Métodos para el estudio de los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos en<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Enfoques para probar los efectos de los fármacos antipsicóticos (APD) en Caenorhabditis elegans se demuestran. Los ensayos se describen para las pruebas de efectos del fármaco sobre el desarrollo y la viabilidad y sobre la tasa de bombeo de la faringe. Estos métodos se aplican también para los experimentos farmacogenéticos con clases de fármacos diferentes a APD.
Abstract
Caenorhabditis elegans es un organismo genético simple susceptible a gran escala de avance y retroceso genéticos pantallas y pantallas genéticos químicos. El C. elegans genoma incluye fármaco potencial antipsicótico (APD) objetivos conservadas en los seres humanos, incluidos los genes que codifican las proteínas necesarias para la síntesis de neurotransmisores y de la estructura y la función sináptica. Exposición APD produce una demora y / o mortalidad en los nematodos en el desarrollo de una manera dependiente de la concentración. Estos fenotipos son causados, en parte, por la inhibición inducida por APD de faríngea de bombeo 1,2. Por lo tanto, el fenotipo de desarrollo tiene una base neuromuscular, lo que es útil para estudios de farmacogenética de los neurolépticos. Aquí demostramos procedimientos detallados para probar los efectos de APD sobre el desarrollo del nematodo y el bombeo de la faringe. Para el ensayo de desarrollo, los embriones sincronizados se colocan en medio de crecimiento de nematodos (NGM) placas que contienen APD, y las etapas de desarrollo de Animales son entonces marcados diaria. Para el ensayo de velocidad de bombeo de la faringe, protagonizaron los animales adultos jóvenes se ponen a prueba en placas NGM contienen APD. El número de bombas faríngeas por unidad de tiempo se registra, y se calcula la tasa de bombeo. Estos ensayos se pueden usar para el estudio de muchos otros tipos de moléculas pequeñas o incluso moléculas grandes.
Introduction
Caenorhabditis elegans es un organismo genético simple susceptibles de pantallas genéticos directo e inverso a gran escala y pantallas genéticos químicos. C. elegans es sensible a un amplio espectro de compuestos bioactivos y por lo tanto se ha utilizado con éxito para definir los mecanismos de acción de una variedad de tales compuestos. Por ejemplo, compuestos bioactivos estudiados usando la farmacogenética gusano incluyen agonistas del receptor de acetilcolina (por ejemplo, levamisol, nicotina, morantel, y pirantel), anestésicos (por ejemplo, halotano), cafeína, inhibidores de la colinesterasa (por ejemplo, el aldicarb, LANNATE, y triclorfón), fluoruro, el GABA-relacionados compuestos (por ejemplo, GABA y muscimol), ivermectina, paraquat, ésteres de forbol y fármacos relacionados con la serotonina (por ejemplo, la serotonina y imiprimine) 3. Además, C. elegans se ha utilizado para pantallas de molécula pequeña a gran escala, lo que permite el descubrimiento de nueva compuesto bioactivos y la identificación de dianas genéticas nuevas 4.
El C. elegans genoma incluye fármaco potencial antipsicótico (APD) objetivos conservadas en los seres humanos, incluidos los genes que codifican las proteínas necesarias para la síntesis de neurotransmisores y de la estructura y función sináptica 5. Por lo tanto, C elegans neurogenetics y métodos ofrecen la neurobiología para descubrir nuevos mecanismos moleculares de la acción de la APD. En los nematodos, la exposición APD en el desarrollo temprano produce retraso en el desarrollo, y en concentraciones más altas, la letalidad de 2,6. Exposición APD durante la edad adulta produce fenotipos conductuales. Por ejemplo, la exposición a la clozapina inhibe la locomoción y el bombeo faríngeo y mejora la postura de huevos 1,2,7.
Retraso en el desarrollo inducido por APD y letalidad son los fenotipos de gran alcance para las pantallas de genética química a gran escala. Estos fenotipos son complejos en la medida en que es probable que tengan más de un basi celulares y genéticoss. Por lo tanto, se espera que tales pantallas genéticas para producir una variedad de dianas de medicamentos indirectos. Sin embargo, nuestro laboratorio ha realizado candidatos pantallas de genes y una pantalla de RNAi de todo el genoma de los supresores de retraso en el desarrollo inducido por APD y la letalidad y ha genes que probablemente codifican blancos directos, incluyendo la dopamina, la insulina y los receptores nicotínicos de la acetilcolina 2,8 recuperado con éxito. Pantallas genéticas basadas en los comportamientos inducidos por el APD en el adulto también han conducido a la identificación de los objetivos de APD novedosas, y ahora estamos validando dianas de las pantallas tanto de desarrollo y de comportamiento en los mamíferos 7. Por lo tanto, un enfoque genético químico de invertebrados para descubrir nuevos mecanismos moleculares de acción de APD parece ser factible 5,8.
El C. elegans faringe es un órgano que incluye 20 neuronas, las células musculares 20, y 20 células accesorias, envueltos por una membrana basal. Similar al corazón de los mamíferos, la faringe es un autónomaND constantemente Bombas de alimentación desde el medio ambiente externo 9. La inhibición de la velocidad de bombeo de la faringe compromete la absorción de los alimentos, y por lo tanto las mutaciones o medicamentos que inhiben la faringe de bombeo causa retraso en el desarrollo o la detención 9. APD inhiben la velocidad de bombeo de la faringe, lo que representa, en parte, por sus efectos sobre el desarrollo y viabilidad 1,2. Aquí, nosotros usamos la clozapina APD atípica como ejemplo para demostrar los ensayos de medicamentos para el desarrollo del nematodo y el bombeo de la faringe.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación, describimos métodos para probar los efectos de la APD sobre el desarrollo y el comportamiento de C. elegans. DMSO o etanol se usa para disolver la clozapina, ya que el fármaco es relativamente insoluble en agua. Debido a que los disolventes se han reportado para afectar C. elegans biología 12, DMSO-solas o grupos de control de etanol por sí sola, son esenciales. La concentración más alta de DMSO utilizada en nuestros ensayos es hasta 3%, que no tiene un efecto obvio so…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por un premio de Desarrollo Científico Clínico de los NIH K08NS002083, un Instituto de Investigación Shervert Frazier Grant, y un premio Young Investigator NARSAD a Edgar A. Büttner.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
Riferimenti
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