Quantitativo<em> In vitro</em> Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas
Summary
A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite a<em> In vitro</em> Quantificação de neutrófilo humano primário de ligação às células endoteliais activadas por mediadores inflamatórios, sob condições estáticas.
Abstract
O endotélio vascular desempenha um papel fundamental na resposta inflamatória. Durante a fase aguda da inflamação, as células endoteliais (ECs) são activados por mediadores hospedeiras ou directamente por componentes microbianos conservados ou moléculas derivadas do hospedeiro de perigo. Activo CEs citocinas, quimiocinas e express de moléculas de adesão que mobilizam, activar e manter leucócitos no local da lesão ou infecção. Os neutrófilos são os primeiros a chegar leucócitos, e aderem ao endotélio através de uma variedade de moléculas de adesão presentes na superfície de ambas as células. As principais funções dos neutrófilos são para eliminar directamente as ameaças microbianas, promover o recrutamento de outros leucócitos através da liberação de fatores adicionais, e iniciar o reparo de feridas. Portanto, o recrutamento e fixação ao endotélio vascular é um passo crítico na iniciação da resposta inflamatória. Neste relatório, nós descrevemos um ensaio de adesão in vitro de neutrófilos utilizandocalceína AM marcada com neutrófilos humanos primários para quantificar a extensão da activação da célula endotelial microvascular sob condições estáticas. Este método tem a vantagem adicional de que as mesmas amostras quantificada por espectrometria de fluorescência também pode ser visualizada directamente através de microscopia de fluorescência para uma avaliação mais qualitativa da ligação de neutrófilos.
Introduction
Desde o endotélio vascular está em contato direto com o sangue circulante, que tem uma localização única para iniciar uma resposta inflamatória rápida durante a infecção ou lesão. As células endoteliais (ECs) de receptores de reconhecimento de padrões express que reconhecem uma variedade de componentes bacterianos conservadas e as moléculas de perigo, e receptores de mediadores inflamatórios hospedeiras, tais como o TNFa. A activação destes receptores induz a ECs para secretar citocinas (por exemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e para sobrerregular moléculas de adesão (por exemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) na sua superfície celular uma , 2. Estas moléculas de todos facilitar a localização de leucócitos aos locais de infecção e lesão a fim de limpar o exército dos agentes infecciosos e iniciar a reparação tecidual 3,4. A resposta de neutrófilos para a infecção envolve uma interação bem coordenada entre o endotélio vascular ea resposta neutrófilos. Após a ativação CE, IL-8 é segregada e que forma um gradiente intravascular sobre o endotélio, que permite que a casa de neutrófilos para o local da infecção ou lesão 5,6. E / P-selectinas mediata captura de neutrófilos e de rolamento através de associações relativamente fracos com glycomolecules na superfície celular de neutrófilos. Estas interacções, juntamente com a ligação de IL-8 aos seus receptores cognatos, facilitar a robusta ligação integrina-mediada e eventual detenção dos neutrófilos sobre a superfície de células endoteliais 7-10. Depois da prisão, os neutrófilos podem migrar para fora da vasculatura para os locais específicos de infecção para eliminar os patógenos directamente, gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos para prevenir a disseminação de agentes patogénicos, e promover a cicatrização de feridas libertam factores adicionais que recrutam leucócitos, tais como monócitos, macrófagos e dendríticas células 11-17.
Descritos neste relatório é um método in vitro para quantificar a adesão de neutrófilos para microVascular CEs após a ativação por parte do anfitrião mediador inflamatório TNF. Este ensaio foi concebido para avaliar a ativação de células endoteliais, e não neutrófilos. Neutrófilos humanos primários são primeiro isolados utilizando separação em gradiente de densidade, e depois são marcados com calceína acetoximetilo (AM). Esterases de células vivas no interior da hidrólise calceína AM de calceína a molécula altamente fluorescente com uma excitação de 492-495 nm e emissão de 513-516 nm, 18. Os neutrófilos marcados com fluorescência são então incubadas com monocamadas de EC, e os neutrófilos não aderentes são subsequentemente removidos. A fluorescência das restantes, neutrófilos ligados é então medido usando um espectrofotómetro de fluorescência, e calculada como uma percentagem de neutrófilos de entrada fluorescência total por poço. Este método tem a vantagem adicional de que os neutrófilos ligados marcados com calceína utilizados em espectrofotometria pode ser directamente visualizada utilizando microscopia de fluorescência para dar uma leitura mais qualitativa de ac CEvação. Uma vez que este ensaio é realizado em condições estáticas, apenas os eventos muito iniciais que ocorrem na cascata de adesão dos neutrófilos serão avaliados. Isto é confirmado no presente relatório usando anticorpos bloqueadores de E-selectina para mostrar que a adesão de neutrófilos a TNFa humano tratado com pulmão microvascular CE (HMVEC-pulmão) monocamadas é drasticamente reduzida quando a interacção com a E-selectina é interrompido.
Além de TNFa, temos utilizado com sucesso este ensaio para determinar a extensão da activação CE veia umbilical humana (HUVEC) pelo receptor Toll-like 1/2 agonistas lipoproteína associada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) e e Pam3Cys ativação HMVEC-Lung por Pam3Cys 19,20. Além disso, foram utilizados com êxito este ensaio com os inibidores da quinase e depois knockdown RNAi mediada de superfície e proteínas citoplasmáticas em HMVEC-pulmonar, sugerindo que esta metodologia é compatível com uma variedade de bioquímica e screening ensaios 20. Em resumo, este ensaio proporciona um fácil de usar, forma reprodutível, mais funcional para aceder ao grau de activação CE por mediadores inflamatórios in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos para uma bem-sucedida de neutrófilos / ensaio de adesão da célula endotelial microvascular são: 1) O uso do baixo número passagem (<9), células endoteliais saudáveis; 2) Manter os neutrófilos isolados com uma densidade baixa (ou seja, <5 x 10 6 células / ml) e usá-los dentro de duas horas de isolamento, e 3) lavagem Fastidious dos neutrófilos calceína AM-rotulados e uso dos neutrófilos calceína AM-rotulados em tempo hábil para minimizar a contaminação C…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Anestesia e Cuidados perioperatórios UCSF.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
Riferimenti
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
