Выделение микрососудистой эндотелиальных трубок от сопротивления мышь автомагистралях

1. Подготовка оборудования: проточной камеры, пипетки, и решения Расход камеру: Используйте проточную камеру с 24 мм х 50 мм покровным стеклом на дне, чтобы переливать изолированные эндотелиальные трубки (см. Рисунок 1a). Перед сборкой камеру, мыть покровные стекла и с 3% HCl и 70% этанола, промыть сверхчистой водой и сушат газообразным азотом. Пипетки: три различных типа пипетки используются во время протокола: катетеризация, растирание и закрепление. Как катетеризации и пиннинга пипетки может быть сделано до день эксперимента, но растирание пипетки должны быть сделаны в день, так как требует знания о диаметра сосуда на просвет размером соответствующим образом. Катетеризации пипетки: Для того, чтобы избавиться эритроциты из просвета, тянуть из боросиликатного стекла капилляров с помощью микропипетки съемник иметь длинные, сужающиеся концы. Перерыв концы с пинцетом в наружным диаметром ~ 30% лесс, чем у артерий (~ 50-80 мкм) и пожарной ногтей кончиком быть гладкой (см. рисунок 1b). Это полезно также угол кончики пипеток примерно 45 °. Растирание пипетки: Для механически отделить гладкомышечных клеток и адвентиции из эндотелиальных трубок, делают растирания пипетки из боросиликатного стекла капилляров. Подготовка капиллярные трубки, как описано выше, и сломать конец щипцами. Совет: Используйте стекло забил устройство, чтобы сделать его проще сломать толстую стенку растирания пипетки стекла чисто. Перерыв пипетку с внутренним диаметром, определенной на день эксперимента, примерно 10-20 мкм больше, чем у наружного диаметра сосуда, из которого эндотелиальные трубки будут изолированы. Огонь польский сломанные концы до получения однородной массы (см. рисунок 1С). Закрепление пипетки: Для стабилизации эндотелия трубку в камере потока, сделать возлагают пипетки для обеспечения эндотелия тUbe против покровное нижней части камеры. Извлеките стеклянные капилляры таким же образом, как и катетеризации пипеток. Затем разбейте концы с пинцетом до диаметра ~ 100 мкм, и пожарной ногтей до кончики не запечатаны, округлые и гладкие (см. рисунок 1D). Примечание: Если кончик пиннинга пипетки не полностью герметична, жидкость будет ввести просвет и может вносить путаницу в результаты эксперимента. Решения: Подготовка всех решений в сверхчистых (18,2 МОм) H 2 O и стерилизовать их через фильтр 0,2 мкм. Убедитесь, что осмотическое давление растворов между 285-300 мосм. Решения остаются хорошими в течение примерно двух недель при хранении при 4 ° С. Препарирование раствор: раствор соли используется при вскрытии верхней эпигастральной артерии состоит из (в ммоль / л): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты ( HEPES), 10 глюкозы, 0,01 нитропруссид натрия (SNP),г 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) с рН 7,4. Донор SNP НЕТ входит, чтобы помочь расслабиться гладкомышечных клеток, что делает их легче иглу артерию и для облегчения удаления клеток гладкой мускулатуры во время растирания. Диссоциации раствор: раствор соли используются при диссоциации эндотелиальной трубки состоит из (в ммоль / л): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 глюкозы, 2 CaCl 2 и 0,1% БСА, с рН 7,4. К 1 мл аликвоты этого буфера, добавьте: 0,62 мг / мл папаин, 1,5 мг / мл коллагеназы и 1,0 мг / мл дитиоэритритола. Поскольку ферменты от различных поставщиков могут иметь различные уровни активности ферментов, номера продуктов, которые используются для этой работы включены ссылки в таблице материалов для. Примечание: В протоколе как буфер диссоциации и диссоциации буфера с ферментами используются на различных этапах. Суперфузии решение: физиологический солевой раствор (PSS), используемый для superfusinг изолированный эндотелиальной трубки состоит из (в ммоль / л): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 глюкозы и 2 CaCl 2, с рН 7,4. Подготовка буферов и решения перед началом хирургических процедур. Удалите решения от 4 ° С и аликвоты 50 мл вскрытия буфера в колбу 200 мл Эрленмейера и поместить его на льду. Кроме того, аликвотные 50 мл диссоциации буфера без ферментов и поместить его на скамейке верхней, чтобы уравновесить до комнатной температуры. Снимите суперфузии решение от 4 ° С и позволить ему, чтобы уравновесить до комнатной температуры на поверхности стола. 2. Подготовка животных Убедитесь, что все процедуры и протоколы с участием животных являются в соответствии с Национальными Институтами Руководство здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Процедуры, описанные здесь были утверждены уходу и использованию животных комитета университета поМиссури. Используйте мужской или женский мышей, по крайней мере 9 недель и изучать каждый в отдельности. Обезболить мышь пентобарбиталом натри (60 мг / кг) через внутрибрюшинно (IP) инъекции. Подсказка: Разбавление пентобарбитала 10 мг / мл в стерильном физиологическом растворе перед введением уменьшает возможность передозировки. Анестезия компромиссы регулирование температуры, так что держите мышь согреть сразу после первой инъекции пентобарбитала. Используя металлическую несущую (вентилируемые алюминиевая корзина) в верхней части нагревательной пластины (калиброванной до ~ 37 ° С) хорошо работает, чтобы держать стабильной температуры мыши. Вместо этого можно использовать инфракрасную лампу, заботясь, чтобы расположить его на соответствующем расстоянии от мыши. Монитор мышью каждые 5-10 минут, пока соответствующий уровень анестезии не будет достигнута (отсутствие вывода до пят или хвост щепотку). Дополнительный доза может потребоваться после 15-20 мин. Лучше всего, чтобы действовать медленно и осторожно, чтобы избежать передозировки, особенно с ожирением, в возрасте, или животногоы иначе подчеркнул. Удалить волосы с брюшной стороны, тщательно бритья его с небольшими ножницами шерсть домашних животных. Особое внимание должно быть принято, чтобы избежать травмы животного. Это полезно, чтобы удалить все волосы из области, охватывающей подмышки к лобковой области. Удалите свободно цепляясь волосы со свежим спиртовым тампоном. Поместите мышь на спине, лежа с обоих передних и задних конечностей разложенных выставить столько брюшной стенки, как это возможно. Если необходимо, используйте лабораторное ленту для фиксации ноги в орла с распростертыми крыльями образом. 3. Выделение артерии Улучшенный эпигастральной Сделать небольшой надрез через кожу чуть выше области лобковой области. Убедитесь, что только кожа сокращаются, избегая повреждения основного брюшной мышцы; продлить разрез с боков в каждом направлении, чтобы соответствующих задних конечностей. Продолжить разрез рострально вдоль вентральной срединной линии в верхней части грудной клетки ин продлить разрез в поперечном направлении в каждом направлении с соответствующими передних конечностей. Аккуратно поднимите кожу и используйте ножницы, чтобы разорвать соединительная ткань держит кожу к основной мышцы, тем самым подвергая всю поверхность брюшной мускулатуры (см. рисунок 3А). Промывать выставленный мышцы с комнатной температуры 0,9% солевого раствора. Из-за небольшого размера Море, Направление животное под стереомикроскопом для дальнейших процедур. Лифт жировой ткани, расположенной в нижней части грудины щипцами, и сделать разрез через него. Продолжить разрез вдоль нижнего ребра, убедившись, что не зайти слишком далеко в основной ткани. СЭО должны быть видны; заботиться, чтобы не повредить его. После того, как разрез будет завершена, орошать подвергаются ткани с комнатной температуры 0,9% солевого раствора. После того, как верхний слой скелетных мышц была втянута, море и основной мышцы легко идентифицируются. Совет: Обратите внимание на длинуСЭО в естественных условиях до изоляции расширить эндотелиальные трубки (которые укорачивают вокруг своей оси, при изоляции), чтобы приблизить свою первоначальную длину. Использование щипцов и ножниц, тщательно вырезать тонкую мышечный слой под морем. Использование угловые щипцы, пройти длину 6-0 шелковых шва под морем и перевязывать артерию и прилегающих к ней вену, чтобы держать его под давлением и кровь удерживается в просвете сосуда, чтобы облегчить визуализацию во время последующего выделения и очистки. Повторите процедуру перевязки СЭО на противоположной стороне. Как только оба СЭО были лигированы, сделать надрез вдоль средней линии брюшной мышцы, чтобы отделить соответствующие стороны. Расширение разрез в поперечном направлении в каждом направлении, что и для кожи, а затем продолжить разрез по вертикали вдоль внешнего края, чтобы полностью отделить брюшной мышцы из организма. Избегайте повреждения сосудистой подается на берегу моря, чтобы сохранить под давлением просвет. Сут СЭО над перевязки для поддержания печать, и поместите изолированную мышцу и артерии в 50 мл стакан, содержащий 10 мл 4 ° C рассечение буфера. Повторите процедуру для другой стороны живота и инкубировать ткани в буфере рассечение в течение 10 мин. Поместите брюшной мышцы, содержащий СЭО в охлажденном (4 ° С) рассечение камеру, содержащую рассечение буфера (см. рисунок 3B). Рассечение камера состоит из чашки Петри со слоем Sylgard (полидиметилсилоксана [PDMS]) в нижней части. Использование насекомых булавками (0,15 мм), растянуть изолированную СЭО и брюшной мышцы, чтобы приблизить Vivo длины в (указанных выше) и закрепить ее на Sylgard. Совет: Ориентируемся мышцы такой, что тонкий слой, обращенный к брюшины находится на вершине делает МОРЕ хорошо видна с помощью просвечивания. Используя тонкие микродиссекции инструментов и работает от вышестоящего месте перевязки кВыходной конец, не будет очищена на море с парного вены и окружающих тканей до первого капитального сайте филиала (1-2 см). Тогда акцизного СЭО путем разрезания его чуть выше сайт филиала и чуть ниже перевязки. Для удаления крови удерживается в просвете сосуда, иглу на море и смыть его с ледяным рассечение буфера. Использование кусок силиконовой трубки, установите заднюю конец канюли пипетки до 5 мл шприц, содержащий ледяной буфер рассечение и закрепите микропипетки в микроманипулятора позиционировать его кончик в рассечение камеры в иглу море. Как только все эритроцитов вымываются, удалите моря от катетеризации пипетки, и поднимите пипетки из рассечение блюдо. Разрежьте СЭО на более мелкие сегменты каждый 1-3 мм в длину. Эти более короткие сегменты облегчать отделение эндотелиальных трубок. 4. Выделение эндотелиальной Tube Заполните 12 мм х 75 мм стекла культ вЮр трубка полпути ледяной буфера рассечение. Использование угловые щипцы, передать артериальные части в пробирку и поместите на льду. В это время объединить переваривании ферментами с диссоциацией буфера до конечного объема 1 мл в отдельном 12 мм х 75 мм пробирку (см. 1.3.2 растворов) и предварительного нагрева раствора до 37 ° С с нагревательном блоке. В то время как буфер диссоциация и ферменты прогревается, тщательно аспирации буфер рассечение из культуральной трубы, оставляя небольшой объем содержащий сегменты сосудов. Аккуратно добавить номера температуры диссоциации буфера без ферментов, чтобы смыть оставшийся рассечение буфера. Совет: Добавить буфер диссоциации медленно, так что артериальные частей остаются на нижней части пробирку, чтобы сэкономить время ожидая их переселить. Повышение температуры буфера в течение нескольких шагах от льда (4 ° C), до комнатной температуры (~ 24 ° C), до 37 ° С, чтобы минимизировать шок. Тщательно аспирата dissociation буфер из культуральной трубки, снова будучи уверенным оставить небольшой объем содержащий сегменты сосудов. Снимите подогрева диссоциации буфера в присутствии ферментов нагревательного блока, перенести 1 мл раствора фермента в пробирку, содержащую сегменты сосудов, и поместите пробирку обратно в нагревательном блоке. Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин. Во время инкубации с ферментами, готовят растиранием пипетки засыпки его с минеральным маслом и закрепить его на микрошприцом, который установлен в микроманипулятор. Затем убрать микрошприцом поршень, чтобы заполнить пипетку с 2 NL диссоциации буфера и положение пипетки через проточную камеру. В конце 30-минутной инкубации, удалить пробирку из нагревательного блока и тщательно аспирата буфера, как указано выше. Вымойте артериальные сегменты с 4 мл комнатной температуры диссоциации буфера. Примечание: Это больше нет необходимости держать SEGM сосудовЭнты в нижней части культуральной трубки; артериальные нарушения части на самом деле помогает гарантировать, что остаточные ферменты эффективно удаляются. Передача сегмент одно судно в камеру потока, осторожно аспирационных его с 1 мл микропипетки, и поместить его в камеру потока 1 мл буфера диссоциации. Используя микроманипулятор содержащий микрошприца, поместите кончик тритурационного пипетки около одного конца сегмента сосуда. Аспирируйте сегмент сосудов (500 NL сняты) в растирая пипетки медленно (225 нл / сек), так, чтобы не вызвать механическое напряжение в ЭК, а затем извлечь ее обратно в камеру. Если пищеварение было успешным, гладкомышечные клетки и адвентиции будет отделена от эндотелиальной трубки. Повторите растирание, пока все клетки гладких мышц не разобщены. Имейте в виду, что чрезмерное растирание (4x или более) может привести к повреждению ECs и сделать их не реагируют на агонисты. Совет:с помощью растирания пипетки переместить адвентиции от эндотелия трубы как можно скорее, чтобы сохранить его от запутывания трубку. Примечание: Использование Растирание пипетку, изолированный эндотелиальных трубка может быть отсасывали и переносили в отдельную камеру. Установите эндотелиальную трубку в центре камеры потока, выровненной вдоль направления потока, и удалить растиранием пипетки. Безопасные пиннинга пипетки в микроманипуляторов установлен на любом конце проточной камеры, и позиционировать свои вершины на соответствующих концах эндотелиальной трубки. Нижняя закрепляющее пипетку в течение одного конца трубки к прижать ее к нижней части камеры. Поместите второй фиксации в пипетку так же, на противоположном конце трубки. Примечание: Размещение пиннинга пипеток является компромисс между обеспечения трубку (ставящий их дальше от конца трубы) и позволяет более изображений / экспериментальной области (размещая их ближе к концу трубки). Доступ ткромка ~ 50 мкм от каждого конца трубки работает хорошо. Так же, как пиннинга пипетка касается трубку, медленно втягивать его вдоль оси трубы, тем самым расширяя его аппроксимировать в естественных длину, а затем нажать пипетку с нижней камере, чтобы обеспечить трубки. Начните поток суперфузии раствор, и дайте эндотелия трубка отдыхать не менее 20 мин, чтобы уравновесить и придерживаться (см. рис 3C). Использование перистальтического насоса для поддержания постоянного потока жидкости (суперфузии) через эндотелиальной трубки. Примечание: Закрепление пипетки может быть удалена после того, как эндотелиальный трубка прикреплен к нижней части камеры потока (~ 25 мин) или оставить на месте, чтобы обеспечить эндотелиальной трубки не смещаться. 5. Краска Погрузка и Кальций изображений Для визуализации внутриклеточных ответов кальция, загрузите эндотелия трубку с фтор-4 утра красителя при комнатной температуре (~ 24 ° С). Стоп потока текучей среды в ванне, а также добавить Fluo-4AM к камере при конечной концентрации 10 мкМ. Подождите 10 мин, чтобы позволить краситель проникать в клетки, а затем переливать эндотелиальную трубку свежим PSS в течение 20 мин, чтобы обеспечить внеклеточный краситель удаляется и что внутриклеточный краситель был полностью деэтерифицируют. Выполните визуализацию кальция. По этой работе, прямой микроскоп (см. фиг.2) снабжен конфокальной системы визуализации вращающийся диск был использован при комнатной температуре. Excite флуоресцентный краситель кальция с 491 нм лазера и получать изображения (при 500-550 нм излучения), используя усиленную цифровую камеру.