ميكروفلويديك على رقاقة رد الفعل التقاط-إضافة حلقية لشل حركة عكسية جزيئات صغيرة أو هياكل متعدد المكون للتطبيقات الاستشعار البيولوجي
Summary
ونحن نقدم وسيلة لالسريع، الشلل عكسها من جزيئات صغيرة والجمعيات جسيمات متناهية الصغر بين functionalized لسطح مأكل مثل الطحين الرنين (SPR) دراسات، وذلك باستخدام متسلسلة على رقاقة bioorthogonal الكيمياء إضافة حلقية والضد مستضد الالتقاط.
Abstract
طرق للتجميد السريع سطح الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا مع التحكم في التوجيه والكثافة الشلل ومرغوب فيه للغاية لجهاز الاستشعار البيولوجي وميكروأري التطبيقات. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم التساهمية bioorthogonal كفاءة عالية [4 +2] إضافة حلقية التفاعل بين العابرة للcyclooctene (TCO) و1،2،4،5-tetrazine (TZ) لتمكين الشلل ميكروفلويديك من الجزيئات TCO / TZ-derivatized . نحن نراقب هذه العملية في الوقت الحقيقي في ظل ظروف التدفق المستمر باستخدام سطح مأكل صدى (SPR). لتمكين الشلل عكسها وتوسيع نطاق التجريبية من سطح استشعار، ونحن الجمع بين القبض على عنصر مستضد الضد غير التساهمية مع رد فعل إضافة حلقية. من خلال تقديم بالتناوب TCO أو TZ الأنصاف إلى السطح الاستشعار، ومتعددة العمليات التقاط-إضافة حلقية هي الآن ممكنة على سطح استشعار واحد لتجميع والتفاعل على رقاقة دراسات من مجموعة متنوعة من هياكل متعددة المكونات. نحن طllustrate هذه الطريقة مع اثنين من تجارب مختلفة الشلل على شريحة وجهاز الاستشعار البيولوجي؛ جزيء صغير، AP1497 التي تربط ملزم FK506 بروتين 12 (FKBP12)، ونفس جزيء صغير كجزء من جسيمات متناهية الصغر بين functionalized الموضع يجمد و.
Introduction
ردود الفعل اقتران الكفاءة هي أدوات قيمة لربط الجزيئات النشطة بيولوجيا على الأسطح لمجموعة متنوعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. في الآونة الأخيرة، تم استخدام bioorthogonal سريع جدا [4 +2] إضافة حلقية التفاعل بين العابرة للcyclooctene (TCO) و1،2،4،5-tetrazine (TZ) لتسمية سطوح الخلايا والهياكل التحت خلوية، والأجسام المضادة والجسيمات النانوية 1 – 7 هنا، ونحن نستخدم [4 +2] إضافة حلقية رد فعل في تركيبة مع التقاط المستضد / الأجسام المضادة (GST / مكافحة GST) لعكسها توليف على رقاقة هياكل متعددة المكونات لسطح مأكل مثل الطحين الرنين (SPR) تحليل التفاعل ورصد العملية في الوقت الحقيقي (الشكل 1). 8،9 تجدر الإشارة إلى أن استراتيجية التقاط-إضافة حلقية يمكن تجديد السطح باستخدام بروتوكول المعمول بها. 8 ونتيجة لذلك، والتجمع من السطوح استشعار مستقر مع السيطرة على التوجه يجند والكثافة لمجموعة متنوعة من مقايسة جديدة تنسيقات من الممكن الآن. باستخدامهذه الاستراتيجية ونحن لشرح تجميد الجزيئات الصغيرة TCO / TZ derivatized وتميز معدلات إضافة حلقية في مجموعة متنوعة من الظروف العازلة. اخترنا التفاعل معروفة بين FKBP12 وAP1497 جزيء التي تربط FKBP12 10-12 كمثال للتحقق من أن استراتيجية التقاط-إضافة حلقية يحافظ على قدرة جزيء صغير للتفاعل مع هدفه عندما تعلق إما مباشرة لمستضدات GST ثبتوا أو يجمد النانوية (NPS).
هذا الأسلوب يوفر العديد من الفوائد. أولا، تجميد عكسها من جزيئات صغيرة على رقائق استشعار هو ممكن الآن. الثانية، TCO / TZ تجميد جزيئات صغيرة يمكن أيضا دراسات التفاعل خالية من التسمية التي عكس اتجاه الدراسات SPR الكنسي، ويمكن تقديم وجهة نظر مكملة للتفاعل ملزمة. الثالثة، وهذه الطريقة تمكن من تخليق ميكروفلويديك النانوية المستهدفة، والتقييم الفوري للالمربوطة بهاز خصائص. هذه وعود لتحسين كفاءة تقييم أو فحص الجسيمات النانوية المستهدفة، وكذلك تقليل كميات من الجسيمات النانوية المطلوبة. 13-15 رابعا، يمكن هذا النهج قياس حركية التفاعل للتفاعلات إضافة حلقية bioorthogonal في الوقت الحقيقي تحت التدفق المستمر. أخيرا، والشلل الكيمياء TCO / TZ قوية في وجود المصل. أخذت معا، ونحن نتوقع أن هذا النهج تنوعا سيسهل على نطاق واسع بناء السطوح استشعار مستقرة لمجموعة واسعة من الدراسات ميكروفلويديك مع ذات الصلة في التجارب المختبرية والتطبيقات الخلوية الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة التقاط-إضافة حلقية وصفها هنا تمكن السريع، والشلل عكسها النانوية المعدلة والجزيئات الصغيرة للتفاعل القائم على رقاقة خالية من التسمية والدراسات الحركية. بروتوكول الشلل لا يمكن أن يؤديها في دقيقة تتطلب <10 ميكرومتر تركيزات بروابط جزيء صغير. عن طريق تحوير تركيز ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NHLBI العقد رقم HHSN268201000044C لRW، SH وSYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Riferimenti
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
