Isolamento di microvascolare endoteliale tubi da arterie di resistenza mouse

1. Preparazione di apparecchiatura: camera di flusso, pipette, e soluzioni Flusso camera: utilizzare una camera di flusso con una x 50 mm coprioggetto di vetro 24 millimetri sul fondo per superfuse i tubi endoteliali isolate (vedi Figura 1A). Prima di montare la camera, lavare i vetrini con entrambi 3% HCl e il 70% di etanolo, sciacquare con acqua ultrapura, e asciugare con azoto. Pipette: Tre diversi tipi di pipette vengono utilizzati durante il protocollo: incannulamento, triturazione, e pinning. Sia l'incannulazione e pipette pinning possono essere effettuate prima del giorno dell'esperimento, ma la pipetta triturazione dovrebbero essere il giorno di quanto richiede la conoscenza del diametro del vaso di dimensioni lume appropriato. Pipette incannulazione: Al fine di lavare i globuli rossi dal lume, tirare tubi capillari in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta di avere le estremità lunghe, affusolate. Rompere le estremità con una pinza ad un diametro esterno ~ 30% less rispetto a quella delle arterie (~ 50-80 micron), e il fuoco lucidare la punta a essere liscia (vedi Figura 1B). E 'utile anche inclini le punte delle pipette a circa 45 °. Pipette triturazione: dissociare meccanicamente le cellule muscolari lisce e avventizia dai tubi endoteliali, fare pipette triturazione da tubi capillari di vetro borosilicato. Preparare tubi capillari come sopra, e rompere l'estremità con una pinza. Suggerimento: Utilizzare un dispositivo di punteggio vetro per rendere più facile rompere il muro più spessa del vetro triturazione pipetta pulito. Rompere la pipetta al diametro interno determinato il giorno dell'esperimento, circa 10-20 micron maggiore di quella del diametro esterno della nave da cui saranno isolati tubi endoteliali. Fuoco lucidare le estremità rotte fino a che liscio (vedi Figura 1C). Pinning pipette: Per stabilizzare il tubo endoteliale all'interno della camera di flusso, fare pinning pipette per garantire la endoteliale tUBE contro il fondo vetrino della camera. Tirare tubi capillari di vetro nello stesso modo come le pipette di incannulazione. Poi rompere le estremità con pinza ad un diametro di ~ 100 micron, e il fuoco lucidare fino a quando le punte sono sigillate, arrotondati e lisci (vedi Figura 1D). Nota: Se la punta della pipetta pinning non è completamente sigillato, il fluido entra nel lume e può confondere risultati sperimentali. Soluzioni: Preparare tutte le soluzioni in ultrapura (18,2 mW) H 2 O e sterilizzarli attraverso un filtro 0,2 micron. Assicurarsi che l'osmolalità delle soluzioni è compreso tra 285-300 mOsm. Soluzioni rimangono buone per circa due settimane se conservati a 4 ° C. Soluzione dissezione: La soluzione salina utilizzata durante la dissezione dell'arteria epigastrica superiore è composto di (in mmol / L): 137 NaCl, KCl 5, 1 MgCl2, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-etansolfonico acido ( HEPES), 10 glucosio, 0,01 sodio nitroprussiato (SNP), und 0,1% di siero albumina bovina (BSA) con un pH di 7,4. L'SNP donatore NO è incluso per aiutare a rilassare cellule muscolari lisce, rendendo così più facili da cannulare l'arteria e per facilitare la rimozione delle cellule muscolari lisce durante triturazione. Soluzione dissociazione: La soluzione salina utilizzata durante la dissociazione del tubo endoteliale è composto di (in mmol / L): 137 NaCl, KCl 5, 1 MgCl 2, 10, 10 HEPES glucosio, 2 CaCl 2, e 0,1% BSA, con un pH di 7,4. Per un 1 ml aliquota di questo buffer, aggiungere: papaina 0,62 mg / ml, 1,5 mg / ml di collagenasi e 1,0 mg / ml ditioeritritolo. Poiché gli enzimi di fornitori diversi possono avere diversi livelli di attività enzimatica, i numeri di prodotto di quelli utilizzati per questo lavoro sono incluse per riferimento nella tabella dei materiali. Nota: Durante il protocollo sia buffer di dissociazione e buffer di dissociazione con gli enzimi vengono utilizzati in diverse fasi. Soluzione superfusione: La soluzione salina fisiologica (PSS) utilizzato per superfusing tubo endoteliale isolato è composto di (in mmol / L): 137 NaCl, KCl 5, 1 MgCl 2, 10, 10 HEPES glucosio e 2 CaCl 2, con un pH di 7,4. Preparare tamponi e soluzioni prima di iniziare le procedure chirurgiche. Rimuovere le soluzioni da 4 ° C e aliquota 50 ml di tampone di dissezione in una beuta Erlenmeyer da 200 ml e posizionarlo sul ghiaccio. Inoltre, aliquote di 50 ml di dissociazione tampone senza enzimi e posizionarlo sul banco equilibrare a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di superfusione da 4 ° C e lasciarlo equilibrare a temperatura sul banco camera. 2. Preparazione degli animali Assicurarsi che tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali sono in accordo con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato cura degli animali ed uso dell 'Università diMissouri. Utilizzare maschio o femmine di topo almeno 9 settimane e studiare singolarmente. Anestetizzare un mouse con sodio pentobarbital (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) iniezione. Tip: La diluizione del pentobarbital 10 mg / ml in soluzione fisiologica sterile prima dell'iniezione riduce la possibilità di sovradosaggio. Anestesia compromette la regolazione della temperatura, in modo da mantenere il mouse calda immediatamente dopo la prima iniezione di pentobarbital. Utilizzo di un supporto metallico (cestello in alluminio ventilato) sopra una piastra di riscaldamento (calibrato a ~ 37 ° C) funziona bene per mantenere la temperatura del mouse stabile. In alternativa, utilizzare una lampada di calore, avendo cura di posizionarlo ad una opportuna distanza dal mouse. Monitorare il mouse ogni 5-10 minuti fino a quando il livello adeguato di anestesia è raggiunto (mancanza di recesso ai piedi o la coda pizzico). Una dose supplementare può essere richiesto dopo 15-20 min. E 'meglio procedere lentamente e con cautela per evitare sovradosaggio, soprattutto con obesi, di età compresa, o animales altrimenti sottolineato. Rimuovere i capelli dal lato ventrale da barba accuratamente con piccoli tosatrici pet. Particolare attenzione deve essere presa per evitare traumi all'animale. E 'utile rimuovere tutti i capelli da una zona che attraversa le ascelle alla zona pubica. Rimuovere tutti i capelli vagamente aggrappato con un tampone imbevuto di alcool fresca. Posizionare il mouse sulla sua schiena, sdraiato sia anteriori e posteriori degli arti sparsi per esporre come gran parte della parete addominale il più possibile. Se necessario, utilizzare il nastro laboratorio per fissare le gambe in maniera spread-eagle. 3. Isolamento della arteria epigastrica Superiore Fare una piccola incisione attraverso la pelle appena sopra l'area della regione pubica. Assicurarsi che solo la pelle viene tagliata evitando danni al muscolo addominale sottostante; estendere l'incisione lateralmente in ogni direzione verso rispettive arti posteriori. Continua l'incisione rostralmente lungo la linea mediana ventrale all'inizio della gabbia toracica e lan estendere l'incisione lateralmente in ogni direzione per rispettive arti anteriori. Sollevare delicatamente la pelle e usare le forbici per tagliare il tessuto connettivo che tiene la pelle al muscolo sottostante, esponendo in tal modo l'intera superficie della muscolatura addominale (Figura 3A). Irrigare il muscolo esposta con temperatura ambiente di soluzione salina allo 0,9%. A causa delle piccole dimensioni della VAS, posizionare l'animale sotto uno stereomicroscopio per ulteriori procedure. Sollevare il cuscinetto adiposo trova nella parte inferiore dello sterno con una pinza, ed effettuare una incisione attraverso esso. Continuare l'incisione lungo la costola inferiore, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità nel tessuto sottostante. La VAS deve essere visibile, fare attenzione per evitare di danneggiarlo. Una volta che l'incisione è completa, irrigare il tessuto esposto temperatura ambiente con soluzione salina allo 0,9%. Dopo lo strato superiore del muscolo scheletrico è stato ritirato, il mare e muscolo sottostante sono facilmente identificabili. Suggerimento: Nota la lunghezza diSEA in vivo prima di isolare estendere tubi endoteliali (che accorciano lungo il loro asse su isolamento) per approssimare la lunghezza iniziale. Utilizzando pinze e forbici, accise accuratamente lo strato muscolare sottile sotto la SEA. Utilizzando pinze ad angolo, passa una lunghezza di 6-0 sutura di seta sotto il mare e legare l'arteria e la sua vena adiacente a tenerlo sotto pressione e sangue conservato all'interno del lume del vaso per facilitare la visualizzazione durante il successivo isolamento e la pulizia. Ripetere la procedura di legatura mare sul lato controlaterale. Una volta che entrambi i mari sono stati legatura, fare un'incisione lungo la linea mediana dei muscoli addominali per separare i rispettivi lati. Estendere l'incisione lateralmente in ogni direzione come fatto per la pelle, poi continuare l'incisione verticalmente lungo il bordo esterno di separare completamente i muscoli addominali dal corpo. Evitare danni ai vasi alimentato dalla SEA per mantenere il lume pressione. Cut SEA sopra la legatura di mantenere la tenuta, e posizionare il muscolo isolato e arteria in un becher da 50 ml contenente 10 ml di 4 ° C buffer di dissezione. Ripetere la procedura per l'altro lato del ventre e incubare i tessuti nel buffer dissezione per 10 min. Posizionare il muscolo addominale contenente il mare in un (4 ° C) camera di dissezione contenente tampone dissezione refrigerata (vedi Figura 3B). La camera di dissezione consiste in una piastra di Petri con uno strato di Sylgard (polidimetilsilossano [PDMS]) nella parte inferiore. Utilizzando perni di insetti (0,15 millimetri), allungare la SEA isolata e muscoli addominali ad approssimare lunghezze in vivo (illustrato qui sopra) e fissarlo al Sylgard. Tip: Orientando il muscolo tale che lo strato sottile di fronte al peritoneo è in cima rende il mare facilmente visibile utilizzando transilluminazione. Utilizzando gli strumenti di microdissezione pregiati e di lavoro dal sito a monte della legatura verso l'estremità a valle, cancellare il mare dalla sua vena associato e il tessuto circostante fino a quando il primo sito ramo maggiore (1-2 cm). Poi asportare il SEA tagliandolo appena sopra il sito di succursale e appena sotto la legatura. Per rimuovere il sangue conservato all'interno del lume del vaso, incannulare la SEA e lavare con tampone di ghiaccio dissezione a freddo. Utilizzando un pezzo di tubazione di silastic, collegare l'estremità posteriore di una pipetta incannulamento di una siringa da 5 ml contenente ghiaccio tampone dissezione a freddo e fissare la micropipetta in un micromanipolatore per posizionare la punta all'interno della camera di dissezione per incannulare la SEA. Una volta che tutti gli eritrociti sono lavata, rimuovere la VAS dalla pipetta incannulamento, e sollevare la pipetta fuori del piatto dissezione. Tagliare la VAS in segmenti più piccoli ogni 1-3 mm di lunghezza. Questi segmenti più corti facilitano l'isolamento di tubi endoteliali. 4. L'isolamento del tubo Endothelial Riempire un cult 12 millimetri x 75 millimetri di vetroa metà tubo ure con ghiaccio buffer di dissezione a freddo. Utilizzando pinze ad angolo, trasferire i pezzi arteriosi nel tubo cultura e posto sul ghiaccio. A questo punto, unire gli enzimi digestivi con tampone di dissociazione per un volume finale di 1 ml in un 12 mm x 75 millimetri tubo cultura separato (vedi 1.3.2 Solutions) e preriscaldare la soluzione a 37 ° C con una piastra riscaldante. Mentre il buffer di dissociazione e gli enzimi sono in fase di riscaldamento, aspirare accuratamente il buffer dissezione dal tubo cultura lasciando un piccolo volume contenente i segmenti di flotta. Aggiungere delicatamente temperatura ambiente tampone di dissociazione senza enzimi per lavare via restante tampone di dissezione. Tip: Aggiungere la soluzione tampone di dissociazione lentamente in modo che i pezzi arteriose rimangono sul fondo della provetta di coltura per risparmiare tempo di attesa per il loro reinsediamento. Aumentare la temperatura tampone su più passi da ghiaccio (4 ° C), a temperatura ambiente (~ 24 ° C), a 37 ° C per minimizzare gli urti. Aspirare accuratamente la dissociation tampone dalla provetta cultura, ancora una volta avendo cura di lasciare un piccolo volume contenente i segmenti di flotta. Rimuovere il tampone di dissociazione preriscaldo con enzimi dal blocco termico, trasferire 1 ml di soluzione enzimatica nella provetta di coltura contenente i segmenti del vaso, e porre il tubo cultura nel blocco riscaldante. Incubare a 37 ° C per 30 min. Durante l'incubazione con enzimi, preparare la pipetta triturazione, reinterro con olio minerale e fissarlo su una microsiringa che è montato in un micromanipolatore. Quindi ritrarre lo stantuffo microsiringa per riempire la pipetta con 2 nl di tampone dissociazione e posizionare la punta della pipetta sopra la camera di flusso. Al termine dei 30 minuti di incubazione, rimuovere il tubo cultura dal blocco termico e con attenzione aspirare il tampone come sopra. Lavare i segmenti arteriosi con 4 ml di tampone di dissociazione temperatura ambiente. Nota: Non è più necessario mantenere il segm navegenitori nella parte inferiore della provetta di coltura; disturbare i pezzi arteriosi aiuta ad assicurare effettivamente che gli enzimi residui sono efficacemente rimossi. Trasferimento segmento un recipiente per la camera di flusso aspirando delicatamente con una micropipetta 1 ml, e posizionarlo nella camera di flusso di 1 ml di tampone di dissociazione. Utilizzando micromanipolatore contenente la microsiringa, posizionare la punta della pipetta triturazione vicino ad una estremità del segmento del vaso. Aspirare il segmento del vaso (500 nl ritirato) nella pipetta triturazione lentamente (225 nl / sec), in modo da non provocare sollecitazioni meccaniche alla EC, e poi espellerlo nuovamente nella camera. Se la digestione è stata eseguita correttamente, le cellule muscolari lisce e avventizia saranno dissociate dal tubo endoteliale. Ripetere la triturazione fino a quando tutte le cellule muscolari lisce sono dissociate. Essere consapevoli del fatto che la triturazione eccessivo (4x o superiore) può danneggiare la EC e renderli insensibili agli agonisti. Suggerimento:usando la pipetta triturazione, spostare il avventizia lontano dal tubo endoteliale appena possibile per evitare che impiglianti tubo. Nota: Utilizzando la pipetta triturazione, il tubo endoteliale isolato può essere aspirato e trasferito in una camera separata. Posizionare il tubo endoteliale nel centro della camera di flusso, allineate lungo la direzione del flusso, e rimuovere la pipetta triturazione. Sicuri pipette pinning in micromanipolatori montate alle estremità della camera di flusso, e posizionare le punte a rispettive estremità del tubo endoteliale. Abbassare una pipetta pinning su un'estremità del tubo per premere contro il fondo della camera. Posizionare la seconda pipetta pinning nello stesso modo all'estremità opposta del tubo. Nota: Posizionamento delle pipette pinning è un compromesso tra il tubo di fissaggio (mettendoli lontano dall'estremità del tubo) e consentendo un più immagini / area sperimentale (posizionandole più vicino all'estremità del tubo). Individuazione torlo ~ 50 micron da ciascuna estremità del tubo funziona bene. Così come la pipetta pinning contatto con il tubo, lentamente ritrarlo lungo l'asse del tubo, estendendo così di approssimare in vivo lunghezza e quindi premere la pipetta contro il fondo della camera per fissare il tubo. Iniziare il flusso della soluzione superfusione, e lasciare il tubo endoteliale riposare per almeno 20 minuti per equilibrare e rispettare (vedi Figura 3C). Utilizzare una pompa peristaltica per mantenere il flusso di fluido costante (superfusione) attraverso il tubo endoteliale. Nota: pipette Inchiodamento possono essere rimosse una volta che il tubo endoteliale ha aderito al fondo della camera di flusso (~ 25 min) oa sinistra per garantire il tubo endoteliale non è spostato. 5. Dye Caricamento e Imaging di calcio Per visualizzare le risposte intracellulari di calcio, caricare il tubo endoteliale con fluo-04:00 colorante a temperatura ambiente (~ 24 ° C). Interrompere il flusso del fluido nella vasca da bagno, e aggiungere fluo-4AM alla camera ad una concentrazione finale di 10 mM. Attendere 10 minuti per consentire al colorante di entrare nelle cellule, poi superfuse tubo endoteliale con PSS fresco per 20 min a garantire colorante extracellulare viene rimosso e questo colorante intracellulare è stato completamente deesterificata. Eseguire l'imaging di calcio. Per questo lavoro, un microscopio verticale (vedi figura 2) dotato di un sistema di imaging confocale disco rotante è stato utilizzato a temperatura ambiente. Eccitare il colorante fluorescente calcio con un laser 491 nm e acquisire immagini (a 500-550 nm di emissione) utilizzando una fotocamera digitale intensificata.