実装するためのプロトコル<em>エシェリヒア·コリ</em合成生物学のための>に基づくTX-TLの無細胞発現系

1。粗細胞抽出物の調製 3日間にわたり、粗細胞抽出物を調製することは効率的に実施するために2人を必要とします 。プロトコルは、機能的に3つの部分で構成され培養増殖（1.11〜ステップ1.1）、細胞溶解（1.37をステップステップ1.12）、および明確化（1.52をステップステップ1.38）を解凍します。これは、便​​宜上日間に分けて提示されている。理想的な抽出物は、プラスミドpBEST-OR-OR 1-PR-UTR1-deGFP-T500（Addgene番号40019）、およびタンパク質の27〜30 mg / mlの間の粗細胞抽出物濃度を有している。4からdeGFPの0.75 mg / mlのを生成することができたが、抽出特性は、バッチからバッチごとに異なる​​。以下のレシピは約3,000、単一の反応（6ミリリットル細胞粗抽出液）のために十分に供給します。スケールダウンした場合、それは劣らず、ここで指定した値の1/6以下で使用しないことをお勧めします。時間的制約により、スケールアップすることはお勧めしません。 1日目細菌培養液を準備し、文化TUREプレートと、培地補充物、表1に記載したように。レシピの補足資料1を参照してください。 。ストリークBL21-Rosetta2のの2×YT + P + Cmに寒天プレートに-80℃〜ひずみと37℃で、またはコロニーが容易に見えるようになるまで、少なくとも15時間インキュベート注：クロラムフェニコール（CMは）プラスミドを選択するために使用されているBL21-Rosetta2株では珍しいのtRNAをコードする。 2日目 表2に記載のような緩衝液やサプリメントを準備します。レシピの補足資料1を参照してください。 を含めて、3日目に必要な材料を準備し、殺菌：アルミホイルカバー（オートクレーブ処理）と6×4 L三角フラスコ、4×1 Lの滅菌遠心ボトル、漏斗（オートクレーブ処理）は、0.1ミリメートルのガラスビーズ100グラム（オートクレーブ処理）、2炒めバー（オートクレーブ処理）、1リットルと500ミリリットルのシリンダー（オ​​ートクレーブ処理）、（オートクレーブ処理）2×1 Lビーカー、18 G針（滅菌）で3ミリリットルの注射器、2〜3 FL卒業オート麦ブイ、2〜3 10K MWCO透析カセット（滅菌）、キュベット。 ミニ文化1を準備します。 30分間37℃にする2×YT + Pメディアと4 12ミリリットルセンチμlの無菌培養チューブと事前暖かいの4ミリリットルを追加します。 の2×YT + P + Cmに寒天プレートからコロニーをミニ文化1に接種。 8時間220 rpmで、37℃でインキュベートする。 7時間と30分後に、ミニ文化2を用意。 30分間37℃の無菌250ミリリットルの三角フラスコと事前温めるの2×YT + PメディアとCmの50μLの50ミリリットルを追加します。 ミニ文化1100μlのミニ文化2に接種し、8時間、220 rpmで37℃でインキュベートする。 3日目 表3の4の空の滅菌50ミリリットルファルコンチューブとレコード質量を量る。氷上でファルコンチューブを冷やし、これらは続いて、ステップ1.18において使用されるであろう。 ステップ1.8の後に7時間と30分、最終的な細菌培養培地を準備。無菌1リットルのメスシリンダーに使用して、の2×YT + Pメディアiの660ミリリットルを転送37℃〜6 4のL三角フラスコと事前暖かいの各30分間NTO 注4 L以上三角フラスコは、適切エアレーションをお勧めします。 各4Lの三角フラスコにミニ文化2の6.6ミリリットルを追加します。培養物は、（中間対数増殖期に相当）600nmで1.5〜2.0のODに達するまで、220rpmで、37℃でインキュベートする。 。 対数期中期の間に急速な成長とコレクションはエキスの品質のために重要である。3時間45分-精度1:10培養希釈液を用いて定期的にODをチェックして、このステップはせいぜい3時間を取る必要があります。 すぐに成長した後、細菌細胞をペレット化し、4℃で12分間5000×gで4 1Lの遠心ボトルや遠心分離機に均等にすべての文化を転送する。 1 M DTT予め調製S30Aの2 Lの4を添加することにより、完全なS30A緩衝液調製物を遠心分離している。混合し、氷の上にバッファを維持する。 遠心分離が完了すると、完全にデカでステップ1.12から上清を除去ntingし、滅菌ペーパータオルの上遠心ボトルブロッティング。 4遠心ボトルのそれぞれに4℃でS30Aの緩衝液200 mLを加え、 ペレットが完全に無い残りの塊で可溶化するまで激しくボトルを振る。 4℃で12分間5000グラムで4ボトルを遠心分離完全無菌ペーパータオルの上遠心ボトルをデカントし、ブロッティングにより、前のステップからの上清を除去します。 繰り返して1.15と1.16を繰り返します。 各遠心分離ボトルに4℃で40ミリリットルS30Aバッファーを追加します。 。）1.9から冷やしたファルコンチューブに各ペレットとS30Aの組み合わせを転送注：この手順では、より小さな容器にペレットを転送することです。 4℃で8分間、2,000 gでファルコンチューブを遠心分離するデカントにより上清を除去します。 遠心分離機 – 再ファルコンチューブを4℃で2分間2,000 gで完全にピペットで残留上清を除去。氷の上においてください。 Fの重​​さ表3のペレットとレコード質量とのファルコンチューブ。ペレット質量、必要なS30Aのバッファ量、および表3の具体的な式に基づいて必要なビーズの質量を計算します。 ペレットの正しいロードとビーズビーティング、品質エキスを作るために重要であり、最も困難なステップです。これは、しようとする前に、ビデオを見直すことをお勧めします。気泡を避け、均一にビーズを分散しないと、非効率的な抽出をもたらす。 均一になるまで、各ファルコンチューブ、渦に表3で計算S30Aバッファの量を追加し、氷に戻ります。 30秒間ボルテックス、 各総ビーズの1/3を用いて、3つのアリコートに単一ファルコンチューブに間欠的にビーズを加える。ビーズの各アリコートを添加した後、氷上で他のファルコンチューブに保ちつつ。渦ステップ間と最終ボルテックスした後、氷上でファルコンチューブを配置します。最後のアリコートを添加した後、 確実にビーズが均一に分布している。濃厚なペーストを形成する必要がある。 3〜4ミリメートルの開口部を作成するために、滅菌カミソリの刃を使用して端をカットして5ミリリットル（ボリューム）ピペットチップを準備します。 2mlまでピペットをダイヤル注：異なるピペットセットと先端がプル厚いビード細胞溶液を放出するのに十分でないかもしれない吸引の異なる量を提供し、除去端で1mlピペットチップを代わりに使用することができる。 氷上で20ビーズビーティングチューブを配置します。 修正されたピペットを用いて細胞 – ビーズ溶液の粘度が高いことを確認します。それはほとんど排出中ピペットチップを終了点までの粘性である必要があります。粘度が高すぎる場合は、1.25のステップに応じてピペットチップを再調整。十分に粘稠ではない場合、ビーズは、（ ペレット塊* 5.1）の最大質量（ ペレット質量* 0.05）の増分で添加することができる。ビーズの各添加後、30秒間ボルテックスし、氷上に戻ります。粘度のデモンストレーションのための図3aを参照してください。 修正されたピペットを用いファルコンチューブからビーズ細胞溶液を外し、無菌ビーズビーティングチューブに移す、それをビーズ細胞溶液との完全な四分の三を埋める。ビーズを再分配することなく、気泡を除去するためにカウンターミニ遠心機に極めて短時間（1秒）をスピン。ビーズ破っチューブ搭載の静止画像については、図3B-Dを参照してください。 凹メニスカスを形成するために、ビーズ細胞溶液の追加を終了。 キャップの外側の縁を妨げないように注意しながら 、ビーズ破っチューブキャップの内 ​​側にビーズ細胞溶液の非常に小さなドロップを追加し、そうでなければ、ビード打ちチューブが近いsufficientl y としません。平らな面にキャップをタップして、 キャップの底に気泡がないことを確認してください 。 前のステップからのビーズ破っキャップをビーズビーティングチューブにキャップ。ビーズビーティングのアシスタントに手。正しく行われた場合は、 キャップをしっかりと気泡がshoul、密封されるべきである表示さD、およびほとんど（もしあれば）ビーズ細胞液がオーバーフローする必要があります。気泡が表示されているか、キャップが完全に閉じない場合は、ロード処理をやり直す。 ビーズの均一な分布を保証するために、残りのビーズ – 細胞溶液と工程1.24から渦ファルコンチューブ。ファルコンチューブが空になるまで繰り返して1.31に1.28を繰り返し、そして繰り返して、各追加Falconチューブ用に1.31に1.24を繰り返します。 行為は、同時に1.38に1.33を繰り返します 。氷上で1.31と場所からアシスタントテイク埋めビーズ破っチューブを持っている。 2満たされたビーズ破っ管が収集されているし、少なくとも1分間氷上にされると、ビーズ打撃を開始します。 46 rpmで30秒間1のチューブを破った。他方のチューブを破っながら30秒間氷上で逆さまに置きます。 各満たされたビーズ破っ管が1分、合計でビートされているように、前の手順を繰り返します。 繰り返します8満たされたビーズビーティングチューブ（または遠心分離機が保持できる最大量）Hまで1.35まで1.33ステップ処理されていAVE。次いで、15mlのファルコン（ 図3e）からフィルタ装置を構成する。 15ミリリットルファルコンの底に、新しいビーズ破っキャップ、フラット部分のフェイスアップを追加します。 完全に密閉する ​​まで 、 しっかりと処理されたビーズ鼓動チューブの端部に処理されたビーズ暴行チューブを押しマイクロクロマトグラフィーカラムからキャップを取り外します。マイクロクロマトグラフィーカラムの溶出端をスナップ、およびマイクロクロマトグラフィーカラムを配置し、溶出は空のビーズビーズ管に、ダウン終了。 15ミリリットルファルコンにこの複雑に配置します。全8埋めビーズ打つ管について、この手順を繰り返し、完了すると、氷上に保つ。 ビーズから抽出し、ペレットを分離するため、4℃で5分間6000グラムで遠心8のフィルタ装置、ファルコンチューブキャップを外し、。 各ビーズ·ビーティング管が実行可能なエキスを生産していることを確認します 。きちんとビート抽出物は濁っできなくなり、ペレットを2つの別個の層を持つことになります。私はすべての濁ったチューブを破棄し、非濁ったチューブから上清を転送個々の1.75ミリリットルのマイクロ遠心管NTO、 可能な限り少ないペレットを取る 。すべてのビーズビーティング管が処理されるまで氷上で保管してください。正しく対間違って処理されたビーズビーティングチューブを比較3fは図を参照してください。 4℃で10分間12,000 gで、前のステップからの遠心微量遠心管ピペットを使用して、空のビーズビーティングチューブに転送ペレットを含まない上清を 、新しいビーズ破っチューブに500μlのを統合。 80分間220回転、37℃で、 削除ビーズ破っキャップで 、前の手順をインキュベートする。この工程は、ビーズビーディング工程中に放出され、内因性エキソヌクレアーゼを用いて核酸を残りの消化、および組織培養チューブ中のビーズ拍動チューブを起立することによって行うことができる。 透析材料を準備します。 1 M DTT予め調製S30Bの2 Lの2 mlを添加することにより、完全なS30B緩衝製剤。混合し、2番目のそれぞれに900ミリリットルを追加1Lのビーカーerile。各ビーカーに、無菌磁気攪拌機を追加し、4℃で保管しステップ1.41の後、 抽出物は、濁っているはずです 。 1.75ミリリットルマイクロ遠心管中で1.5ミリリットルのアリコートにエキスを統合し、4℃で10分間12000グラムで遠心ピペットを用いて、氷上で15ミリリットルファルコンチューブにペレットを含まない上清を統合し 、チューブをキャップし、反転させてよく混ぜます。 ステップ1.47氷上で10μlの上清を保存します 。 生産抽出物の総量を決定し、カセットにつき、抜粋の2.5ミリリットルを仮定して、2分間S30Bに浸すことにより10K MWCO透析カセットの必要な数を水和。 抽出液2.5ミリリットルとカセットをロードします。各ビーカーに2カセットかかることがあります。透析、3時間、4℃で、攪拌しながら注意：カセットの部分負荷が許容される。透析は、タンパク質産生の収率を増加させる。 前のステップの間に、タンパク質抽出物を特徴づけるステップ1.44で保存された抽出液を用いてBradfordアッセイで濃度。詳細については、 補足資料2を参照してください。 透析は1.75ミリリットルマイクロ遠心管中で1.5ミリリットルによって分量エキス、完了した後。 4℃で10分間12,000 gで遠心分離ペレットは、チューブの底部に形成される。 氷上で15ミリリットルファルコンチューブにピペッティングして、前のステップから透明な上澄みを統合。 5〜10倍を反転させることにより均質化する。 ステップ1.47においてブラッドフォードによって決定された濃度に基づいて、個々の1.75ミリリットルチューブにアリコートに抽出物の量を決定します。 個々のチューブは、全タンパク質の810から900 mgのボリュームを持っている必要があります。抽出物は、27 mg / mlのより高い総タンパク質濃度を持っている必要があります。 例えば、30μlの28 mg / mlので分量エキス、および分量エキス32で、濃度が高ければアリコート30μlのアリコートに30 mg / mlの以下の抽出、およびスケール： この手順では、便宜的に 注意を 行うための支援を必要とする28.1μLによるmg / mlの。 気泡を避けるように注意しながらステップ1.50以下の分量の抽出物。液体窒素中でフラッシュ凍結抽出注：泡アリコートを4℃で30秒間、10,000×gで遠心分離することにより除去することができる ストレーナーを用いて液体窒素からチューブを外し、すぐに-80℃に安全で格納します。保護メガネを着用して、抽出管のキャップは、液体窒素と室温との温度差に外れがあります 。 2。アミノ酸溶液の調製アミノ酸溶液を大量に準備する必要があります。以下のレシピは、約11,000の単一反応のために十分な供給、RTSアミノ酸サンプラーの1フルキットを利用しています。スケールダウンした場合、それが無いの半分以下のキットを使用することをお勧めします。在庫の各アミノ酸は、140 mMのロイシンを除いて、1.5ミリリットル、168ミリモルで供給される。アミノ酸溶液の最終組成は次の通りである：ロイシン、5mMの他のすべてのアミノ酸、6 mMの。これは、4×作業濃度である。 -20°Cから20アミノ酸すべてを削除し、室温で解凍する。一度解凍したアミノ酸まで、渦は、必要に応じて、37℃でインキュベートし、溶解する。アミノ酸が溶解した後、 室温に保持されているのAsn、Pheであり、およびCysを除く氷上で全てのアミノ酸を置く。 Cysが完全に溶解しないことがあります 。 氷の上に、滅菌した50ミリリットルファルコンチューブに滅菌水12ミリリットルを追加します。 各添加後ファルコンチューブをボルテックスし、氷上で溶液を準備しておくように注意しながら、 次の順序で各アミノ酸の1.5ミリリットルを追加します。アラ、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、彼の、イル、リジン、会ったのPhe、Proは、セリン、スレオニン、ヴァル、トリプトファン、チロシン、レイ、システイン。 Cysが付加した後、渦が溶液になるまで、必要に応じて、37℃でインキュベートし、比較的明確である 。懸濁液として添加することができる。 Cysが完全に溶解しないことがあります 。 50チューブに一定分量アミノ酸ソリューションで氷上で26μlをそれぞれ。氷上でチューブあたり500μLの残りを分取。 頻繁に 26μlのアリコートを500μlのアリコートを緩衝液を調製するために使用され、一方アリコートいるが 、抽出物を較正するために使用される、主渦ストック懸濁液の不均一な分布を回避する 。 -80℃の安全で液体窒素とストア内のフラッシュフリーズ分量：保護メガネを着用して、抽出管のキャップは、液体窒素と室温との温度差に外れがあります 。 オプション：以前に作られたアミノ酸·ソリューションに対して、新たに作られアミノ酸液の活性アッセイを実施する。 3。エネルギーソリューションの準備エネルギーソリューションは、粗細胞抽出物を較正するための、バッファを作成するための両方に使用され、大量に調製すべきである。以下のレシピは、約10000の単一反応のために十分に供給します。スケールダウンした場合、それはrecommeです劣らず、ここで指定した値の1/24以上を使用しないことnded。エネルギーソリューションが重要な金銭的コストであるので、初めてのユーザーは、1/24スケールで準備することができます。エネルギーソリューションの最終組成は、HEPES pHは8 700 mMのATP 21 mMの、GTP 21 mMの、CTP 12.6 mMのUTP 12.6 mMの、tRNAの2.8 mg / mlの、CoAの3.64 mMの、NAD 4.62 mMのキャンプ10.5mmで、フォリン酸0.95 mMのスペルミジン14 mMの3-PGA 420 mMの。これは、14倍作業濃度である。所望であれば、 表4のそれぞれの個々の項目は、後で使用するために-80℃で保存することができる。 -80°Cから表4のすべての化学物質を除去、-20、30分間室温にCまたは4゜C°。 表4で説明したようにストック溶液を準備します。レシピの補足資料1を参照してください。調製後氷上ですべてのソリューションを配置します。 15ミリリットルファルコンチューブに、各添加後ファルコンチューブをボルテックスに注意しながら、 以下の順序で追加およびoソリューションを維持するN氷：3.6ミリリットル、2M HEPES、144μlの水、1.39ミリリットルヌクレオチド混合物、576μlの50 mg / mlのtRNAを、576μlの65 mMのCoAを、276μlの175 mMのNAD、170μlの650 mMのcAMPを、288μlの33.9 mMのフォリン酸、144μlの1 Mスペルミジン、および3.09ミリリットルの1.4M 3-PGA。 氷上7μlのそれぞれで50のチューブに一定分量エネルギーソリューション。氷上でチューブあたり150μLの残りを分取。 150μlのアリコートを緩衝液を調製するために使用され、一方7μlのアリコートを分注、渦メイン在庫ながら頻繁に 、抽出物を較正するために使用される。 -80℃の安全で液体窒素とストア内のフラッシュフリーズ分量：保護メガネを着用して、抽出管のキャップは、液体窒素と室温との温度差に外れがあります 。 オプション：以前に行ったエネルギーソリューションに対する新た作らエネルギーソリューションの活性アッセイを実施する。 4。バッファの準備 BUFFER準備粗細胞抽出物の準備、アミノ酸溶液の調製、およびエネルギーソリューションの準備が完了したことを必要とします。 各バッファは、粗細胞抽出物のバッチに固有のものである 。 MG-グルタミン酸、K-グルタミン酸、およびDTTは（この順番で）式の最大レベルとの反応を生成するには、このセクションの最適化されています。以下のプロトコルは、事前に書かれたテンプレート、TXTL_e（テンプレート）_calibration_JoVE.xlsx（ 補足資料3）、事前に調製した粗細胞抽出物を校正し、バッファを準備するために利用します。しかし、一つはまた、粗細胞抽出物を較正し、手動でのMg-グルタミン酸、K-グルタミン酸、およびDTTを最適化し、抽出物と一緒に、それは総反応容量の75％であるようなバッファを設定することでテンプレートなしのバッファを準備することができる。手動で校正する場合は、最終的な反応条件は、ステップ5に記載されています。 「一般データ」フォームに入力します。 氷の100mMのMg-グルタミン酸（4°C）、3 M K-グルタミン酸（4°C）、6上の融解mMのアミノ酸液（26μL、-80℃）、エネルギーソリューション（7μL、-80℃）、100のDTT（-20℃）で、ポジティブコントロールDNA（-20℃）で、40％のPEG- 8000（4℃）、粗細胞抽出液（-80℃）、水（4℃）（注）を使用し1 nMの使用濃度pBEST-OR-OR 1-PR-UTR1-deGFP-T500（Addgeneプラスミド40019）陽性対照（励起485 nm、発光525 nm）を、又は高信号強度を生成するために別の参照 図4 個々のマイクロ遠心分離管に株式のMg-グルタミン酸のセット量を小分けすることにより、4月10日mMの追加のMg-グルタミン酸の範囲をテストして、7 10.5μLの反応を準備します。注：10.5μLの反応が最初に製造されていますが、最終的な反応は、10μLです。 K-グルタミン酸の余分な80ミリメートル追加」のMg-グルタミン酸キャリブレーション」の下のテンプレートに示されるように、マスターミックスを調製する。 各項目を加えた後 、氷とボルテックスに保つ注意：ここに、テンプレートで指定された値は次のとおりです。のMg-グルタミン酸、K-グルタミン酸、粗細胞抽出物を作製するために使用S30B緩衝液中のDTTの存在量に加えて。 Mgをグルタミン酸を含むサンプルにマスターミックスを追加し、反応を準備します。手順詳細な手順については、5.13に5.10を参照してください。 インキュベーターやプレートリーダーのいずれかで、29℃で反応を行う。 エンド発現レベルおよびタンパク質発現（ 図4a）の最大速度によって最適のMg-グルタミン酸濃度を測定注：ランタイムは、実験に応じて異なりますが、通常8時間の下の最後の。 繰り返しますが、ステップ4.7に見られるものとのMg-グルタミン酸レベルの設定」、K-グルタミン酸キャリブレーション」の下で、K-グルタミン酸4.2 4.7を繰り返します。 繰り返しますが、ステップ4.8に見られるものとステップ4.7とK-グルタミン酸のレベルに見られるものとのMg-グルタミン酸レベルの設定」を、DTTのキャリブレーション」の下に、DTTのために4.7に4.2を繰り返し注意：我々は、DTTが大幅にエンドツーエンドの影響はありません追加することを見出した発現レベル。 使用調製するためのバッファの組成を決定するために「バッファ組成物」の下で、キャリブレーションで検出された値。産粗細胞抽出物の量に基づいて、マスターミックスレシピは、バッファの設定量のために生成される。 氷上のマスターミックスレシピに記載されている分量を解凍する。解凍した後は、 各項目を加えた後 、氷とボルテックスに保ち、マスターミックスを調製する。 下に記載された金額によって一定分量「バッファー組成。 "液体窒素中でフラッシュ凍結バッファチューブ。 頻繁に、渦の主要な株式を小分けしながら 。 ストレーナーを用いて液体窒素からチューブを外し、すぐに-80℃に安全で格納します。保護メガネを着用して、抽出管のキャップは、液体窒素と室温との温度差に外れがあります 。 5。 TX-TL反応の実験的実行最終的な反応条件は以下のとおりです。8.9から9.9 mg / mlのproteロイシン、1.25 mMのロイシン、50のHEPES、1.5mMのATP及び除いて（粗抽出液からの）中で、4.5 MM-10.5mmでのMg-グルタミン酸、40〜160のK-グルタミン酸、0.33から3.33のDTT、1.5 mMの各アミノ酸GTP、0.9mMのCTPおよびUTP、0.2 mg / mlのtRNAを、0.26 mMのCoAを、0.33 mMのNAD、0.75ミリモルのcAMP、0.068 mMのフォリン酸、1mMスペルミジン、30 mMの3-PGA、2％のPEG-8000。 基本的なテキサス州粗細胞抽出物、緩衝液、およびDNA：-TL反応は、3部（管）を有する 。比は、75％のバッファとエキス、25％のDNAの反応は、音量を変えることができる 、と私たちは反応容量を最小限に抑え、384ウェルプレート内で実行可能にするために慣習的に10μlを使用する。より大きなボリュームが適切な酸素のための攪拌を必要とする。以下のプロトコルは、10μlの反応を行い、事前に書かれたテンプレート、TXTL_JoVE.xlsx（ 補足資料4）を利用する。 紫色の項目は、ユーザーの入力値を示しており、青色の項目は、反応に追加する追加の試薬 ​​を示している 。しかし、1はまた、反応のウィットを行うことができる上記で概説した反応条件に従うことによって、テンプレートホウト。 「一般データ」フォームに入力します。 下の「マスターミックスの準備、「紫色の箱にステップ4.1から抽出パーセント値を挿入します。 「マスターミックス準備」（行10から17）と「DNAの準備」（行19-50）のセクションを使用してin silicoであなたの実験を設計します。変数は「DNAの準備"セクションに入れることができますが、一般的に、定数は、「マスターミックスの準備」セクションに入れることができます。 サンプルの蒸発濃縮およびサンプル、実験開始時間の偏りを避けるために、実験ごとのサンプルを最小限に抑えます。サンプルのセットアップについては、図6を参照してください。 下の「マスターミックスの準備、「一定の濃度で、全てのサンプルで行くような誘導物質やタンパク質などの試薬を加える。行14からは、青い影の部分を記入し、各ラインに1試薬を保つ。単位は相対比である。 下の「DNAの準備、「サンプルspecifなり、DNAを追加IC。試料を陽性および陰性対照に対するIDが＃1、＃2に対応、それぞれサンプルIDは上記の＃3とは、ユーザーが変更可能なDNAについては、NG /μL中のストック濃度、塩基対の長さ、nM単位所望の最終濃度、および（10μlの反応の）繰り返しである。所望の最終濃度に到達するまでのストックDNAの量が自動的に算出される。 nは繰り返しの数であることに注意してください 10.5行の和での合計* nは、：最終反応容量は10μlのですが、計算がピペッティングの際に失われたボリュームを考慮して、反応あたり10.5μLの総容量を想定しています。 下の「DNAの準備、「青の列に特定のサンプルになります試薬または追加のDNAを追加します。検体特異的試薬は、10.5×nの総反応体積に基づいて、手動計算を必要とするnMのストックDNA濃度」は、DNAの調製」で算出することができる。入力されたボリュームは、同じ行の水量から減算される。 必要なnumbeを削除-20℃または-80℃〜からバッファ、粗細胞抽出物、および下の陽性対照の試験管 "解凍チューブ」のRとを氷上で溶かす。 DNAサンプルを準備します。室温での各サンプルのID、マイクロ遠心管に分量外指示されたDNAは、水、および「DNAの準備」セクションごとにユーザーが指定したアイテムを、のための注意：サンプルの損失を避けるために、最近ではキャリブレーションピペットと低スティックピペットチップおよびマイクロ遠心管を推奨します。 ステップ5.7からの管が解凍されている場合、 各項目を加えた後 、氷とボルテックスに保ち、バッファ、エキス、オレンジ-影の箱に基づいて任意のグローバルユーザーが指定した項目からなるマスターミックスを調製注：抽出は非常にある粘性。泡アリコートを4℃で30秒間万×gで遠心分離により除去することができる 各DNAサンプルに「DNAの準備」（列0）の下で、オレンジ色のセルに示されたマスターミックスの量を追加し、部屋の温度に保つTURE。 反応開始時間として扱う 。 渦それぞれのサンプル、および残留サンプルをダウンさせると、気泡を減少させるために室温で30秒間万×gで遠心分離します。 微量遠心管で反応を行う場合は、29℃で直接インキュベートそうでなければ、384ウェルプレートにピペット10μlのサンプル注：10μLより大きいボリュームでの反応は、酸素化のための攪拌が必要な場合があります。 残留サンプルをダウンさせると、気泡を減少させるために室温で30秒間、4,000×gで遠心分離プレート。蒸発を防ぐために、その後のプレートをシール。 29℃（注）で動作反応：ランタイムが実験に応じますが、通常8時間の下の最後異なります。