טכניקת לימוד של פרוקים-רגליים וקהילות חיידקים בתוך רקמות עץ
Summary
We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.
Abstract
Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.
Introduction
רקמות השיפה וקליפה של עצי מחט הן מארח לאלפי אורגניזמים. Phloeophagy, ההאכלה ברקמות השיפה של הקליפה הפנימית, היא הרגל מזוהה בדרך כלל עם חיפושיות קליפה, woodborers, וכמה מינים של חסרי חוליות וחיידקים אחרים שחיות בתוך עצים 23 חיפושיות קליפה. (Coleoptera: חידקוניתיים) לפתח ולחיות בתוך השיפה פרט ל תקופות קצרות, כאשר מבוגרים מחפשים עצי מארח חדשים. ביום 31 בחיפושיות קליפה נחקרו רבות בשל ההשפעות הכלכליות שלהם על עצים 18,19, אבל תצפיות התנהגותיות ישירות של החרקים בתוך חומרי עץ היו מוגבלות. 4 יתר על כן, הגלריות נבנו על ידי חיפושיות קליפה הפך בית גידול למספר עצום של מינים. 11 מספרים עצומים של פטריות 30, חיידקי 3, קרדית 10,21, ונמטודות 16,19 יחד עם פרוקי רגליים טורפות וטפילות אחרים 22,24 מאכלסים את חומר השיפה. הטכניקות ניתנות כאןלאפשר להתבוננות ישירה בחיפושיות קליפה, קרדית, וborers העץ, כי בדרך כלל חיים בסביבות קורטיקליים. שינויים קלים בפרוטוקול יכולים להתבצע ללמוד פטריות וחיידקים.
חיפושיות קליפה ואורגניזמים סביבתיים ברקמות עץ נחקרו באמצעות "כריך השיפה." ניתן למצוא שימוש מוקדם של טכניקה זו בהיכרויות הספרות חזרה לשנת 1933, כאשר נעשה בו שימוש כדי לבחון את instars הזחל של חיפושית דאגלס-אשוח (Dendroctonus pseudotsugae). 2 כריך השיפה עבר נגזרות רבות כחומרים שונים הפכו זמינים. במקור, מכשיר זה מורכב מחתיכת השיפה הונחה בין שני לוחות זכוכית, צמודות זו לזו ברצועות של גומי. 2 מאוחר יותר, מהדק, קלטת, דבק, פלסטיק, וחומרים אחרים המשמשים לבנייה של הכריך. 13,14 , 15,17,26,28 הפרוטוקול המתואר כאן מציע שיפורים על פני כמה העיצובים האחרונים. לדוגמא, בהעבר, מיני מבחן היו נכנסו לצד של הכריך, בין הצלחות מזכוכית או מפלסטיק. זה הגביל את הבנייה של גלריות לכיוון אחד. השימוש של חורי כניסה בצלחת העליונה מאפשר חופש רב יותר למיני מבחן ליזום בניית גלריה טבעית. יתרון נוסף של הפרוטוקול שהוצג הוא העיצוב הפשוט שלה, אשר ניתן לבנות בקלות עם כמה כלים. השימוש בכריך השיפה אפשר לתצפיות ישירות של התנהגות האכלה, רבייה, התפתחות, ואינטראקציות של אורגניזמים שאחרת לא היו אפשריות. 1,5, 22 שיטה זו היא גם כלי מצוין לחינוך K-12 ומדע תוכניות ומציג.
יש כמה דקויות ביצירת כריך השיפה שקשה לפרש מאו לא דווח בכתבי יד. אנו מאמינים כי תיאור חזותי (כלומר, וידאו) של הייצור של כריך השיפה נחוץ ויהיהשל ערך למדענים ואנשי חינוך מעוניין ללמוד אורגניזמים phloeophagous. הפרוטוקול שלנו מספק דרך פשוטה וזולה כדי לצפות פרוקי רגליים, חיידקים, ואורגניזמים אחרים המאכלסים את רקמות השיפה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כריך השיפה מאפשר את ההקדמה והתבוננות של פרוקי רגליים, חיידקים, ואורגניזמים קטנים אחרים המאכלסים את רקמות השיפה. 1,7,8,9,17,18 טכניקה זו הביאה לתגליות חדשות והבנה טובה יותר של התנהגויות, life- תכונות היסטוריה, פיתוח, ואינטראקציות של אורגניזמים בתוך השיפה עץ. 1,5,10 פרוטוקול הכריך שתואר כאן היא היברידי של עיצובי עבר, ותספקנה כריך חסכוני כי הוא נבנה בקלות עם ציוד וחומרים מינימאליים. ניתן לעשות שימוש חוזר חתיכות הזכוכית, אקריליק, או פוליקרבונט, והחומרים מתכלים רק Parafilm והשיפה.
למרות שכל השלבים בפרוטוקול חשובים, צריכים להיות אחרי צעדים מסוימים אך ורק על מנת להבטיח את הרמה הגבוהה ביותר של הצלחה. ראשון, עץ צריך להיות ממוקם שיש לו חלק מגזעו חופשי, או חופשי יחסית, של סניפים. עצים שיש לו סניפים רבים קשים להתגלח ויהיה yכמה חתיכות ield קיימא השיפה, כמו בכל ענף יש לחתוך סביב בעת הסרת השיפה. בשלב הבא, חשוב למזער את החשיפה לאוויר של השיפה. אנחנו שמים במהירות כל פיסת השיפה בשקית עם ההסרה. ברגע ש05:57 חתיכות יוסרו, הם מועברים לתוך שקית אטום ואקום; אנו משתמשים ממיר מתח כדי להפעיל את אוטם את הסוללה רכב בתחום. אחרון, חיטוי חתיכות אקריליק וניקיון כללי בעת ביצוע פרוטוקול זה יאט את גידול פטריות בכריך. זה חשוב במיוחד לתצפיות ממושכות.
כפי שצוין לעיל, יש מגבלות של מנגנון כריך השיפה. מאז שכבת השיפה היא דקה, רק אורגניזמים קטנים שנשארים בהשיפה יכולים להיות מוחדרים הכריך. חרקים גדולים יותר כמו borers עץ (כלומר, Buprestid, מיני Cerambycid) יכול להיות מוצגים ונצפו לשלבים המוקדמים של מחזור החיים שלהם בשלבים. פרק זמן זה הוא מוגבל בדרך כלל לשני לשלושה שבועות; לאחר שלב זה הזחלים דורשים עץ עצה לשעמם להתגלמות. בניגוד לכך, לחיפושיות קליפה, במיוחד אלה בסוג IPS, מחזור חיים מלאים ניתן הזדווגות, בקיעת ביצה, האכלה, pupating, וeclosion לחיפושית בוגרת-כוללים נצפו. בשלב זה, את הכדאיות של הכריך בדרך כלל מותשת מהתייבשות ופטריות צמיחה. 28 בנוסף, מנגנון זה אינו מאפשר חרקים ליישב או לצאת מכריך השיפה בחופשיות ובאופן טבעי. 27
הפרוטוקול שלנו הוא גמיש במונחים של גודל, צורה, וסוג של השיפה משמש. מחקרים קצרים דורשים פחות חומר השיפה וגודל כריך וניתן לשנותם בהתאם. מינים מחטניים רבים שנוצלו כתורמי השיפה בכריך השיפה (למשל, אורן עץ אורן 12, דאגלס-אשוח 2, אשוחית 29, 27 Loblolly אורן, אורן לונגליף 27). חומרים בכריך יכולים גם להשתנות; עבור לשעברצלחות בשפע, זכוכית יכולות לשמש במקום אקריליק ואפוקסי או קלטת במקום Parafilm.
החלק הקשה ביותר של פרוטוקול זה הוא תהליך הסרת השיפה. עצים אחד ליד שני יכולים להיות שונים באופן קשה השיפה שלהם היא להסיר. כאשר עץ יש השיפה קשה, סבלנות היא קריטית. במקרים אלה, בזהירות לרוץ סכין בין העצה הקשה והשיפה הספוגית. תהליך זה מרגיש ממש כמו לפשוט את עור העץ.
כאשר ישלוט בטכניקת הכריך הבסיסית, שינויים בפרוטוקול יכולים לעזור לצרכימים ספציפיים בכושר. לדוגמא, על ידי השחזת הטכניקות נדרשו להסיר השיפה, ניתן להסיר חתיכות גדולות ומשמשות ליצירת כריכים גדולים יותר. כמו כן, ניתן לבצע שינויים כדי להתאים מכשירים ספציפיים, לדוגמא, חורים נוספים כדי לפקח על פליטה כימית (איור. 3 א), או להקליט או השמעת צלילים (איור. 3 ב). שינויים יכולים להתבצע כדי לאפשר לשימור חצי קבוע של השיפה ואיברההאיזמים, או לתצפיות זמניות של אורגניזמים שיכולים להיות מאוחר יותר לתת חופשי.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Eli Jensen, Stefano Padilla, and Kasey Yturralde for assistance, and Karen London and anonymous reviewers of the manuscript. We thank Jake Baker and Karla Torres for video footage. Funding was provided to R.W.H by the NAU School of Forestry and NAU Technology and Research Initiative Fund (TRIF).
Materials
| Draw blade | Big Horn Brand | 20265 | 11” blade |
| Fillet Knife | American Angler | 30530 | 9” blade |
| Polycarbonate | Nexan | GE-33 | 0.093 in. thickness |
| Parafilm M | Fisher Scientific | S37441 | 2” wide |
| Clamps | Pony Jaw Opening | 3201-HT-K | 4” x 1” |
| Vacuum Sealer | FoodSaver | V2840, | VacLoc vacuum |
| and bags | FSFSBF0742-015 | bags in rolls |
Riferimenti
- Aukema, B. H., Raffa, K. F. Behavior of adult and larval Platysoma cylindrical. (Coleoptera: Histeridae) and larval Medetera bistriata. (Diptera: Dolichopodidae) during subcortical predation of Ips pini (Coleoptera: Scolytidae). J Insect Behav. 17, 115-128 (2004).
- Bedard, W. D. The number of larval instars and the appropriate length of the larval stadia of Dendroctonus pseudotsugae. Hopk., with a method for their determination in relation to other bark beetle. J Econ Entomol. 26, 128-134 (1933).
- Bridges, J. R. Nitrogen-fixing bacteria associated with bark beetles. Microb Ecol. 7, 131-137 (1981).
- Cardoza, Y. J., Klepzig, K. D., Raffa, K. F. Bacteria in oral secretions of an endophytic insect inhibit antagonistic fungi. Ecol Entomol. 31, 636-635 (2006).
- Cardoza, Y. J., Moser, J. C., Klepzig, K. D., Raffa, K. F. Multipartite symbioses among fungi, mites, nematodes, and the spruce beetle, Dendroctonus rufipennis. Environ Entomol. 37, 956-963 (2008).
- Chen, H. -. F., Salcedo, C., Sun, J. -. H. Male mate choice by chemical cues leads to higher reproductive success in a bark beetle. Animal Behavior. 83, 421-427 (2012).
- Dodds, K. J., Graber, C., Stephen, F. M. Facultative intra guild predation by larval Cerambycidae (Coleoptera) on bark beetle larvae (Coleoptera: Scolytidae). Environmental Entomology. 30, 17-22 (2001).
- Franklin, R. T. A technique for studying the insect parasites of Dendroctonus frontalis. and other bark beetles (Coleoptera: Scolytidae). Journal of Georgia Entomology Society. 2, 43-44 (1967).
- Gries, G., Pierce, H. D., Lindgren, B. S., Borden, J. H. New techniques for capturing and analyzing semiochemicals for Scolytid beetles (Coleoptera: Scolytidae). J Econ Entomol. 81, 1715-1720 (1988).
- Hofstetter, R. W., Moser, J. C., McGuire, R. Observations of the mite Schizosthetus lyriformis. (Acari: Parasitidae) preying on bark beetle eggs and larvae. Entomology. News. 120, 397-400 (2009).
- Hofstetter, R. W., Klepzig, K. D., Coulson, R. Chapter 11: Mutualists and Phoronts of the Southern Pine Beetle. United States Dept. of Agriculture Forest Service, Southern Research Station General Technical Report SRS-140. , 161-181 (2011).
- Hofstetter, R. W., Dunn, D. D., McGuire, R., Potter, K. A. Using acoustic technology to reduce bark beetle reproduction). Pest Manag Sci. 70, 24-27 (2014).
- Hopping, G. R. Techniques for rearing Ips. De Geer (Coleoptera: Scolytidae). Can Entomol. 93, 1050-1063 (1961).
- Hougardy, E., Gregoire, J. -. C. Cleptoparasitism increases the host finding ability of a polyphagous parasitoid species, Rhopalicus tutela (Hymenoptera: Pteromalidae). Behav Ecol Sociobiol. 55, 184-189 (2003).
- Kaston, B. J., Riggs, D. S. Studies on the larvae of the native elm bark beetle. J Econ Entomol. 30, 98-108 (1937).
- Kinn, D. N. Life cycle of Dendrolaelaps neodisetus. (Mesostigmata: Digamasellidae), a nematophagous mite associated with pine bark beetles (Coleoptera: Scolytidae). Environ Entomol. 13, 1141-1144 (1984).
- Kinn, D. N., Miller, M. C. A phloem sandwich unit for observing bark beetles, associated predators, and parasites. USDA FS Res. Notes SO-269. , 3 (1981).
- Lieutier, F., Day, K. R., Battisti, A., Gregoire, J. -. C., Evans, H. F. . Bark and wood boring insects in living trees in Europe, a synthesis. , 569 (2004).
- Massey, C. L. The influence of nematode parasites and associates on bark beetles in the United States. Bulletin of the Entomology Society of America. 12, 384-386 (1966).
- Moser, J. C., Roton, L. M. Mites associated with southern pine bark beetles in. Allen Parish, Louisiana. Can Entomol. 103, 1775-1798 (1971).
- Mills, N. J. The natural enemies of scolytids infesting conifer bark in Europe in relation to the biological control of Dendroctonus. spp in Canada. Biocontrol News Information. 4, 305-328 (1983).
- Nagel, W. P., Fitzgerald, T. D. Medetera aldrichii. larval feeding behavior and prey consumption [Dipt.: Dolichopodidae]. Entomophaga. 20, 121-127 (1975).
- Paine, T., Raffa, K., Harrington, T. Interactions among scolytid bark beetles, their associated fungi, and live host conifers. Annu Rev Entomol. 42, 179-206 (1997).
- Reeve, J. D., Coulson, R. N., Klepzig, K. D. Predators of the southern pine beetle. Southern Pine Beetle II. , 153-160 .
- Reid, R. W. The behavior of the mountain pine beetle, Dendroctonus monticolae. Hopkins, during mating, egg laying and gallery construction. Can Entomol. 90, 505-509 (1958).
- Taylor, A. D., Hayes, J. L., Roton, L., Moser, J. C. A phloem sandwich allowing attack and colonization by bark beetles (Coleoptera: Scolytidae) and associates. J. Entomol. Soc. Amer. 27, 101-116 (1992).
- Yu, C. C., Tsao, C. H. Gallery construction and sexual behavior in the southern pine beetle, Dendroctonus frontalis. Zimm. (Coleoptera: Scolytidae). Georgia Entomology Society. 2, 95-98 (1967).
- Yturralde, K. The Acoustic Ecology of Bark Beetles and Bed Bugs. PhD. Dissertation. , 323 (2013).
- Wermelinger, B., Seifert, M. Analysis of the temperature dependent development of the spruce bark beetle Ips typographus (L.) (Col., Scolytidae). Journal of Applied Entomology. 122, 185-191 (1998).
- Whitney, H. S., Mitton, J. B., Sturgeon, K. B. Relationships between bark beetles and symbiotic organisms. Bark Beetles in North American Conifers. , 183-211 (1982).
- Wood, S. L. The bark and ambrosia beetles of North and Central America (Coleoptera: Scolytidae), a taxonomic monograph. , 1359 (1982).
