طرق لتعديل وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الكبار
Summary
وصفت وسائل للتلاعب وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. ويرد بروتوكول مفصلة لاختبار تعتمد على التلفيف المسنن السلوكية (وهو ما يسمى نمط المكاني فصل بارنز متاهة) للتحقيق في نتائج المعرفية في الفئران. هذا الأسلوب من شأنه أن يساعد أيضا تمكين التحقيقات في إعدادات التجريبية الأخرى.
Abstract
الحصين يلعب دورا محوريا في تشكيل وترسيخ ذكريات العرضية، والتوجه المكاني. تاريخيا، تم استعراض الحصين الكبار كمنطقة تشريحية جامدة جدا للدماغ الثدييات. ومع ذلك، فقد أظهرت النتائج الأخيرة التي التلفيف المسنن لقرن آمون هو مجال اللدونة هائلة في البالغين، والتي تنطوي ليس فقط إدخال تعديلات على الدوائر العصبية الموجودة، ولكن أيضا تكوين الخلايا العصبية الكبار. وينظم هذا اللدونة عن طريق الشبكات النسخي المعقدة، التي عامل النسخ NF كيلوبايت يلعب دورا بارزا. لدراسة والتلاعب تكوين الخلايا العصبية الكبار، نموذج الفأر وراثيا لتثبيط الدماغ الأمامي محددة العصبية النشاط NF كيلوبايت يمكن استخدامها.
في هذه الدراسة، وصفت وسائل لتحليل الخلايا العصبية NF كيلوبايت تعتمد، بما في ذلك جوانبه الهيكلية وموت الخلايا المبرمج العصبية وانتشار السلف، وأهميتها المعرفية، whicتم تقييم ح تحديدا عبر التلفيف المسنن (DG) التي تعتمد على اختبار السلوكية، ونمط المكاني فصل بارنز متاهة (SPS-BM). بروتوكول SPS-BM يمكن تكييفها لمجرد استخدام مع النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا أخرى مصممة لتقييم تأثير جينات معينة على تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. علاوة على ذلك، SPS-BM يمكن استخدامها في إعدادات التجريبية الأخرى التي تهدف إلى التحقيق والتلاعب التعلم DG-تعتمد، على سبيل المثال، وذلك باستخدام وكلاء الدوائية.
Introduction
وجوديا، وقرن آمون هو واحد من أقدم الهياكل التشريحية في الدماغ المعروفة. أنها مسؤولة عن المهام المعقدة المتنوعة، مثل وظائف محوريا في تنظيم الذاكرة طويلة المدى، والتوجه المكاني، وتشكيل وتوطيد الذاكرة منها. تشريحيا، ويتألف من طبقات الحصين الخلايا الهرمية (الطبقة الهرمية) بما في ذلك قرن آمون (CA1، CA2، CA3، وCA4) والمناطق التلفيف المسنن (التلفيف المسنن)، الذي يحتوي على الخلايا الحبيبية وعدد قليل من الأسلاف العصبية داخل منطقته جزئي التحبب . المشروع الخلايا الحبيبية تجاه المنطقة CA3 عبر ما يسمى الألياف المطحلب (محاور الخلايا الحبيبية).
حتى نهاية القرن الماضي، وكان يعتقد أدمغة الثدييات الكبار ليكون جهازا ثابتة تفتقر إلى اللدونة الخلوية وتكوين الخلايا العصبية. ومع ذلك، خلال العقدين الماضيين، كمية متزايدة من الأدلة يدل بوضوح على تكوين الخلايا العصبية الكبار التي تجري في ما لا يقل عنمناطق الدماغ، وهما منطقة subventricular (SVZ) والمنطقة جزئي التحبب من قرن آمون.
لدينا دراسات سابقة، وتلك من المجموعات الأخرى، أظهرت أن عامل النسخ NF كيلوبايت هي واحدة من المنظمين الجزيئية الحاسمة لتكوين الخلايا العصبية الكبار، وأن نتائج إلغاء التنظيمات في قرن آمون العيوب الهيكلية الحادة وإدراكيا 1-6. NF كيلوبايت هو اسم عام لعامل النسخ محرض تتألف من مجموعات مختلفة من مثنوي خمس مفارز الحمض النووي ملزم: P50، P52، ج، الرطوبة، RelB، وP65 (RELA)، وهذه الأخيرة ثلاثة من التي لديها المجالات transactivation. داخل الدماغ، الشكل الأكثر وفرة وجدت في السيتوبلازم هو مغاير للP50 P65 والتي يتم الاحتفاظ بها في شكل غير نشط من قبل المانع من كابا B (IκB) البروتينات.
لدراسة ومعالجة مباشرة تكوين الخلايا العصبية NF كيلوبايت يحركها، ونحن نستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا لتمكين تثبيط بسيطة من كل من subun NF كيلوبايتلها، وتحديدا في الدماغ الأمامي 7 (انظر الشكل 1). لهذا الغرض، ونحن عبور لدت-خطوط الماوس المعدلة وراثيا التالية، IκB / – و-/tTA. تم إنشاء خط باستخدام متحولة السلبية عبر المهيمن NF-كيلوبايت المانع IκBa (فائقة قامع IκBa-AA1) 8 – وIκB المعدلة وراثيا /. وعلى النقيض من النوع البري IκBα، IκBα-AA1 اثنين من بقايا سيرين تحور إلى alanines (V32 V36 و)، والتي تعيق الفسفرة وتدهور proteasomal لاحقة من المانع. للعصبون الدماغ الأمامي محددة التعبير عن IκBa-AA1-التحوير، IκB / – تم الفئران ولدت المتبادل مع الفئران بايواء كيناز الكالسيوم كالمودولين التي تعتمد IIα (CAMKIIα) المروج التي يمكن أن تكون مدفوعة من قبل التتراسيكلين عبر المنشط (TTA) 9.
P65 الفئران خروج المغلوب لها النمط الظاهري الجنينية قاتلة بسبب موت الخلايا المبرمج الكبد ضخمة 10، وبالتالي فإن النهج هو موضح هنا يوفر طريقة أنيقةللتحقيق في دور NF كيلوبايت في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة والكبار.
وقد وصفت الاختبار السلوكية الكلاسيكية لدراسة التعلم والذاكرة المكانية في 1980s من قبل ريتشارد موريس، وهو اختبار المعروفة باسم موريس المياه متاهة (MWM) 11. في هذا المجال المفتوح المياه متاهة، الحيوانات تتعلم من الفرار من المياه مبهمة على منصة مخفية على أساس الميول وخارج المتاهة العظة. متغير الجافة من MWM هو ما يسمى متاهة بارنز (BM) 12. هذا الاختبار يستخدم لوحة دائرية مع 20 حفرة دائرية رتبت على الحدود من لوحة، مع واحد ثقب يعرف بأنه مربع الهروب، والعظة من خارج المتاهة البصرية لتحديد اتجاهاتها. كلا نماذج تجريبية تعتمد على سلوك طيران الناجمة عن القوارض سيصدره النفور من الماء، أو مفتوحة، ومساحات مضيئة الزاهية. الاختبارين السماح بإجراء تحقيق من التوجه المكاني، وأداء الذاكرة ذات الصلة. على الرغم من أن الحصين يلعب دورا العامة والأساسية في تشكيل الذاكرة المكانية، ص الحصينegions تشارك تختلف تبعا لاختبار تطبيقها. الذاكرة اختبارها في BM تنشأ من نشاط الخلايا العصبية بين القشرة enthorinal (EC) والخلايا العصبية الهرمية الموجودة في CA1-منطقة قرن آمون دون مساهمة DG 13-16. على وجه الخصوص، BM الكلاسيكية تعتمد بشكل رئيسي على الملاحة عبر الممر-الصدغي ammonic الأحادي المشبك من EC الثالث لCA1 لEC خامسا الأهم من ذلك، DG تشارك بشكل حاسم في ما يسمى نمط الاعتراف المكانية 17، وهو ما يعني ضمنا ليس فقط معالجة المعلومات البصرية والمكانية، ولكن أيضا تحويل بيانات أو ذكريات مماثلة في متباينة، تمثيلات غير المتداخلة. هذه المهمة تتطلب الدوائر ثلاثي متشابك وظيفية من EC DG الثاني للCA3 لCA1 وEC السادس، والتي لا يمكن اختبارها في BM 15.
للتصدي لهذه التحديات، ونحن قد وضعت SPS-BM بمثابة اختبار لاختبار السلوكية على وجه التحديد التي تعتمد على التلفيف المسنن في الأداء الإدراكي المشتركالحيوانات ntrol، وفي IκB / TTA نموذج فائقة قامع التالية NF كيلوبايت تثبيط. الأهم من ذلك، وعلى النقيض من MWM أو BM، يمكن للSPS-BM تكشف العجز السلوكية الناتجة عن انخفاض القيمة خفية من الخلايا العصبية. منذ المكانية ونمط الفصل يعتمد بشكل صارم على دائرة وظيفية بين EC II وDG وCA3 وCA1 وEC السادس، وهذا الاختبار هو حساسة للغاية للتغيرات المحتملة في تكوين الخلايا العصبية، إدخال تعديلات على مسار الألياف المطحلب أو تغيرات في توازن الأنسجة داخل DG.
من الناحية الفنية، ويستند انشاء الاختبار لدينا في الدراسة التي Clelland وآخرون، حيث تم اختبار نمط الفصل المكاني باستخدام خشبية 8 الذراع ذراع شعاعي المتاهة (RAM) 19. لدينا في تعديل مجموعة المتابعة، تم استبدال ثمانية السلاح من قبل سبع متطابقة المنازل الغذاء الأصفر. وباختصار، فإن الأساليب هو موضح هنا، بما في ذلك تحليل (DCX +) الخلايا، معربا عن doublecortin داخل الحصين، والتوقعات الألياف المطحلب، خلية العصبية دياته وعلى وجه الخصوص قدمت SPS-BM هنا، يمكن تطبيقها على التحقيقات في نماذج الماوس الأخرى دمج الجينات المحورة التي لها تأثير على تكوين الخلايا العصبية الكبار. ويمكن أن تشمل التطبيقات مزيد من الدراسة من وكلاء الدوائية وقياس أثرها على DG والمكانية فصل النمط.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكوين الخلايا العصبية الكبار، وإمكانية التلاعب بها عن طريق تثبيط NF كيلوبايت في الخلايا العصبية، وتنشيط في وقت لاحق عبر الدوكسيسيكلين، ويوفر نظام رائعة للتحقيقات في الخلايا العصبية في الدماغ حديثي الولادة والكبار، وكذلك في دي وإعادة توليد الخلايا العصبية . جمال هذا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أنجيلا Kralemann-كولر للدعم التقني ممتازة. تم تنفيذ العمل التجريبي الموصوفة هنا في مختبرنا وكان مدعوما من المنح من مجلس البحوث الألمانية (DFG) لCK وBK ومنحة من وزارة البيئة الألمانية للبحوث والتعليم (BMBF) إلى BK.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
Riferimenti
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
- Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
- Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
- Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
- Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
- Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
- Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
- Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
- Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
- Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
- Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
- Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
- Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. . Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
- Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
