Bir uygulama için Protokoller<em> Escherichia coli</emSentetik Biyoloji> Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

1.. Ham hücre ekstresi hazırlanması Üç gün boyunca ham hücre ekstresinin hazırlanması verimli yapmak için iki kişi gerekir. Kültür büyüme (adım 1.1 1.11 adım), hücre parçalama (1,37 adım adım 1.12) ve açıklama (adım 1.38 1.52 adım) ayıklamak: Protokol işlevsel üç bölümden oluşmaktadır. Bu rahatlık için günde ayrılmıştır sunulmuştur. İdeal özü plasmid pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019) ve proteinin, 27-30 mg / ml arasında bir ham hücre ekstresi konsantrasyonuna sahiptir. 4 ila deGFP 0.75 mg / ml üretebilen Ancak , özü özellikleri partiden diğer partiye göre değişir. Aşağıdaki tarifi yaklaşık 3.000 tek reaksiyonların (6 ml ham hücre ekstresi) için yeterli sağlar. Aşağı ölçeklendirme, o daha az Burada verilen değerlerin 1/6 daha kullanılması önerilir. Zaman kısıtlamaları nedeniyle, ölçeklendirme tavsiye edilmez. Gün 1 Hazırlayın bakteriyel kültür ortamı, kültürTure plaka ve ortam ek olarak, Tablo 1 'de tarif edilen. Tarifler için Ek Maddesi 1 Bkz. . Streak BL21-Rosetta2 bir 2xYT + P + Cm agar plakası üzerine -80 ° C, gerilme ve 37 ° C'de ya da koloniler kolayca görebilir kadar en az 15 saat boyunca inkübe Not: Kloramfenikol (Cm) bir plasmid için seçmek için kullanılır BL21-Rosetta2 suşunda nadir tRNAs kodlayan. 2. Gün Tamponlar ve Tablo 2'de tarif edildiği gibi ek hazırlayın. Tarifler için Ek Maddesi 1 Bkz. De dahil olmak üzere, 3 gün için gerekli malzeme hazırlama ve sterilize: alüminyum folyo kapağı (otoklav) ile 6 x 4 L Erlenmeyer şişelerinde, 4 x 1 L steril santrifüj şişeleri, huni (otoklavlanmış), 0.1 mm cam boncuklar ve 100 g (otoklavlanmış), 2 karışmaya-çubuklar (otoklav), 1 L ve 500 ml silindir (otoklavlanmış), (otoklav) 2 x 1 L bardak, 18 G iğne (steril) ile 3 ml şırınga içinde, 2-3 fl mezunyulaf şamandıralar, 2-3 10k MWCO diyaliz kasetleri (steril), küvetler. Mini kültürü 1 hazırlayın. 12 ml steril kültür tüpü ve ön ısıtma, 30 dakika boyunca 37 ° C ila + P 2xYT medyanın 4 ml Cm ve 4 ul ekleyin. 2xYT + P + Cm agar plağından bir koloni ile mini kültürü 1 aşılamak. , 220 rpm'de 8 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 7 saat ve 30 dakika sonra, mini-kültür 2 hazırlar. 30 dakika boyunca bir steril 250 ml Erlenmeyer şişesi ve önceden sıcak 37 ° C ile + P 2xYT ortamı 50 ml Cm ve 50 ul ekle. Mini-kültür, 100 ul 1 mini-2 kültür aşılamak ve 8 saat süre ile, 220 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin. 3. Gün Tablo 3'de dört boş steril 50 ml Falcon tüpler ve kayıt kitle tartılır. Buz üzerinde Falcon tüpleri Chill, bunlar, daha sonra adım 1.18 kullanılacaktır. Adım 1.8 sonra 7 saat ve 30 dakika, son bakteriyel kültür ortamı hazırlamak. Steril 1 L kullanılarak silindir, transfer 2xYT + P medyanın 660 ml mezun i. 30 dakika Not altı 4 L Erlenmeyer şişelerinde ve önceden 37 ° C sıcak arasında her nBu: 4 L ya da daha büyük bir Erlenmeyer flasks uygun havalandırma için tavsiye edilir. Her bir 4 L Erlenmeyer şişesi içine mini kültürünün 2 6.6 ml ilave edilir. Kültür (orta log büyüme fazına karşılık gelen) 600 nm'de 1,5-2,0 OD'ye ulaşana kadar 220 rpm'de, 37 ° C'de inkübe edin. Doğruluk için 1:10 kültür seyreltme ile periyodik OD Giriş Bu adım, en fazla 3 saat sürer – 3 saat 45 dakika;. Hızlı orta-log aşamasında büyüme ve tahsilat özü kalitesi için önemlidir. Hemen büyüme sonrasında, bakteriyel hücreler pelet 4 ° C'de 12 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj dört adet 1 L şişe ve santrifüj içine eşit olarak tüm kültürleri aktarın. 1 M DTT, daha önce hazırlanmış 2 S30A L kadar 4 ml ilave etmek suretiyle, tam S30A tampon hazırlık santrifüj iken. Mix ve buz üzerinde tampon korumak. Santrifüj bittiğinde, tamamen decadan adım 1.12 'den süpernatant kaldırmaknting ve steril bir kağıt havlu üzerinde kurutma santrifüj şişeleri. Dört santrifüj şişelerinin her birine 4 ° C'de S30A tampon 200 ml ilave edilir, ve pelet tamamen hiçbir kalan topaklar ile eriyebilir hale gelinceye kadar kuvvetlice şişe çalkalanır. 4 ° C'de 12 dakika boyunca 5,000 g'de santrifüj dört şişe Tamamen steril bir kağıt havlu üzerine boşaltılması ve santrifüj şişeleri blot önceki aşama süpernatant kaldırmak. Tekrar 1.15 ve 1.16 adımları. Her bir santrifüj şişeye, 4 ° C de 40 ml tampon ekleme S30A. .), 1.9 'dan soğutulmuş bir Falcon tüpüne her bir pelet ve S30A kombinasyonu transfer Not: Bu adım, daha küçük bir kap içine granül transfer etmektir. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 2000 g'de santrifüj Falcon tüpleri Boşaltılarak süpernatantı. Yeniden santrifüj Falcon tüpleri 2 dakika boyunca 2000 g'de, 4 ° C'de Tamamen pipetle kalan süpernatant kaldırmak. Buz üzerinde tutmak. F tartılırTablo 3 pelet ve rekor kitle ile Falcon tüpler. Pellet kütle, gerekli S30A tampon hacmi ve Tablo 3'teki özel formüllere göre gerekli boncuk kütlesi hesaplayın. Pelet doğru yükleme ve boncuk dayak kalite özü hale getirmek için önemlidir ve en zor bir adımdır. Bu denemeden önce videoyu yorumlayan tavsiye edilir. Hava kabarcıklarını önlemek ve eşit boncuk dağıtmak için başarısızlık verimsiz özü neden olur. Homojen olana kadar her bir Falcon tüpü, girdaba Tablo 3'te hesaplanan S30A tampon miktarını ekleyin ve buz geri dönün. Buz üzerinde diğer Falcon tüpleri tutarken, 30 saniye için, boncuk her kısım ilave edildikten sonra. Üç aliko, toplam boncuk 1/3 kullanılarak her tek Falcon tüpüne aralıklı girdap boncuk ekleyin. Vorteks adımlar ve son vorteks sonra arasında buz üzerinde Falcon tüpü yerleştirin. Son kısım ilave edildikten sonra sağlamakboncuklar eşit dağıtılır. Kalın bir macun oluşturulmalıdır. 3-4 mm açıklık oluşturmak için steril bir jilet kullanarak ucunu keserek bir 5 ml (hacim) pipet hazırlayın. 2 ml pipet Dial Not: Farklı pipet setleri ve uçlarına çekme ve kalın boncuk hücre çözeltisi serbest bırakmak için yeterli olmayabilir emme farklı miktarlarda bulunur ve çıkarıldı ucu olan bir 1 ml pipet ucu yerine kullanılabilir.. Buz üzerinde 20 boncuk yenerek tüpleri yerleştirin. Modifiye pipet kullanarak hücre-boncuk çözeltinin viskozitesi yüksek doğrulayın. Bu ancak ejeksiyon sırasında pipet çıkan noktasına viskoz olmalıdır. Çok viskoz ise, 1,25 aşamasına göre pipet yeniden ayarlayın. Yeterli viskoz Değilse, boncukları (topak kütle * 5.1), maksimum kütlesine (pelet kütlesinin * 0.05) artışlarla ilave edilebilir. Boncuklar, 30 saniye boyunca girdaplı her bir ilave edildikten sonra ve buz geri dönün. Viskozite bir gösteri için Şekil 3a bakınız. Modifiye pipet kullanarak Falcon tüp boncuk-hücreli çözüm çıkarın ve steril bir boncuk-yenerek tüp içine aktarın, o boncuk-hücre çözümü ile tam üç çeyrek dolum. Boncuk dağıtarak olmadan hava kabarcıklarını çıkarmak için karşı bir mini santrifüj son derece kısa bir süre (1s) Spin. Boncuk-dayak tüp yükleme hareketsiz görüntüler için Şekil 3b-d bakın. Bir içbükey meniski oluşturacak boncuk hücre çözümü eklemeyi bitirmek. Başlığın dış dudak engellememesi için dikkatli olmak, boncuk-dayak boru başlığın iç üzerine boncuk hücre solüsyon çok küçük bir damla ekleme, aksi halde, boncuk dayak boru olmaz yakın sufficientl y. Düz bir yüzeye kapağını dokunun ve kapağın altındaki herhangi bir hava kabarcığı olduğunu doğrulayın. Bir önceki aşamada elde edilen boncuk yenerek kap ile boncuk yenerek tüp Cap. Boncuk dayak için asistan el. Eğer doğru yapılırsa, kapağı sıkıca hava kabarcıkları omuz, sızdırmaz olmalıdırgörünür olurdu ve küçük (varsa) boncuk-hücre çözümü taşması gerekir. Hava kabarcıkları görünür ya da kapak yok tamamen kapatmak değilse yükleme işlemini yineler. Kalan boncuk-hücre çözümü ile adım 1.24 dan vorteks Falcon tüp boncuk dağılımını sağlamak. Falcon tüp boşalana kadar tekrarlayın 1,28-1,31 adımları; sonra her ek Falcon tüp için 1.31 1.24 adımları tekrarlayın. Davranış aynı anda 1,33-1,38 adımları. Asistan take boncuk-yenerek 1,31 tüpleri ve buz üzerinde yer doldurdu. Iki dolu boncuk dayak borular toplanmıştır ve en az bir dakika boyunca buz üzerinde olmuştur sonra, boncuk dayak başlar. 46 rpm'de 30 saniye için, bir tüp bitirin. Diğer boru dayak ise 30 saniye boyunca ters buz üzerine yerleştirin. Her dolu boncuk-yenerek tube 1 dk toplam yendi olmuştur böyle bir önceki adımı tekrarlayın. Tekrar 8 dolu boncuk yenerek tüpleri (veya santrifüj tutabilir maksimum miktarı) h kadar 1,33-1,35 adımlarıişlendikten ave. Daha sonra, 15 ml Falcon (Şekil 3e) filtre düzeneği oluştururlar. 15 ml Falcon altına, yeni bir boncuk-yenerek kapağı, düz parçası yüzü kadar ekleyin. Tamamen kapalı kadar sonra, sıkıca işlenmiş boncuk-yenerek borunun ucuna işlenmiş boncuk-yenerek tüp ve basın mikro-kromatografi kolonu kapağını kaldırın. Mikro kromatografi sütununun elüsyonu ucundan takılır, ve mikro-kromatografi kolonu yer elüsyon boş boncuk boncuk tüp içine, aşağı doğru sona. 15 ml Falcon içine bu karmaşık yerleştirin. 8 dolu boncuk-yenerek tüpler için tekrarlayın; tamamlandığında buz üzerinde tutmak. Santrifüj 8 filtre cihazları, Falcon tüpü kapağını açıp, boncuk özü ve pelet ayırmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 6,000 g'de. Doğrulayın her boncuk yenerek tüp uygulanabilir özü üretti. Düzgün yenmek özü bulanık olmayacak, ve topak, iki farklı tabaka olacaktır. Tüm bulanık tüpler atmak ve olmayan bulanık tüplerin süpernatant aktarmak imümkün olduğu kadar az topak alma nBu tek 1.75 ml mikro santrifüj tüpleri,. Tüm boncuk-yenerek tüpleri işlendikten kadar buz üzerinde tutmak. Bir doğru vs yanlış işlenmiş boncuk yenerek tüp karşılaştıran 3f Şekil bakın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12,000 g'da santrifüj önceki aşama mikro santrifüj tüplerine Transferi pelet içermeyen yeni bir boncuk-yenerek tüp içine 500 ul konsolide, bir pipet kullanarak boş boncuk yenerek tüpler içine yüzer. 220 rpm'de çıkarıldı boncuk-kapaklar yenerek, 80 dakika boyunca 37 ° C, daha önce adım inkübe edin. Bu adım, boncuk boncuk işlemi sırasında açığa çıkan endojen ayıran eksonükleazları kullanılarak nükleik asitleri kalan sindirir ve bir doku kültürü tüpüne boncuk dayak tüp ayakta yapılabilir. Diyaliz malzemeleri hazırlayın. 1 M DTT, daha önce hazırlanmış 2 S30B L 2 ml eklenerek tam S30B tampon hazırlanması. Mix ve iki st her birine 900 ml ekleyin1 L beherleri erile. Her bir deney kabı içine steril manyetik karıştırıcı ekleme; 4 ° C'de tutun Adım 1.41 sonra, ekstrakt bulanık bakmak gerekir. 1.75 ml mikro santrifüj tüplerine 1.5 ml alikota özü birleştirin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 g'de santrifüj Bir pipet kullanarak, buz üzerinde 15 ml Falcon tüplerine içermeyen topak süpernatantı birleştirmek ve boru ve çevrilmesini kapatma ile iyice karıştırın. Aşama 1,47 boyunca buz üzerinde yüzer 10 ul kaydedin. Üretilen ekstresi toplam miktarını belirlemek ve kaset başına özü 2.5 ml varsayarak, 2 dakika boyunca S30B in batırmak suretiyle 10k MWCO diyaliz kasetlerinin gerekli sayıda hidrat. Ekstresi 2.5 ml kasetleri yerleştirin. Her kabı 2 kasetleri kadar sürebilir; dialyze, karıştırma, 3 saat Not için 4 ° C'de: kasetlerinin kısmi yükleme kabul edilebilir.. Diyaliz protein üretimi verimini artırır. Önceki adım sırasında, özüt proteini karakterizeAdım 1.44 kaydedilmiş ekstraktı kullanılarak bir Bradford tahlili ile konsantrasyon,. Ayrıntılar için Ek Maddesi 2 Bkz. Diyaliz 1.75 ml mikro santrifüj tüplerine 1.5 ml, tam kısım özü sonra. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12,000 g'da santrifüj Bir pelet tüpün altındaki oluşturacaktır. Buz üzerinde bir 15 ml Falcon tüpü içine pipetle önceki aşama temiz bir süpernatan birleştirin. 5-10x ters çevirerek homojenize. Adım 1.47 Bradford ile tespit konsantrasyonuna bağlı olarak, her bir 1.75 ml tüplere kana özü miktarının belirlenmesi. Her bir tüp, toplam proteinin 810-900 mg bir hacme sahip olmalıdır. Özü 27 mg / ml 'den daha büyük olan bir toplam protein konsantrasyonuna sahip olmalıdır. Örneğin, 30 ul 28 mg / ml 'de bir alikot özü, ve kısım ekstre 32 ° C'de; konsantrasyonu yüksek ise kısım 30 ul alikolar halinde 30 mg / ml' nin altında özü ve ölçek:. Bu adım amaca Not yapmak için yardıma ihtiyacı28.1 ul mg / ml. Kabarcıklarını önlemek için özen adım 1.50 aşağıdaki aliquot özü. Sıvı nitrojen içinde dondurularak-Flaş özü Not:. Kabarcıkları ile alikoları, 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile kaldırılabilir Bir süzgeç kullanarak sıvı azot tüpleri çıkarın ve hemen -80 ° C Güvenlik saklamayın: koruyucu gözlük giyin; özü tüplerin kapakları nedeniyle sıvı azot ve oda sıcaklığı arasındaki sıcaklık farkı kapalı gelebilir. 2. Amino Asit Çözüm Hazırlığı Amino Asit Çözeltisi toplu olarak hazırlanmalıdır. Aşağıdaki tarifi yaklaşık 11.000 tek reaksiyonlar için yeterli tedarik, RTS Amino Asit Sampler tam bir seti kullanır. Aşağı ölçekleme ise, hiçbir az yarım kiti kullanımı tavsiye edilir. Stokta her bir amino asit 140 mM'de lösin haricinde, 1.5 mi, 168 mM 'de verilir. Amino asit çözeltisinin nihai bileşimi:lösin, 5 mM, diğer tüm amino asitlerin, 6 mM. Bu 4x çalışıyor konsantrasyondur. -20 ° C ila 20 amino asitler çıkarın ve oda sıcaklığında eritin. Bir kere çözülmüş, girdap amino asitler, gerektiğinde çözülür, 37 ° C'de inkübe kadar. Amino asitler eritilir sonra, oda sıcaklığında tutulur, Asn, Phe ve Cys haricinde, buz üzerinde, bütün amino asitleri koydu. Cys tamamen çözülür olmayabilir. Buz üzerinde, steril bir 50 ml Falcon tüpüne steril suyun 12 ml. Her eklemeden sonra Falcon tüp vorteks ve buz üzerinde bir çözüm sağlayacak şekilde özenle, 1,5 aşağıdaki sırayla her bir amino asit ml ekle: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Giy, His, ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys ilave edildikten sonra, girdap çözelti oluşana dek, gerekirse 37 ° C'de kuluçka, nispeten açıktır. Bir süspansiyon olarak ilave edilebilir. Cys tamamen çözülür olmayabilir. 50 tüplerinde içine kısım Amino Asit ÇözeltisiBuz üzerinde 26 ul, her. Buz üzerinde tüp başına 500 ul kalan kısım. 500 ul alikotları tampon hazırlanması için kullanılacak ise aliquoting, girdap ana stok süspansiyonu sık sık eşit dağılımını önlemek için olsa da 26 ul alikotları., Özü kalibre edilmesi için kullanılacaktır. -80 ° C Güvenlik sıvı azot ve mağaza flaş dondurma tümbölenleri: koruyucu gözlük giyin; özü tüplerin kapakları nedeniyle sıvı azot ve oda sıcaklığı arasındaki sıcaklık farkı kapalı gelebilir. İsteğe bağlı: Önceden yapılan Amino Asit Çözümleri karşı yeni yapılmış Amino Asit Çözüm bir aktivite deneyi Davranış. 3. Enerji Çözüm Hazırlığı Enerji Çözümü ham hücre ekstresi kalibre edilmesi için ve bir tampon oluşturmak için her ikisi de kullanılır ve toplu olarak hazırlanmalıdır. Aşağıdaki tarifi yaklaşık 10000 tek reaksiyonlar için yeterince sağlamaktadır. Aşağı ölçeklendirme, bu üzerinde öneriliraz Burada verilen değerler 1/24 'den kullanmak nded. Energy Solution önemli bir parasal maliyet olarak, ilk kez kullananlar 1/24 ölçekte hazırlamak isteyebilirsiniz. Enerji Çözüm sonuç kompozisyonu: HEPES pH 8 700 mM, 21 mM ATP, GTP 21 mM, CTP 12.6 mM, UTP 12.6 mM, tRNA 2.8 mg / ml, 3.64 mM CoA, NAD 4.62 mM, cAMP 10.5 mM, folinik asit 0.95 mM, Spermedine 14 mM, 3-PGA 420 mM. Bu 14x çalışıyor konsantrasyondur. Arzu edildiği takdirde, Tablo 4 'de, her bir madde daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de muhafaza edilebilir. -80 ° C ila Tablo 4 'de tüm kimyasal kaldır, -20, 30 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar bir sıcaklıkta, ya da 4 ° C. Tablo 4 'de tarif edildiği gibi stok çözelti hazırlayın. Tarifler için Ek Maddesi 1 Bkz. Hazırlandıktan sonra buz üzerinde tüm çözümleri yerleştirin. Bir 15 ml Falcon tüpü, her bir ilaveden sonra Falcon tüp vorteks dikkat ederek, aşağıdaki sırada ekleyin ve o çözüm tutmayan ice: 3.6 ml 2 M HEPES, 144 ul su, 1.39 ml nükleotid karışımı, 576 ul 50 mg / ml tRNA, 576 ul 65 mM CoA, 276 ul 175 mM NAD, 170 ul 650 mM cAMP, 288 ul 33,9 mM folinik asit , 144 ul 1 M spermidin, ve 3.09 ml 1.4 M 3-PGA. Buz üzerinde 7 ul her biri 50 tüpleri içine kısım enerji çözümü. Buz üzerinde tüp başına 150 ul kalan kısım. 150 | il tam bölünen miktarları, tampon hazırlanması için kullanılacak ise 7 ul alikotları aliquoting, girdap ana stok da sık sık., Özü kalibre edilmesi için kullanılacaktır. -80 ° C Güvenlik sıvı azot ve mağaza flaş dondurma tümbölenleri: koruyucu gözlük giyin; özü tüplerin kapakları nedeniyle sıvı azot ve oda sıcaklığı arasındaki sıcaklık farkı kapalı gelebilir. İsteğe bağlı: Önceden yapılan Enerji Çözümleri karşı yeni yapılan Enerji Çözümü bir aktivite deneyi Davranış. 4. Tampon hazırlanması Buffer Hazırlama Hazırlama, Amino Asit Çözeltisi Hazırlama ve Enerji Çözümü Hazırlık Özü Ham Cell tamamlanmasını gerektirir. Her bir tampon ham hücre ekstresi toplu özgüdür. Mg-glutamat, K-glutamat ve DTT (bu sırayla) ifade yüksek seviyeleri ile tepkimeye girmesi için bu bölümde optimize edilmiştir. Aşağıdaki protokol, önceden hazırlanan ham hücre özü ve kalibre tamponu hazırlamak için bir ön yazılı şablonu, TXTL_e (şablon) _calibration_JoVE.xlsx (İlave Maddesi 3), kullanmaktadır. Ancak, bir de ham hücre ekstresi kalibre ve özü ile birlikte, toplam bir reaksiyon hacminin% 75 olduğu el Mg-glutamat, K-glutamat ve DTT optimize ve bu tür tampon kurarak şablon olmadan tampon hazırlayabilirsiniz. El ile kalibre ise, son reaksiyon koşulları aşama 5'te bulunabilir. "Genel Bilgiler" formunu doldurun. Buz 100 mM Mg-glutamat (4 ° C), 3 M K-glutamat (4 ° C) üzerine, çözülme, 6mM Amino asit çözeltisi (26 ml, -80 ° C), Energy Solution (7 ml, -80 ° C), 100 mM DTT (-20 ° C) pozitif kontrol DNA (-20 ° C),% 40 PEG- . 8000 (4 ° C), ham hücre ekstraktı (-80 ° C) ve su (4 ° C) Not: 1 nM çalışma konsantrasyonu pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene plazmid 40019) pozitif kontrol (eksitasyon 485 nm, emisyon 525 nm), ya da yüksek sinyal yoğunluğu üreten bir referans için. 4 Tek mikro-santrifüj tüplerine stok Mg-glutamat set miktarlarda aliquoting tarafından, 4-10 mM ek Mg-glutamat bir dizi test, yedi 10.5 ul reaksiyonlar hazırlayın. Not: 10.5 ul reaksiyonları başlangıçta hazırlanmış olmasına rağmen, son reaksiyon 10 ul. K-glutamat ekstra 80 mm ekleyerek, "Mg-glutamat kalibrasyon" altında şablonda gösterildiği gibi ana karışımı hazırlayın. Her öğenin eklenmesinden sonra buz ve vorteks devam Not:. Burada ve şablonda verilen değerleriMg-glutamat, K-glutamat ve ham hücre özü yapmak için kullanılan S30B DTT tampon maddesi içinde mevcut olan miktarlarda ilave olarak. Mg-glutamat içeren örnekler için ana karışımı ekleyin ve reaksiyonları hazırlamak. Adımları ayrıntılı talimatlar için 5,10-5,13 bakın. Bir kuluçka makinesi ya da bir levha okuyucu içinde ya da, 29 ° C 'de reaksiyon çalıştırın. . Uç-sentezleme seviyesi ve protein ekspresyonu (Şekil 4a) arasında maksimum oranı ile uygun Mg-glutamat konsantrasyonunun belirlenmesi Not: çalışma zamanlarının deneye ancak tipik olarak son 8 saat altında bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Tekrar adımda 4.7 bulunanlara Mg-glutamat düzeylerini ayarlama ", K-glutamat kalibrasyon" altında K-glutamat için 4,2-4,7 adımları. Tekrarlayın Adım 4.8 'de bulunanlar adım 4.7 ve K-glutamat düzeyleri bulunan kişilerce Mg-glutamat düzeylerini ayarlama ", DTT kalibrasyon" adı altında DTT için 4,2-4,7 adımları Not:. Biz DTT önemli ölçüde uç-etkilemez ilave bulduk ekspresyon seviyeleri. Kullanımhazırlanacak tampon bileşimini belirlemek için "Tampon kompozisyon" başlığı altında bulunabilir kalibrasyon değerleri. Üretilen ham hücre ekstresi miktarına göre, bir ana karışım tarifi tampon bir miktar için üretilir. Buz üzerinde ana karışımı tarifi listelenen alikotları çözülme. Bir kere çözülmüş, her öğenin eklenmesinden sonra buz ve vorteks tutarak, ana karışımı hazırlayın. Miktarına göre Tümbölen altında belirtilen "Tampon kompozisyon." Flaş-freeze tampon sıvı azot içinde tüpler. Aliquoting, girdap ana stok ederken sık sık. Bir süzgeç kullanarak sıvı azot tüpleri çıkarın ve hemen -80 ° C Güvenlik saklamayın: koruyucu gözlük giyin; özü tüplerin kapakları nedeniyle sıvı azot ve oda sıcaklığı arasındaki sıcaklık farkı kapalı gelebilir. 5. Bir TX-TL Reaksiyonu Deneysel Yürütme Nihai tepkime koşulları şunlardır: 8,9-9,9 mg / ml protelösin, 1.25 mM lösin, 50 mM HEPES, 1.5 mM ATP ve dışında (ham ekstreden) içinde, 4.5 mM-10,5 mM Mg-glutamat, 40-160 mM K-glutamat, 0,33-3,33 mM DTT, 1.5 mM her bir amino asit GTP, CTP ve 0.9 mM UTP, 0.2 mg / ml tRNA, 0.26 mM CoA, 0.33 mM NAD, 0.75 mM cAMP, 0.068 mM folinik asit, 1 mM spermidin, 30 mM 3-PGA,% 2 PEG-8000. temel TX ham hücre ekstresi, tampon ve DNA:-TL reaksiyon 3 parça (tüpler) sahiptir. Oranı:% 75 tampon ve özü,% 25 DNA reaksiyonlar hacim olarak değişebilir, ve reaksiyon hacmini en aza indirmek ve bir 384-oyuklu bir plaka içerisinde çalışmasını sağlamak için geleneksel olarak 10 ul kullanın.. Daha büyük miktarlar için uygun bir oksijen ajitasyon gerektirir. Aşağıdaki protokol 10 ul tepki yapmak için, önceden yazılı şablonu, TXTL_JoVE.xlsx (Ek Malzeme 4) kullanır. Mor kalemler kullanıcı girişi değerlerini gösterir ve mavi öğeleri reaksiyonuna eklemek için ek reaktifler göstermektedir. Bununla birlikte, bir de, bir reaksiyon wit yapabilirlerhout yukarıda özetlenen reaksiyon şartlarını takip ederek şablonu. "Genel Bilgiler" formunu doldurun. Altında "Master Mix Hazırlama," mor kutunun içine adım 4.1 özü yüzde değerini yerleştirin. "Master Mix Hazırlık" (satır 10-17) ve "DNA Hazırlık" (satırlar 19-50) bölümleri kullanarak siliko Denemenizi tasarlayın. Değişkenler "DNA Hazırlama" bölümünde konabilir sırasında Genel, sabitler, "Master Mix Hazırlama" bölümünde içine konabilir. Örnek buharlaşmasını ve deneysel başlangıç ​​zamanı yanlılığı önlemek için deneme başına örnekleri en aza indirin. Bir örnek kurulum için Şekil 6'ya bakın. Altında, "Master Mix Preparasyon," sabit bir konsantrasyonda bütün örneklerde gidecek bu tip teşvik ya da proteinler gibi reaktifler, ekleyin. Arka arkaya 14 ile başlayarak, her hat için bir reaktif tutarak, mavi gölgeli alanları doldurun. Birimler göreli oranlarıdır. Altında "DNA Hazırlanması," örnek Şartname olacak DNA eklemekic. Örnek pozitif ve negatif kontroller için et # 1 ve # 2 tekabül sırasıyla. Örnek et yukarıda # 3 ve kullanıcı tarafından değiştirilebilir DNA, ng / ul stok konsantrasyonu, baz çiftli uzunluğu nM olarak arzu edilen nihai konsantrasyonu, ve (10 ul reaksiyonlar) tekrarlarıdır. Arzu edilen nihai konsantrasyona ulaşmak için hazır DNA miktarı, otomatik olarak hesaplanır. . N tekrarların sayısı 10.5 * n, için satır toplamları için toplam Not: Nihai reaksiyon hacmi 10 ul olsa da, hesaplamalar reaksiyon başına 10.5 ul toplam hacim varsayalım, pipetleme sırasında kayıp hacim hesaba. Altında "DNA Hazırlanması," reaktifler veya mavi sütununa örnek özgü olacak ek DNA ekleyin. Örneği, özel reaktifler 10.5 * n bir toplam reaksiyon hacmi dayalı manuel hesaplama gerektiren süre nM stok DNA konsantrasyonları "DNA Hazırlanması," altında hesaplanabilir. Girilen hacimleri aynı satırda su hacmi dışarı çıkarılır. Gerekli numbe Kaldır-20 ° C veya -80 ° C den tampon maddesi, ham hücre özü ve kapsamında pozitif kontrol tüpleri "çözülme Tüpler," r ve buz üzerinde eritin. DNA örnekleri hazırlayın. Her örnek kimliği, kısım dışarı için belirtilen DNA, su, ve oda sıcaklığında bir mikro santrifüj tüpüne "DNA Hazırlama" bölümünde, kullanıcı başına sağlanan öğeler Not:. Örnek kaybını önlemek için, son zamanlarda pipetlerini ve düşük-sopa kalibre pipet uçları ve mikro-santrifüj tüpleri tavsiye edilir. Adım 5.7 tüpler çözülmüş, her öğenin eklenmesinden sonra buz ve vorteks üzerinde tutarak, tampon, özü, ve turuncu-gölgeli kutular dayalı herhangi bir global kullanıcı tarafından sağlanan maddeden oluşan ana karışımı hazırlamak Not:. Özü derece olduğunu viskoz. Kabarcıklar alikotları, 4 ° C'de 30 saniye boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile kaldırılabilir Her DNA örneği için "DNA Hazırlama" (sütun O) altında turuncu hücrelerinde belirtilen ana karışımı miktarını ekleyin ve oda sıcaklışında tutmakTure. reaksiyon başlangıç ​​zamanı olarak davranın. Vortex her bir örnek ve kalan örnek çökertmek için ve kabarcıklar azaltmak için, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 10,000 x g'de santrifüj. Mikro santrifüj tüplerine reaksiyonu yapılması halinde, 29 ° C 'de, doğrudan inkübe . Aksi takdirde, bir 384-oyuklu bir plakaya pipet örnek 10 ul Not: 10 ul daha büyük hacimli reaksiyonlar oksijen için ajitasyon gerektirebilir. Herhangi bir artık örnek çökertmek için ve kabarcıklar azaltmak için, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 4000 x g'de santrifüjleyin plakası. Buharlaşmasını önlemek için daha sonra plaka mühür. 29 ° C Not Run tepki: Runtimes deneye bağlı olarak ancak genellikle 8 saat altında son değişir.