分离，培养和成像胎儿胰腺细胞集群

在开始之前附注： 人类胎儿胰腺是从出生缺陷研究实验室，华盛顿大学（西雅图，华盛顿州，美国）谁收获的组织中获得。从捐助者通过该中心获得了组织捐赠的样本，储存和使用的知情同意书。该协议同意声明以书面形式提供，加州大学圣地亚哥分校人类研究保护计划批准整项研究（协议＃081237XT）。 它是必不可少的，以保持两者的胎儿胰腺和容器的整个过程中保持在冰上胰腺。解离和消化应尽可能快执行。 发送，其中从缓冲存储和胰腺的传输而获得的胎儿胰腺诊所。 （RPMI-1640 +10％正常人血清（NHS），300mM的海藻糖SG，青霉素/链霉素，两性霉素B和）。 人胎儿胰腺1。解剖溶解5毫克在HBSS RT胶原酶XI，得到2.5毫克/毫升的最终浓度。过滤灭菌的溶液用0.22微米注射器过滤器进入无菌（高压灭菌）的闪烁瓶中，并储存于4℃。在组织培养罩，载2的无菌培养皿中，无菌的小坩埚中（如果坩埚是不可用时，一个小烧杯可被取代），无菌剪刀，镊子和。加入2毫升的HBSS一个培养皿洗胰腺。吸出的液体从含有胎儿胰腺，留下大约1毫升管中。 除去用钳子胰腺成60毫米的培养皿无HBSS。对于这些实验，是从新鲜的胰腺有妊娠年龄从9到23周胎儿产生IC卡。从胰腺在较早年龄gestionational隔离是困难的，由于胰腺的大小。该协议很可能适用于胎龄超过23周，但收购的pancreata后这段时间，是因为联邦（美国）的限制很难。偶尔，胎儿胰腺到达与脾，脂肪，或附着从原始解剖结缔组织。多余的组织很容易可见的肉眼和应该从起始协议之前胰腺被删除。 冲洗胰腺在冷HBSS中（约0.5毫升），在培养皿中的最小体积。 将清洗胰腺使用无菌镊子和地点在一个冰桶，小的无菌坩埚。放置在坩埚中的保持器为50ml的离心管中，并使用2对剪刀，大力切片胰腺几分钟。 （一般2-5分钟，但该时间依赖于组织的大小和硬度）。切割技术是非常重要的。在一个固定的位置只移动相反的把手握住剪刀的一侧。剪刀的技巧应该安放在坩埚底部。继续快速剪刀运动打破了胰腺成小件。所述组织的碎片越小越好胶原酶将工作。 加入1.5毫升的HBSS +的切碎了胰腺含有胶原酶和地点在水浴摇床设定为37℃，以200rpm的速度长达10分钟的小瓶中。第5分钟时，请勿检查一次更频繁。消化时间依赖于组织的质​​量，少至6分钟就足够了。终点是当颗粒小且均匀。 填写小瓶（10-15毫升）与冷的HBSS停止胶原酶活性。放置在冰上，并允许团块沉降10分钟。通常在这一点上，一些细胞死亡发生和DNA被释放到介质中。这可以使媒体的弦“;在这种情况下，添加100μl的DNA酶（10毫克/毫升的库存）到溶液中。 后在闪烁瓶中的组织已经结清10分钟，吸出离顶层离开它不到一半略满（7-8毫升）中。将细胞转移到15毫升锥形管，加入5 ml HBSS。离心5分钟，在300×g的。 吸出HBSS和悬浮细胞在含有RPMI-1640，GLUTAMAX，10％正常人血清（NHS），10毫摩尔HEPES PH值7.2，青霉素/链霉素，两性霉素B和5毫升媒体。板60毫米的培养皿。研究人员试图生成β细胞，肝细胞生长因子（10毫微克/毫升决赛）添加到媒体。此外，一些团体已经表明，补充培养基与肠促胰岛素激素GLP-1还增加β细胞28。细胞应留在暂停72小时聚集和形成IC卡。 经过72小时的悬浮液中，细胞可以被镀在人细胞系HTB9矩阵如前面29所描述的矩阵。无论生长条件，媒体应改为每48小时。 内分泌细胞增殖和成熟标记2。在IC卡中悬浮生长免疫，单层，或者在玻璃盖玻片为了测量细胞的增殖，进行12小时前，PFA固定在悬浮液中或粘附细胞或细胞的BrdU标记。的BrdU试剂1:100稀释并过滤灭菌的RPMI-1640，GLUTAMAX，10％NHS，10毫摩尔HEPES PH值7.0，青霉素/链霉素，两性霉素B和。 对于悬浮细胞：离心5分钟，在300 XG和吸出培养基。加入10 ml PBS中，在300×g离心并吸出洗IC卡，离心5分钟。如果IC卡将要石蜡包埋，请按照任择议定书3.1-3.17 对于贴壁细胞：取出培养基，并如上所述用PBS洗涤细胞。固定细胞20分钟，用4％PFA中于室温，然后用PBS洗两次。在这点上，所述板能缠绕用Parafilm并储存于PBS在4℃下长达1周。 孵育的细胞用0.2％的Triton-X 100的PBS在RT下10分钟。用PBS洗涤细胞两次，并应用封闭缓冲液（2％做nkey血清，2％牛血清白蛋白，50mM的甘氨酸1小时在PBS中稀释）。用工作缓冲液洗涤细胞（封闭缓冲液稀释后1:10）。稀释的抗体在工作缓存器。对于生长在玻璃盖玻片上的细胞，稀释的抗体在60微升的总体积。对于细胞的6孔培养皿，稀释抗体在600微升总体积。染色多个表位，抗体的鸡尾酒可能被应用。作为对照，使用IgG或预免疫血清代替特定的抗体。控制样品必须孵育来自相同物种的对照IgG作为正在使用的一抗。 孵育一抗为1.5小时，在室温或O / N在4°C。吸出第一抗体，并与工作缓冲液洗3次在RT。 稀释的第二抗体在1:200罗丹明和FITC标记的抗体，1:500 – 1:1000的Alexa的共轭抗体。要注意的是所有的次级抗体是光敏感是很重要的。盖上样品铝箔，以防止信号损失。孵育1小时，在室温。 可选：要可视化的细胞核，DAPI可以在1:500二级孵化过程中添加。这是用于蛋白质表达中的总的细胞群体的定量是有用的。 吸出的第二抗体，并与工作缓冲液洗3次在RT。对于生长在盖玻片上的细胞，轻轻提起盖玻片用钳子将其浸在缓冲;通过浸入在PBS中洗涤。在一个6孔板中生长的细胞，加入PBS洗并抽吸。在这一点上，他们准备在倒置显微镜下检查。 触摸盖玻片的边缘上轻轻一的Kimwipe摆脱多余的PBS。添加安装凝胶载玻片上滴和反转盖玻片上的幻灯片。通过抽吸去除多余的安装胶。点击盖玻片轻轻地用200μl的枪头，赶走气泡的背面。 在室温下干燥约20分钟，或O / N在4℃，并根据佛罗里达州考察uorescent或共聚焦显微镜。 从石蜡包埋的ICC蛋白3（可选）免疫荧光染色准备3％琼脂糖溶液，放冷至55-60℃。 转移的IC卡中温育悬浮到15ml锥形管中，并离心分离机以1500×g离心5分钟，在室温下进行。 从细胞中吸出培养基，用500μl的4％PFA中于室温10分钟，固定。不要混合颗粒，除非颗粒是非常大的。 用750微升PBS洗两次沉淀。像4％PFA，这种废物被认为是危险的，应该根据自己的机构的危险废物规范处置。 轻轻轻拂细胞沉淀松动，并添加150-200微升的琼脂糖下来的的15毫升锥形管的壁。 轻轻弹管混匀，但不要形成气泡。 允许凝固在4℃下5-10分钟。 使用21号针头撞出颗粒并将其放置在一个新的15毫升锥形管。 石蜡包埋和切片的制备上的幻灯片可以在现场用切片机或你的核心显微镜设备来完成。 Deparaffinize组织，水合物，并用水迅速洗。 添加0.2M的甘氨酸在室温30分钟以淬灭残留的醛。 每个2分钟，用PBS洗两次的幻灯片。 用于抗原修复，带来的10mM柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸过的热板。沉浸幻灯片在缓冲区中，等待它回来烧开，然后等待15分钟。 从电炉中取出烧杯中。等待大约40分钟的幻灯片在缓冲区中冷却。 与H 2 O洗两次的幻灯片，每次5分钟，用PBS洗两次的幻灯片，每次5分钟，以1小时的PBS 2％正常驴血清阻断。 孵育一抗，稀释至含0.2％的Triton X-100浓度正确工作缓冲区。通常，初级抗体孵育过夜，如果染色为转录因子和1.5小时，如果染色为激素，细胞增殖的标记物，和/或分化。 遵循上述步骤2.3-2.9。