Heat-inducida por antígenos de recuperación: un método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante la neurogénesis del hipocampo adulto
Summary
Durante la neurogénesis del hipocampo adulto, un conjunto distinto de marcadores genéticos se expresan cuando un reposo neuronal secuencial de células madre progresa y se desarrolla en una neurona funcionalmente integrado en el circuito. El uso de la recuperación de antígeno inducida por calor, tipos de células progenitoras que son de otro modo difíciles de detectar se identifican con una eficacia mejorada.
Abstract
Los métodos tradicionales de inmunohistoquímica (IHC) siguientes de fijación del tejido permiten la visualización de varios tipos de células. Estos suelen proceder a la aplicación de anticuerpos para unirse a antígenos e identificar células con características que son una función de la biología y el desarrollo inherente. Neurogénesis en el hipocampo de adultos es un proceso secuencial en la que una célula madre neural de reposo puede convertirse en activa y proceder a través de las etapas de la proliferación, la diferenciación, la maduración y la integración funcional. Cada fase es distinta con una morfología característica y la regulación positiva de genes. La identificación de estas fases es importante entender los mecanismos de regulación en el juego y cualquier alteración en este proceso que subyacen en la fisiopatología de los trastornos debilitantes. Nuestro enfoque de recuperación de antígeno inducida por el calor mejora la intensidad de la señal que se detecta y permite la correcta identificación del tipo de células progenitoras. Como se discutió en estepapel, sobre todo, nos permite evitar los problemas actuales en la detección de ciertos tipos de células progenitoras.
Introduction
La neurogénesis, la generación de nuevas neuronas a partir de células madre neurales, ahora se sabe que se producen constantemente en la edad adulta en dos regiones especializadas en el cerebro. Estos incluyen la zona subventricular (SVZ) de el bulbo olfativo y la zona subgranular (SGZ) de la circunvolución dentada en el hipocampo. Durante la última década, el campo de la neurogénesis del hipocampo adulto ha visto un trabajo importante. La región ha atraído mucho interés ya que las neuronas recién nacidas en la SGZ contribuyen a la plasticidad neuronal mejorada que puede mantener las funciones cerebrales específicas 1-5. Neurogénesis del hipocampo adulto se ha implicado a desempeñar un papel importante en la regulación del estado de ánimo, la regeneración y el aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, ha habido un esfuerzo concertado para entender el desarrollo y la regulación de las neuronas en este rico nicho neurogénico.
Un aspecto inevitable e importante de estudiar neurogénesis del hipocampo adulto es la identificación de sta separadobios que una célula madre neural activado atraviesa en su camino a convertirse en una neurona completamente funcional. En este proceso, la célula madre neural de reposo se activa y procede a través de una serie de principios activos y finales de los tipos de células progenitoras activas (Figura 1). Estas poblaciones distintas de progenitores neurales pueden ser identificadas por la morfología y su expresión de marcadores moleculares tales como MCM2, nestina, tbr2 y Doublecortin (DCX) y NeuN que guían la conversión de RGLs en sus respectivos tipos de células progenitoras. La nestina es una proteína de filamento intermedio que se expresa a través de las células de la glia-como radiales y algunos tipos de células progenitoras tempranas. Otro marcador es tbr2 que se expresa específicamente en las células progenitoras de amplificación. La expresión del transgén tbr2 está inicialmente apagada en las células de tipo 1 (radial-glia similares), activado a través de los Type-2a, progenitores-Type 2ab y Type-2b y apagó entre los más diferenciado Type-3 e inmaduroneuronas (Figura 1). DCX es un marcador de la migración neuronal que se expresa en el Tipo-2ab, Tipo-2b y Tipo-3 progenitores neurales. El uso de esta combinación de tres marcadores, podemos etiquetar subtipos distintos de progenitores neurales. Estos incluyen el tipo 1 (MCM2 + nestin + tbr2-), Tipo-2a (MCM2 + nestin + tbr2 +), Tipo-2ab (MCM2 parcial + nestin-tbr2 + y parcial MCM2 + tbr2 + DCX-), Tipo-2b ( MCM2 + + tbr2 DCX +) y Tipo-3 (MCM2 + tbr2-DCX +). Células post-mitóticas tales como las neuronas inmaduras y funcionalmente integrados pueden ser identificados mediante la utilización de DCX y el marcador neuronal maduro, NeuN.
Los métodos tradicionales de IHC utilizan anticuerpos para identificar antígenos para tipos de células específicas en función de su expresión génica. La visualización posterior a través de técnicas de formación de imágenes de alta resolución tales como la microscopía confocal se puede utilizar para su identificación. Sin embargo, actualmente hay problemas que existen con estos métodos que no permiten la identificación eficaz delos tipos de células de células glia-como radiales y progenitoras tempranas. Es difícil identificar estos tipos de células particulares debido a que el anticuerpo aplicado no es capaz de penetrar y unir la proteína nestina de manera eficiente. La nestina es la proteína de filamento intermedio que comprende los procesos radiales producidas por la célula-glía como radial. La ineficiente de unión de un anticuerpo al antígeno puede ser el resultado de muchos factores, incluyendo tiempo de fijación, la temperatura y la técnica utilizada 6-7. Para ayudar a resolver estos problemas, hemos desarrollado un antígeno de recuperación o método de "ebullición". Además de nestina, este método de recuperación de antígeno también mejora la tinción para otros marcadores tales como Ki67, BrdU, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), tbr2 y MCM2. Nuestro método combina junto enfoques químicos y físicos. Se trata de la fijación química del tejido en paraformaldehído y la posterior alta temperatura de ebullición de secciones de hipocampo coronales delgadas en un tampón de un desnaturalizante y chaotroptratamiento IC. Esto mejora la accesibilidad del antígeno al anticuerpo, mejora la especificidad del anticuerpo y permite una mejor identificación de los tipos de células progenitoras. Nuestro enfoque es simple de usar que requiere herramientas y reactivos en su mayoría ya están disponibles en el laboratorio. Hemos utilizado extensivamente para estudiar el desarrollo de las células madre neurales y su regulación a través de factores ambientales o genéticos intrínsecos extrínsecos 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes para el éxito de la recuperación de antígeno y la tinción de tipos de células progenitoras son: 1) la utilización de buena perfusión y tejido fijado del espesor coronal óptima; 2) con tiempo suficiente para la ebullición y posterior enfriamiento durante la recuperación de antígenos, y 3) la destreza manual en montaje secciones coronales fijos y prevenir su daño al hacerlo.
Es crítico para IHC usar tejido perfundido que ha sufrido suficiente fijación p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La metodología fue desarrollada originalmente en el laboratorio del Dr. Hongjun canción en el Instituto de Ingeniería Celular, Departamento de Neurología de la Escuela de Medicina Johns Hopkins. Este trabajo fue financiado por el NIMH (R00MH090115), NARSAD, la Orden Fraternal de la Fundación para la Investigación del Cáncer Mayo de águilas, y un paquete de puesta en marcha de la Fundación Mayo adjudicado a MHJ y Ciencia Investigación Básica del Programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (A3014385) otorgados a WRK
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SuperFrost Plus Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | Provides strong adherence to hippocampal tissue during boiling |
| PVA/DABCO Mounting Media | Sigma Aldrich | 10981-100 ml | |
| Nestin (chicken) | Aves Lab | NES | Neural stem cell marker |
| GFAP (rabbit) | Dako North America | Z033401-2 | Astrocyte and neural stem cell marker |
| MCM2 (mouse) | BD Transduction Laboratory | 610701 | Proliferation marker |
| DCX (goat) | Santa Cruz Biotechnology | SC8066 | Immature neuron marker |
| Tbr2 (rabbit) | Abcam | Ab23345 | Amplifying progenitor marker |
| NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Mature neuron marker |
| Cy2 (anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch | 111-226-047 | |
| Cy2 (anti-chicken) | Jackson Immunoresearch | 303-165-006 | |
| Cy5 (anti-mouse) | Jackson Immunoresearch | 315-175-047 | |
| Cy5 (anti-goat) | Jackson Immunoresearch | 305-165-047 | |
| DAPI | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Dako Pen | S2002 | Dako | Water-repellant pen |
Riferimenti
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