Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch
Summary
Die angeborene Immunantwort gegen Krankheitserreger schützt Organismen Infektion. Eine kritische Komponente des angeborenen Immunantwort, die Phagozyten Atmungsstoß erzeugt reaktive Sauerstoffspezies, die eindringende Mikroorganismen zu töten. Wir beschreiben einen Assay, der Respiratory Burst reaktiven erzeugt, wenn der angeborenen Immunantwort chemisch induzierte Sauerstoffspezies quantifiziert.
Abstract
Phagozyten Respiratory Burst ist Teil der angeborenen Immunantwort gegen Pathogenbefall und umfasst die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). ROS sind giftig und Funktion phagozytierten Mikroorganismen abzutöten. In vivo Quantifizierung von Phagozyten abgeleitete ROS gibt Auskunft über die Fähigkeit eines Organismus, um eine robuste angeborenen Immunantwort. Hier beschreiben wir ein Protokoll, im ganzen Zebrafischembryonen auf chemische Induktion des Phagozyten Respiratory Burst quantifizieren und vergleichen ROS. Dieses Verfahren ermöglicht die Verwendung eines nicht-fluoreszierende Verbindung, die bei der Oxidation von Fluoreszenz ROS wird. Einzelzebrafischembryos werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert und in diesem fluorogenen Substrat mit oder ohne einen chemischen Induktor des Respiratory Burst inkubiert. Fluoreszenz-in jede Vertiefung wird zu gewünschten Zeitpunkten mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader quantifiziert. Fluoreszenz-Messwerte werden angepasst, um die Hintergrundfluoreszenz zu beseitigen und dann zusammenmpared mit einem ungepaarten t-Test. Dieses Verfahren ermöglicht einen Vergleich der Respiratory Burst Potential des Zebrafischembryos in verschiedenen Entwicklungsstadien und als Reaktion auf experimentelle Manipulationen wie Protein Zuschlagsüberexpression, oder die Behandlung mit pharmakologischen Mitteln. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um den respiratorischen Burst Reaktion vollständig seziert Nieren oder Zellpräparate aus Nieren von erwachsenen Zebrafisch und einige andere Fischarten zu überwachen. Wir glauben, dass die relative Einfachheit und Anpassungsfähigkeit dieses Protokoll wird die bestehenden Protokolle ergänzen und wird von Interesse für Forscher, die die angeborene Immunantwort besser zu verstehen suchen.
Introduction
Angeborenen und erworbenen Immunität: Das Immunsystem besteht aus zwei Zweigen besteht. Die angeborene Immunität ist evolutionär älter als adaptive Immunität. Wirbellose Tiere werden derzeit angenommen, dass nur der angeborenen Immunität haben, während Wirbeltieren sowohl die angeborenen und erworbenen Filialen besitzen. Während adaptiven Immunität verleiht spezifische und dauerhafte Immunität gegen bestimmte Erreger, ist die angeborene Immunität eine unmittelbare Reaktion auf eindringende Bakterien, Viren und Pilze. Ein entscheidender Aspekt der angeborenen Immunantwort beinhaltet die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen, die Entzündung und die Rekrutierung von Phagozyten (zB Makrophagen, Neutrophile) führt zu verschlingen und zerstören fremde Eindringlinge.
Erfolgreiche angeborenen Immunantwort beinhalten: (1) Anerkennung von eindringenden Mikroorganismen, (2) Induktion der entsprechenden Signalkaskaden (zB Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen), (3) die richtige Entwicklung / ausreichende Anzahl von Fresszellen, (4) Migration von Phagozyten auf Seiten der Infektion, (5) Einwirkung von Krankheitserregern, und (6) Zerstörung der Mikroorganismen verschlungen. Ein Mangel an einem dieser Schritte können an den Host durch überwältigt zu führen und zu erliegen, die Infektion. Eine robuste angeborenen Immunantwort entscheidend für die Gesundheit von Lebewesen, weil es die erste Verteidigungslinie gegen Pathogene in allen Pflanzen und Tieren. Bei Wirbeltieren, es potenziert auch die adaptive Immunantwort ein. Daher ist es wichtig, dass wir in der Lage, alle Aspekte der angeborenen Immunreaktion, um besser zu verstehen und um ihre Funktion zu optimieren auszuwerten.
Viele Modellorganismen werden zur angeborenen Immunität zu studieren, von Arabadopsis C. elegans, Drosophila, Mäuse zu kultivierten menschlichen Zellen. Ein Vorteil der Verwendung der Zebrafisch (Danio rerio) Modellsystem zur angeborenen Immunität zu studieren ist, dass der Zebrafisch ist ein Wirbeltier, sowohl mit angeborenen und adaptiven imGemeinschaft, noch die Entwicklung der angeborenen und erworbenen Immunität zeitlich getrennt. Zebrafisch verlassen sich ausschließlich auf die angeborene Immunität für den Schutz vor Infektion, bis die adaptive Immunität wird voll funktionsfähig, die um 4-6 Wochen nach der Befruchtung 2 auftritt. Zusätzlich zu den Werkzeugen zur genetischen Manipulation, optische Klarheit und eine schnelle, externe Entwicklung, angeborene Immunität als Prinzip Modus der Verteidigung in Zebrafischembryonen bietet ein vereinfachtes Modell, in dem die Komplexität der angeborenen Immunantwort in vivo zu untersuchen.
Mehrere Protokolle entwickelt worden, um verschiedene Aspekte der angeborenen Immunantwort in Zebrafischembryos zu beurteilen. Microarrays und RNAseq haben bestätigt, dass die Cytokin-Profile von Zebrafisch angeborene Immunantwort hervorgerufen sind ähnlich wie die von Menschen und haben auch vorgeschlagen, die Beteiligung der Gene, die in unerwarteter angeborenen Immunität 3,4. Die Transparenz des Zebrafisch-Embryos und Leuchtstofflampen, transgenic Stämme von Krankheitserregern und Zebrafisch ermöglichen Visualisierung dynamischer Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo in Echtzeit. Transgene Zebrafischembryonen, die GFP unter der Kontrolle der Neutrophilen-spezifischen Promoter Myeloperoxidase 5,6 oder Makrophagen-spezifischen Promoter mpeg1 7 haben es möglich, zu den Orten der lokalisierten Infektionen 8 visualisieren und quantifizieren Phagozyten Migration sowie Phagozytose und Zerstörung sichtbar gemacht Fluoreszenz-markierten Krankheitserreger 8,9. Zebrafisch-Embryonen sind ebenfalls für die Erzeugung von Hochdurchsatz-Assays und chemischen Bildschirme. Dementsprechend haben Hochdurchsatz-Methoden der Transkriptom-Analyse bei der Infektion 10 und Phagozyten Migration auf Websites von chemisch induzierte Verletzung 11 vor kurzem entwickelt worden.
Von den oben aufgeführten Verfahren keine quantitativ beurteilen die letzte Stufe der Erreger Zerstörung durch Phagozyten. Diese letzte Stufebeinhaltet eine Respiratory Burst (dh Produktion von ROS und andere giftige Verbindungen), die die Krankheitserreger abzutöten verschlungen. Die NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle von ROS in phagozytischen Zellen. Zusammenbau der Untereinheiten der NADPH-Oxidase-Enzym führt Übertragung von Elektronen, Sauerstoff, Erzeugen Superoxidanionen. Durch nachfolgende enzymatische Reaktionen kann dann Superoxid zu Wasserstoffperoxid und hypochlorige Säure (1A) umgewandelt werden. Es ist der Respiratory Burst von Phagozyten, die Krankheitserreger abtötet, und somit ist die Quantifizierung des Respiratory Burst Potential des Zebrafischembryos anzeigt Gesamt angeborenen Immun Gesundheit. Wir entwickelten ein Fluoreszenz-basierten Assays, um den respiratorischen Burst in Gruppen einzelner Zebrafischembryonen 12 zu quantifizieren. Dieser Assay verwendet den nicht-fluoreszierenden, reduzierte Form eines im Handel erhältlichen zellgängigen Farbstoff. Dieser Farbstoff, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein Diacetat (H2DCFDA), ist in die Fluoreszenz umgewandeltCent-Verbindung, 2 ', 7'-Dichlorfluorescein (DCF), die bei der Oxidation. Die vielfältigen ROS durch die Phagozyten Respiratory Burst erzeugte H2DCFDA oxidieren und erzeugen Fluoreszenz 24. Das Aussehen der Fluoreszenz kann verwendet werden, um zu quantifizieren und vergleichen Sie die Atem Burst Reaktion zwischen Gruppen von Zebrafisch werden. Die Proteinkinase-C-Agonist Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) verwendet wird, um chemisch zu induzieren NADPH-Oxidase zu produzieren ROS und erhöhen somit Fluoreszenzmesswerte (Abbildung 1B). Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll einer modifizierten und optimierte Version dieses Zebrafischembryo Respiratory Burst Test. Dieser Test kann verwendet werden, um den Respiratory Burst von Gruppen einzelner Zebrafischembryonen im Laufe der Zeit und / oder in Reaktion auf experimentelle Manipulationen (z. B. Morpholino-vermittelte Protein Knockdown) zu vergleichen. Die Anwendung dieser Methode, in Verbindung mit anderen Zebrafisch-Assays angeborenen Immunität, wird ein vollständigeres Bild der komplexen und kritischen bietenangeborenen Immunantwort.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die primäre Funktion der Fresszellen ist zu erkennen, zu verschlingen und zerstören Krankheitserreger. Die Fähigkeit der Phagozyten, um eine ausreichende Atem Burst zu erzeugen ist kritisch für diese Funktion. Somit ist die Quantifizierung des Respiratory Burst Reaktion ein Verfahren zum Vergleich der allgemeinen Gesundheit und der angeborenen Immunfunktion zwischen Gruppen von Individuen und / oder in Reaktion auf experimentelle Manipulationen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu induzieren, zu quant…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich Vergangenheit und Gegenwart die Mitglieder des Kim Labor, Mark Nilan für Zebrafisch-Pflege und Wartung, Dr. Robert Wheeler für hilfreiche Diskussionen und gemeinsame Nutzung von Daten zu bestätigen, und NIH Zuschüsse 3RO1GM087308-02S1 und 1P20RR024475-01A2 und die Maine Agrar-und Forst Experiment Station (Veröffentlichungsnummer 3303) für die Finanzierung.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
Riferimenti
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .
