Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l'hippocampe
Summary
précipitation au phosphate de calcium est une méthode pratique et économique pour la transfection de cellules en culture. Avec l'optimisation, il est possible d'utiliser cette méthode sur des cellules difficiles à transfecter comme les neurones primaires. Ici, nous décrivons notre protocole détaillé pour le phosphate de calcium transfection de neurones de l'hippocampe co-cultivés avec des cellules astrocytes.
Abstract
précipitation au phosphate de calcium est une méthode pratique et économique pour la transfection de cellules en culture. Avec l'optimisation, il est possible d'utiliser cette méthode sur des cellules difficiles à transfecter comme les neurones primaires. Ici, nous décrivons notre protocole détaillé pour le phosphate de calcium transfection de neurones de l'hippocampe co-cultivés avec des cellules astrocytes.
Introduction
Neurones primaires sont l'un des types cellulaires les plus difficiles à transfecter car ils sont post-mitotiques et sont très sensibles aux changements des micro-environnement. Il existe quatre types de méthodes pour l'expression de gènes exogènes et ARN court en épingle à cheveux (shRNA) dans ces cellules une couramment utilisés. Chacun a ses propres avantages et inconvénients. Par exemple, l'électroporation est généralement effectuée sur les neurones fraîchement isolés 2, les cellules doivent être transférés dans des cuvettes pour la transfection. infection par le virus peut généralement atteindre un rendement très élevé 3, mais il est plus de main-d'œuvre et risqué pour les opérateurs. Beaucoup de réactifs de transfection médiée par un lipide sont disponibles dans le commerce, avec des degrés variables de succès dans les neurones et les différents niveaux de cytotoxicité.
la transfection au phosphate de calcium représente une méthode pratique et économique pour l'introduction de gènes étrangers dans les neurones. La méthode a été utilisée pour la première à introduire de l'ADN de l'adénovirus dans cel mammifèresls par Graham et Van Der Eb (1973) 4. La transfection a été réalisée en mélangeant du chlorure de calcium avec de l'ADN recombinant dans un tampon de phosphate. Ceci permet la formation de phosphate de l'ADN / de calcium précipite, qui, en cas de chute progressivement sur une monocouche de cellules, d'adhérer à la surface de la cellule, sont repris par endocytose et finalement pénétrer dans le noyau 5. Ce processus conduirait à l'expression de gènes étrangers introduits dans la cellule cible. Efficacité typiques de calcium gamme de transfection de phosphate entre 0,5-5% 6-8. Cependant, avec une optimisation soigneuse et constante de l'exécution du protocole expérimental, il est possible d'atteindre une efficacité de transfection de près de 50%. Nous décrivons ici notre protocole détaillé pour la transfection au phosphate de calcium de neurones hippocampiques primaires, qui sont co-cultivées avec des cellules astrogliales dans un format en sandwich 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya plusieurs paramètres clés qui doivent être soigneusement contrôlée pour transfections toujours réussies 10,11. Le paramètre le plus critique pour la transfection au phosphate de calcium est la valeur de pH de 2 x HBS, qui dans nos mains varie habituellement entre 7.10 à 7.15. Nous vous conseillons d'effectuer trois lots de stocks avec des valeurs de pH par pas de 0,05 pour tenir compte de la différence entre les pH-mètres. Autrement, le kit de transfection mammifère Clontech fournit 2x HB…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par NIH NS065183 et des fonds de démarrage de l'École de médecine de Rutgers Robert Wood Johnson.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
Riferimenti
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