،38. Anagnostaras وآخرون 37 وصفت بعض الأنظمة مع برامج تحليل الصور التي لها صلاحية جيدة ويسجل تجميد جيدا 17،20،37-38. ومع ذلك، فإن معظم هذه النظم والبرامج تحليل يتعين الحصول عليها من شركات تجارية ومكلفة عادة. قمنا بتطوير برنامج حاسوبي ImageFZ لتحليل السلوك تجميد، ويتم توزيع هذا البرنامج كبرنامج البرمجيات الحرة. ImageFZ بالكشف عن الماوس بوصفه مجموعة من بكسل (الجسيمات) ويميز حركة الماوس خفية باسم 'تجميد' أو 'غير تجميد' اعتمادا على كمية منمساحة المناطق غير المتداخلة بين الجسيمات من كل زوج من الصور التوالي. كما هو مبين في نتائج ممثل، والقياسات باستخدام برنامج ImageFZ تتسق مع أو أكثر دقة من التي تم الحصول عليها باستخدام وسائل أخرى. وبالتالي، فإن البرنامج تلقائيا ImageFZ يقيس السلوك الذي نحكم المراقبين الإنسان عن تجميد باستخدام معايير محددة. بالإضافة إلى ذلك، البرنامج بحساب ImageFZ سافر مسافة (سم) قبل وأثناء وبعد التعرض footshock، وتسهيل إجراء تقييم للحساسية الصدمة وتحليل سلوك التجمد.
توجد اختلافات منهجية بين المختبرات. قد يؤدي هذه الاختلافات في الصعوبة في مقارنة البيانات بين المختبرات وفي تكرار النتائج في مختبرات مختلفة. للحصول على بيانات أكثر استقرارا وقابلة للمقارنة، فمن الضروري لتوحيد بروتوكول الاختبار قدر الإمكان. نظام تحليل مع ImageFZ يؤدي إلى أتمتة إجراءات الاختبار، والتي يمكن أن تسهم فيتوحيد البروتوكولات المستخدمة في المختبرات.
يجب النظر في العديد من الاستجابات السلوكية عند تحليل سلوك التجمد. الأولى، عندما يواجه وضعا الحيوانات خوفا، فإنها قد الفرار بدلا من تجميد 39. فرار هي واحدة من الاستجابات الخوف، وسوف يؤدي إلى حدوثه التقليل ذاكرة الخوف. الثانية، قد تجميد تعتمد على مستوى النشاط العام، ومستوى النشاط في الفئران التجريبية والضابطة يحتاج إلى دراسة. على سبيل المثال، على الرغم من أن الفئران التي تفتقر إلى مستقبلات أستيل المسكارينية M1 أظهرت انخفاض مستويات تجميد مقارنة البرية من نوع الفئران، أشارت الاختبارات السلوكية المختلفة التي يمكن أن تعزى النتائج إلى النمط الظاهري على فرط النشاط بدلا من ضعف ذاكرتهم 18. ImageFZ بحساب المسافة (سم) سافر من الموضوعات. تتوفر لفحص ما إذا كان أو لا وجود اختلافات في مستويات النشاط العام بين الموضوعات البيانات. إذا كان هناك فرق في المجموعةسافر مسافة نهج واحد ممكن لهذه المشكلة هو أن تنظر سافر المسافة خلال دقيقة 2 الأولى من التدريب مثل النشاط الأساسي واستخدام نسبة القمع (قمع نسبة = (نشاط أثناء الاختبار) / (النشاط خلال خط الأساس + النشاط خلال الاختبار)) باعتباره المؤشر الثانوي من الخوف 17،40. أخيرا، وجود اختلاف في حساسية الألم، الأمر الذي أدى إلى تغييرات في التفاعل إلى footshock الكهربائية، إن وجدت، قد يؤدي إلى تغيرات في السلوك التجمد. يحسب ImageFZ أيضا سافر مسافة (سم) بالتفصيل من 2 ثانية قبل التعرض لfootshock 2 ثانية إلى 2 ثانية بعد تعرضها (لمدة 6 ثانية)، والتي يمكن استخدامها بمثابة مؤشر للحساسية footshock.
وقد تم تطوير أنظمة الفيديو تحليل لقياس السلوك تجميد البيضاء، السوداء، آغوطي، وتمييع الفئران البني. يستخدم ImageFZ صينية الطابق الأسود أسود وشبكات لدراسة الفئران البيضاء (انظر الشكل 1B). مصنوعة من شبكات أسود SPECI معالجة حليف المعادن مع الطلاء الأسود المطلي ولها الموصلية الكهربائية مماثلة لتلك التي من شبكات معدنية noncoated، التي تستخدم عادة لالفئران السوداء. ImageFZ أيضا يحلل السلوك التجمد في الفئران والقوارض الأخرى من خلال إدخال تعديلات على المعلمات البرنامج. في الإصدار الحالي من ImageFZ، يتم تسجيل السلوك للموضوع باستخدام كاميرا الفيديو من الجدار العلوي لتحليل التجمد. ImageFZ ويمكن أيضا أن تستخدم في انشاء حيث يتم التقاط الصور من جانب الغرفة. بالإضافة إلى ذلك، تسيطر على ImageFZ بحد أقصى 4 أجهزة. هذه الميزة تسمح للباحث لدراسة الفئران في وقت واحد 4، وتوفير الوقت والحد من التأثيرات المحتملة من الاختلافات في وقت تنفيذ كل موضوع واختبار النظام على السلوك. وبالتالي، ImageFZ يبسط إجراءات اختبار وتحليل سلوك تجميد، ويسهل هذا البرنامج اختبار بعدد أقل من العمالة ودون أي تدريب للتجارب السلوكية.
e_content "> في المختبر Miyakawa، قمنا بتقييم أكثر من 110 سلالات من الفئران المعدلة وراثيا والبرية من نوع الفئران التحكم في الخوف تكييف اختبار السياقية وملقن باستخدام نظام تحليل الفيديو لتوضيح آثار جين معين على التعلم والذاكرة 41-42 لقد حصلنا على مجموعة كبيرة من البيانات الخام لأكثر من 5،000 الفئران البيانات الخام التي تم استخدامها للالمقالات والبحوث المنشورة 4-16 مدرجة في "قاعدة ماوس النمط الظاهري 'كقاعدة بيانات العام (URL:. العنوان التالي: / / www.mouse-phenotype.org/). وتنص المادة الفيلم على معلومات مفصلة بشأن تفاصيل الإجراء التجريبي لدينا، ويشجع على فهم حالة الاختبار.Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم الحصول على بعض البيانات التي تظهر هنا في مختبر الدكتور جاكلين N. كراولي في المعهد القومي الأميركي للصحة العقلية ونود أن نشكرها على إتاحة الفرصة لنا لإظهار البيانات في ورقة. نشكر أيضا كازو ناكانيشي لمساعدته في تطوير برنامج للImageFZ التحليل السلوكي. وأيد هذا البحث من قبل منحة في والمعونة للبحوث العلمية (B) (21300121)، منحة في والمعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكرة (شبكة الشامل علوم الدماغ) من وزارة التربية والتعليم والعلوم والرياضة والثقافة في اليابان ، منح من مركز اليابان Neuroinformatics (NIJC)، والمنح المقدمة من كريست اليابان العلوم والتكنولوجيا وكالة (JST).
Materials
| ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
| Conditioning chamber | O'Hara & co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
| Cued test chamber | O'Hara & co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
| Interface | O'Hara & co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
| Scrambled shock generator | O'Hara & co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
| Shock grid tester (ammeter) | O'Hara & co., Japan | SG-T | |
| USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
| Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
| Soundproof room | O'Hara & co., Japan | CL-4210 | |
| Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |
Riferimenti
- Crawley, J. N. . What’s wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , (2007).
- Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
- Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
- Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
- Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
- Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
- Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
- Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
- Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
- Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
- Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
- Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
- Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
- Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
- Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
- Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
- Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
- Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
- Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
- Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
- Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
- Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
- Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
- Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).
Citazione di questo articolo
Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. J. Vis. Exp. (85), e50871, doi:10.3791/50871 (2014).