Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

1. Vorbereitung der Ausrüstung: Flusskammer, Pipetten und Lösungen Flusskammer: Verwenden Sie eine Strömungskammer mit einer 24 mm x 50 mm Deckglas auf dem Boden, die isolierten Endothelzellen Rohre (siehe Abbildung 1A) superfuse. Vor der Montage der Kammer, waschen Sie die Deckgläser mit beiden 3% HCl und 70% Ethanol gründlich mit Reinstwasser und trocken mit Stickstoffgas. Pipetten: Drei verschiedene Arten von Pipetten werden in der Protokoll: Zugänge, Zerreiben und Pinning. Sowohl der Kanülierung und Pinning Pipetten vor dem Tag des Experiments werden, aber das Verreiben Pipette sollte der Tag, wie es die Kenntnis der Durchmesser des Behälters erfordert, um die Größe des Lumens geeignet gemacht werden. Kanülierung Pipetten: Um rote Blutzellen aus dem Lumen spülen, Borosilikatglas Kapillaren mit einer Mikropipette Puller, lange, sich verjüngende Enden zu ziehen. Brechen die Enden mit einer Pinzette an einem Außendurchmesser ca. 30% less als die der Arterien (~ 50-80 um), und Feuerpolitur die Spitze glatt zu sein (siehe Abbildung 1B). Es ist hilfreich, auch Winkel der Spitzen der Pipetten auf etwa 45 °. Verreiben Pipetten: Um mechanisch distanzieren die Zellen der glatten Muskulatur und Adventitia von den Endothelzellen Rohre, stellen Verreiben Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren. Bereiten Kapillaren, wie oben, und brechen Sie das Ende mit einer Pinzette. Tipp: Verwenden Sie ein Glas Scoring-Gerät zu erleichtern, um die dickere Wand der Glaspipette Verreiben sauber brechen. Brechen die Pipette an den Innendurchmesser am Tag des Experiments etwa 10-20 um größer als die des äußeren Durchmessers des Gefäßes aus dem Endothel-Röhrchen isoliert werden bestimmt. Feuerpolitur die Bruchenden bis glatt (siehe Abbildung 1C). Pinning Pipetten: Zur Stabilisierung der endothelialen Rohr innerhalb der Durchflusskammer, stellen Pinning Pipetten, um die endotheliale t sichernUBE gegen das Deckglas Boden der Kammer. Ziehen Glaskapillaren in der gleichen Weise wie die Kanülierung Pipetten. Dann brechen die Enden mit einer Zange zu einem Durchmesser von ~ 100 um, und Feuerpolitur bis die Spitzen versiegelt sind, rund und glatt (siehe Abbildung 1D). Hinweis: Wenn die Spitze des Pinning Pipette nicht vollständig abgedichtet ist, wird Flüssigkeit in das Lumen eingeben kann und auch experimentelle Ergebnisse zu verwechseln. Lösungen: Alle Lösungen in hochreinem (18,2 M &OHgr;) H 2 O und sterilisieren durch einen 0,2 &mgr; m Filter. Stellen Sie sicher, die Osmolalität der Lösungen liegt zwischen 285-300 mOsm. Lösungen gut bleiben für etwa zwei Wochen bei 4 ° C gelagert Dissection Lösung: Die bei der Präparation der A. epigastrica superior verwendet Salzlösung wird von (in mmol / L) zusammen: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-Hydroxyethyl-N'-2-ethansulfonsäure ( HEPES), 10 Glucose, 0,01 Natriumnitroprussid (SNP), eind 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) mit einem pH-Wert von 7,4. Der NO-Donor SNP ist eingeschlossen, um zu entspannen glatten Muskelzellen, wodurch sie leichter, um die Arterie kanülieren und glatte Muskelzelle Entfernung während Verreiben erleichtern. Dissoziation Lösung: Das bei der Spaltung des endothelialer Gefäße verwendet Salzlösung von (in mmol / l) besteht aus: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose, 2 CaCl 2 und 0,1% BSA, mit ein pH-Wert von 7,4. In ein 1 ml-Aliquot dieser Puffer hinzuzufügen: 0,62 mg / ml Papain, 1,5 mg / ml Kollagenase und 1,0 mg / ml Dithioerythritol. Da Enzyme, die von verschiedenen Lieferanten unterschiedlichem enzymatische Aktivität haben, sind die Produktnummern der für diese Arbeit verwendet als Referenz in der Tabelle von Materialien enthalten. Hinweis: Während der Protokoll sowohl Dissoziationspuffer und Dissoziationspuffer mit Enzymen an verschiedenen Schritten verwendet. Superfusion Lösung: Die physiologische Salzlösung (PSS) für superfusin verwendetg der isolierten Endothelzellen Rohr aus (in mmol / l) besteht aus: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose und 2 CaCl 2, mit einem pH-Wert von 7,4. Bereiten Puffer und Lösungen vor Beginn der chirurgischen Eingriffen. Entfernen Sie die Lösungen von 4 ° C und 50 ml Aliquot Dissection Puffer in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben und legen Sie es auf Eis. Zusätzlich aliquote 50 ml Dissoziationspuffer ohne Enzyme und auf der Tischplatte auf Raumtemperatur kommen. Entfernen Sie die Superfusionslösung von 4 ° C und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur auf der Bank oben ins Gleichgewicht. 2. Vorbereitung der Tiere Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren und Protokolle mit Tieren sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität bestätigtMissouri. Verwenden männlichen oder weiblichen Mäusen mindestens 9 Wochen alt und studieren jeweils einzeln. Betäuben eine Maus mit Pentobarbital-Natrium (60 mg / kg) durch intraperitoneale (ip) Injektion. Spitze: Verdünnen der Pentobarbital 10 mg / ml in steriler Kochsalzlösung vor der Injektion verringert die Möglichkeit einer Überdosierung. Anästhesie beeinträchtigt Temperaturregelung, so halten Sie die Maus erwärmen unmittelbar nach der ersten Injektion von Pentobarbital. Mit einem Metallträger (belüftet Aluminium-Korb) auf einer Heizplatte (auf ~ 37 ° C kalibriert) funktioniert gut, um die Temperatur der Maus stabil zu halten. Alternativ können Sie auch eine Wärmelampe, kümmert sich um sie in einem angemessenen Abstand von der Maus zu positionieren. Überwachen Sie die Maus alle 5-10 Minuten, bis die entsprechende Ebene der Narkose erreicht ist (Mangel an Rücktritt bis Fuß oder Schwanz Prise). Nach 15-20 min kann eine Zusatzdosis erforderlich sein. Am besten ist es, langsam und mit Vorsicht vorgehen, um Überdosierung zu vermeiden, vor allem bei übergewichtigen, gealtert, oder Tiers anders betont. Entfernen Sie die Haare von der Bauchseite nach der Rasur sorgfältig mit kleinen Tierhaarschneidemaschinen. Besondere Aufmerksamkeit sollte getroffen werden, um ein Trauma des Tieres zu vermeiden. Es ist hilfreich, alle Haare aus einem Gebiet stammen aus den Achselhöhlen bis zum Schambereich zu entfernen. Entfernen Sie lose anhaftende Haare mit einem frischen Alkoholtupfer. Positionieren Sie die Maus auf den Rücken, wobei sowohl Vorder-und Hinterbeine verteilt, so viel von der Bauchwand wie möglich aussetzen liegt. Falls erforderlich, verwenden Labor Klebeband, um die Beine in einem Spread-Eagle Weise zu sichern. 3. Die Isolierung der A. epigastrica superior Einen kleinen Einschnitt durch die Haut unmittelbar über dem Bereich der Schamgegend. Stellen Sie sicher, dass nur die Haut wird geschnitten, während Vermeidung von Schäden an der zugrunde liegenden Bauchmuskeln, erweitern den Schnitt seitlich in jede Richtung aus, um entsprechende Hinterbeine. Weiterhin den Einschnitt rostral entlang der ventralen Mittellinie auf der Oberseite des Brustkorbs und dern verlängern den Schnitt seitlich in jede Richtung zu den jeweiligen Vorderbeine. Heben Sie die Haut und mit einer Schere durchtrennen das Bindegewebe hält die Haut an die darunter liegende Muskulatur, wodurch die gesamte Oberfläche der Bauchmuskulatur ausgesetzt (siehe Abbildung 3A). Spülen Sie die freiliegende Muskel mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung. Aufgrund der geringen Größe der SEA, positionieren Sie das Tier unter einem Stereomikroskop für weitere Verfahren. Heben Sie die Fettpolster an der Unterseite des Brustbeins mit einer Pinzette entfernt und einen Einschnitt durch. Setzen Sie den Schnitt entlang der unteren Rippe, dabei nicht zu tief in das darunter liegende Gewebe zu schneiden. Die SEA sollte sichtbar sein, darauf achten, nicht zu beschädigen. Nachdem der Schnitt fertig ist, bewässern die freiliegende Gewebe mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung. Nachdem die oberste Schicht der Skelettmuskulatur eingefahren hat, sind das Meer und die darunter liegende Muskulatur leicht zu erkennen. Tipp: Beachten Sie die Länge derdie SEA in vivo vor Isolierung zu endothelialen Rohre (die sich entlang ihrer Achse nach der Isolierung zu verkürzen) sich auf ihre ursprüngliche Länge nähern. Mit einer Pinzette und Schere, auszuschneiden sorgfältig die dünne Muskelschicht unter der SEA. Mit abgewinkelten Pinzette, passieren eine Länge von 6-0 Seidenfaden unter der SEA und Ligation der Arterie und den angrenzenden Vene, um es unter Druck und Blut in das Gefäßlumen zurückgehalten, um die Visualisierung während der nachfolgenden Isolierung und Reinigung zu erleichtern halten. Wiederholen Sie den Vorgang SEA-Ligation auf der kontralateralen Seite. Sobald beide SUP wurden ligiert, einen Einschnitt entlang der Mittellinie der Bauchmuskulatur zu den jeweiligen Seiten zu trennen. Erweitern der Einschnitt seitlich in jede Richtung, wie für die Haut durchgeführt, dann weiter der Schnitt vertikal entlang der Außenkante, um die Bauchmuskeln vollständig getrennt von dem Körper. Schäden an Gefäßen von der SEA zugeführt, um den Druck aufrecht zu erhalten Lumen vermeiden. Cut die SEA über der Ligation, um das Siegel zu erhalten, und legen Sie den isolierten Muskel und Arterie in einem 50 ml-Becherglas mit 10 ml 4 ° C Dissektion Puffer. Vorgang für die andere Seite des Bauches und Inkubation der Gewebe in der Präparation Puffer für 10 min. Legen Sie die Bauchmuskulatur, die die SEA in einem gekühlten (4 ° C) Präparation Kammer, die Dissektion Puffer (siehe Abbildung 3B). Die Präparation Kammer aus einer Petrischale mit einer Schicht aus Sylgard (Polydimethylsiloxan [PDMS]) an der Unterseite. Mit Insektenstifte (0,15 mm), strecken die isoliert SEA-und Bauchmuskel aus, um in vivo Längen (siehe oben) annähernd und befestigen Sie sie am Sylgard. Tipp: Orientieren den Muskel, so dass die dünne Schicht mit Blick auf das Bauchfell ist oben macht mit Durchleuchtung der SEA gut sichtbar. Mit Hilfe feiner Mikrodissektion Instrumente und Arbeits von der stromaufwärts Ligationsstelle in Richtung derstromabwärts gelegenen Ende, deaktivieren Sie das Meer von seiner gepaart Vene und dem umgebenden Gewebe, bis der erste große Zweigstelle (1-2 cm). Dann auszuschneiden die SEA, indem es direkt über der Zweigstelle und knapp unterhalb der Ligation. Um Blut in das Gefäßlumen beibehalten entfernen, kanülieren das Meer und spülen Sie es mit eiskaltem Dissektion Puffer. Mit einem Stück Silasticschlauch, befestigen Sie das hintere Ende einer Kanülisier Pipette auf eine 5 ml Spritze mit eiskaltem Puffer Dissektion und sichern die Mikropipette in einem Mikromanipulator zu ihrer Spitze innerhalb der Dissektion Kammer zu positionieren, um die SEA kanülieren. Sobald alle Erythrozyten werden ausgespült, entfernen Sie das Meer von der Kanülierung Pipette, und heben Sie die Pipette aus der Dissektion Gericht. Schneiden Sie die SEA in kleinere Segmente jeweils 1-3 mm in der Länge. Diese kürzere Segmente ermöglichen die Isolierung von Endothelzellen Röhren. 4. Isolierung des Endothelrohr Füllen Sie eine 12 mm x 75 mm Glas KultAbbildung Rohr halb mit eiskaltem Dissektion Puffer. Mit abgewinkelten Pinzette, übertragen Sie die Arterienstücke in die Kulturröhrchen und legen auf Eis. Zu diesem Zeitpunkt verbinden die Verdauungsenzyme mit Dissoziationspuffers auf ein Endvolumen von 1 ml in einem separaten 12 mm x 75 mm Kulturröhrchen (siehe 1.3.2 Solutions) vorzuwärmen und die Lösung auf 37 ° C mit einem Heizblock. Während die Dissoziation Puffer und Enzyme werden aufgewärmt, sorgfältig absaugen Dissektion Puffer aus dem Kulturröhrchen so dass eine kleine Band mit den Gefäßsegmente. Hinzufügen vorsichtig Raumtemperatur Dissoziationspuffer ohne Enzyme abzuwaschen restlichen Dissektion Puffer. Tipp: Fügen Sie die Dissoziation Puffer langsam, so dass die Arterienstücke bleiben auf dem Boden der Kulturrohr um Zeit zu sparen warten, bis sie umzusiedeln. Heben die Puffer Temperaturen über mehrere Schritte von Eis (4 ° C), auf Raumtemperatur (~ 24 ° C), auf 37 ° C bis Schock zu minimieren. Die dissoc vorsichtig absaugenausstrahle Puffer aus dem Kulturröhrchen, wieder sicher zu sein, eine kleine Band mit den Gefäßsegmente zu verlassen. Entfernen Sie die Vorwärmung Dissoziationspuffer mit Enzymen aus dem Heizblock, übertragen Sie die 1 ml Enzymlösung zu dem Kulturröhrchen, das die Gefäßsegmente und legen Sie die Kulturröhrchen wieder in den Thermoblock. Inkubieren bei 37 ° C für 30 min. Während der Inkubation mit Enzymen, bereiten Sie das Verreiben Pipette verfüllen es mit Mineralöl und sichern Sie sie auf einer Mikro, die in einem Mikromanipulator montiert ist. Dann Einfahren der Kolben, um die Mikropipette mit 2 nl der Dissoziation Puffer zu füllen und die Position der Pipettenspitze über die Flusskammer. Am Ende der 30 min Inkubation entfernen Kulturröhrchen aus dem Heizblock und sorgfältig absaugen Puffer wie oben. Mit 4 ml Raumtemperatur Dissoziationspuffers waschen Arteriensegmente. Anmerkung: Es ist nicht mehr notwendig, den Behälter zu halten segmenten am Boden des Kulturröhrchen, Störung der arteriellen Stücke tatsächlich dazu beiträgt, sicherzustellen, daß restliche Enzyme wirksam entfernt werden. Übertragung eines Gefäßsegments zu der Strömungskammer durch vorsichtiges Ansaugen mit einer 1 ml-Mikropipette, und sie in der Durchflusskammer mit 1 ml der Spaltpuffer. Mit Hilfe der Mikromanipulator, der die Mikro, positionieren Sie die Spitze der Pipette in der Nähe von Verreiben ein Ende des Gefäßsegments. Saugen Sie den Gefäßsegment (500 nl zurückgezogen) in das Verreiben Pipette langsam (225 nl / s), um nicht zu mechanischen Belastungen an den ECs verursachen, und werfen Sie sie in die Kammer zurück. Wenn die Verdauung erfolgreich war, werden die Zellen der glatten Muskulatur und Adventitia von der endothelialen Rohr getrennt werden. Wiederholen Sie das Verreiben, bis alle Zellen der glatten Muskulatur dissoziiert. Seien Sie sich bewusst, dass die übermäßige Verreiben (4x oder mehr) können die ECs beschädigen und sie reagieren nicht auf Agonisten. Tipp:Verreiben mit der Pipette, bewegen Sie die Adventitia von der endothelialen Röhre so schnell wie möglich, um es von verwickelten den Schlauch halten. Anmerkung: Mit dem Verreiben Pipette kann das isolierte Endothelzellen Rohr angesaugt und in eine separate Kammer überführt werden. Positionieren Sie den Endothelzellen Rohr in der Mitte des Flusskammer, entlang der Strömungsrichtung ausgerichtet ist, und entfernen Sie das Verreiben Pipette. Sichere Pinning Pipetten Mikromanipulatoren an jedem Ende der Durchflusskammer angeordnet ist, und die Position ihrer Spitze an den jeweiligen Enden der endothelialen Rohr. Absenken eines Pinning Pipette über ein Ende des Rohrs, um es gegen die Unterseite der Kammer zu drücken. Positionieren der zweiten Pinning-Pipette in gleicher Weise an dem gegenüberliegenden Ende des Rohres. Hinweis: Die Platzierung der Pipetten Pinning ist ein Trade-off zwischen dem Befestigungsrohr (indem sie weiter von dem Ende des Rohrs) und sorgt für mehr Imaging / Versuchsfläche (indem sie näher an dem Ende des Rohrs). Auffinden tSaum ~ 50 &mgr; m von jedem Ende des Rohrs funktioniert gut. So wie der Pinning-Pipette das Rohr berührt, langsam zurückzuziehen entlang der Achse des Rohres, wodurch Ausdehnung auf in vivo Länge nähern; drücken Sie dann die Pipette gegen den Kammerboden, um das Rohr zu sichern. Beginnen Sie den Fluss der Superfusionslösung und damit der endothelialen Rohr, für mindestens 20 Minuten ruhen und ins Gleichgewicht zu halten (siehe Abbildung 3C). Nutzen Sie eine peristaltische Pumpe, um konstante Fluidstrom (Superfusion) durch die endotheliale Rohr zu halten. Hinweis: Pinning Pipetten entfernt werden kann, sobald der endothelialen Rohr auf den Boden der Strömungskammer (~ 25 min) verklebt oder an Ort und Stelle gelassen, um sicherzustellen, dass die endotheliale Rohr nicht wegrutschen. 5. Farbstoffbeladung und Calcium Imaging Um intrazellulären Calcium-Antworten zu visualisieren, laden Sie die endotheliale Rohr mit Fluo-04.00 Farbstoff bei Raumtemperatur (~ 24 ° C). Stopp-Fluidströmung in der Wanne, und fügen Fluo-4Uhr mit der Kammer mit einer Endkonzentration von 10 uM. Warten Sie 10 Minuten, damit der Farbstoff in die Zellen eindringen, dann superfuse die endotheliale Rohr mit frischen PSS für 20 Minuten, um sicherzustellen, extrazellulären Farbstoff entfernt wird und dass die intrazelluläre Farbstoff vollständig entes worden. Führen Kalzium-Imaging. Für diese Arbeit eine aufrechte Mikroskop (siehe Fig. 2) mit einer drehenden Scheibe konfokalen Abbildungssystem ausgestattet war, bei Raumtemperatur verwendet. Excite das fluoreszierende Kalzium-Farbstoff mit einem 491-nm-Laser und Bilder zu erwerben (bei 500-550 nm Emission) unter Verwendung einer Digitalkamera intensiviert.