Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

El sistema inmune está compuesto por dos ramas: la inmunidad innata y adaptativa. La inmunidad innata es evolutivamente más antigua que la inmunidad adaptativa. Los invertebrados se cree actualmente que sólo tienen inmunidad innata, mientras que los vertebrados poseen tanto las ramas innata y adaptativa. Mientras que la inmunidad adaptativa confiere inmunidad específica y duradera a ciertos agentes patógenos, la inmunidad innata es una respuesta inmediata a las bacterias invasoras, virus y hongos. Un aspecto crucial de la respuesta inmune innata implica la liberación de citocinas y quimiocinas, lo que resulta en la inflamación y el reclutamiento de fagocitos (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos) para engullir y destruir los invasores extraños.

La respuesta inmune innata exitosos involucran: (1) el reconocimiento de microorganismos invasores; (2) la inducción de las cascadas de señalización apropiados (por ejemplo, liberación de citocinas y quimiocinas); (3) de desarrollo adecuado / números adecuados de células fagocíticas; (4) La migración de los fagocitos a sitios de infección; (5) inmersión de patógenos, y (6) la destrucción de microorganismos envueltos. Una deficiencia en cualquiera de estos pasos podría dar lugar al huésped que está siendo abrumado por, y sucumbir a la infección. Una respuesta inmune innata robusta es vital para la salud de los organismos, ya que es la primera línea de defensa contra los patógenos en todas las plantas y animales. En los vertebrados, sino que también potencia la respuesta inmune adaptativa ^1. Por lo tanto, es fundamental que seamos capaces de evaluar todos los aspectos de la respuesta inmune innata, a fin de comprender mejor y optimizar su función.

Muchos organismos modelo se utilizan para estudiar la inmunidad innata, que van desde Arabidopsis a C. elegans a Drosophila a ratones a células humanas cultivadas. Una ventaja de utilizar el pez cebra (Danio rerio) sistema modelo para estudiar la inmunidad innata es que el pez cebra es un vertebrado, con im tanto innata y adaptativadad, sin embargo, el desarrollo de la inmunidad innata y adaptativa están temporalmente separados. El pez cebra se basan únicamente en la inmunidad innata para la protección contra la infección hasta que la inmunidad adaptativa sea plenamente funcional, que produce alrededor de 4-6 semanas después de la fecundación ^2. Además de las herramientas para la manipulación genética, la claridad óptica y rápido desarrollo, externa, la inmunidad innata como el modo de principio de defensa en embriones de pez cebra ofrece un modelo simplificado en el que para estudiar la complejidad de la respuesta inmune innata en vivo.

Múltiples protocolos han sido desarrollados para evaluar las diferentes facetas de la respuesta inmune innata en embriones de pez cebra. Microarrays y RNAseq han validado que los perfiles de citoquinas producidas por la respuesta inmune innata de pez cebra son similares a la de los seres humanos y también han sugerido la implicación de los genes inesperados en la inmunidad innata ^3,4. La transparencia del embrión de pez cebra y fluorescente, transgenic cepas de patógenos y pez cebra permiten la visualización de las interacciones huésped-patógeno dinámicas in vivo en tiempo real. Embriones de pez cebra transgénicos que expresan GFP bajo el control del promotor de la mieloperoxidasa de neutrófilos-específica ^5,6 o el promotor específico de macrófagos MPEG1 ⁷ han hecho posible para visualizar y cuantificar la migración de fagocitos a los sitios de infecciones localizadas ^8, así como para visualizar la fagocitosis y la destrucción de marcado con fluorescencia patógenos ^8,9. Embriones de pez cebra también son susceptibles a la generación de ensayos de alto rendimiento y pantallas químicos. En consecuencia, recientemente se han desarrollado métodos de alto rendimiento de análisis del transcriptoma después de la infección ¹⁰ y fagocitos migración a los sitios de lesión inducida químicamente ^11.

De las técnicas mencionadas anteriormente, ninguno evaluar cuantitativamente la etapa final de la destrucción de patógenos por los fagocitos. Esta etapa finalimplica un estallido respiratorio (es decir, la producción de ROS y otros compuestos tóxicos), que mata a los patógenos envueltos. La enzima NADPH oxidasa es una fuente importante de ROS en células fagocíticas. Asamblea de las subunidades de la NADPH oxidasa resultados de la enzima en la transferencia de electrones al oxígeno, la generación de aniones superóxido. A través de reacciones enzimáticas posteriores, superóxido a continuación, puede ser convertido en peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso (Figura 1A). Es la explosión respiratoria de los fagocitos que mata a los patógenos y, por tanto, la cuantificación de la potencial explosión respiratoria de los embriones de pez cebra es indicativo de la salud inmune innato general. Hemos desarrollado un ensayo basado en la fluorescencia para cuantificar el estallido respiratorio en grupos de embriones de pez cebra individuales ^12. Este ensayo utiliza la no fluorescente, forma reducida de un colorante permeable a las células disponibles comercialmente. Este colorante, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), se convierte en el fluorescentecompuesto ciento, 2 ', 7'-diclorofluoresceína (DCF), tras la oxidación. Los diversos ROS generados por el estallido respiratorio de fagocitos pueden oxidar H2DCFDA y generar fluorescencia ^24. La aparición de la fluorescencia se puede utilizar para cuantificar y comparar la respuesta de estallido respiratorio entre los grupos de pez cebra. El acetato de miristato de forbol agonista de la proteína quinasa C (PMA) se utiliza para inducir químicamente NADPH oxidasa para producir ROS y por lo tanto aumentar lecturas de fluorescencia (Figura 1B). Aquí, ofrecemos un protocolo detallado de una versión modificada y optimizada de este embrión ensayo estallido respiratorio de pez cebra. Este ensayo se puede usar para comparar el estallido respiratorio entre los grupos de embriones de pez cebra individuales en el tiempo y / o en respuesta a las manipulaciones experimentales (por ejemplo, morfolino mediada desmontables de proteínas). El uso de este método, en conjunción con otros ensayos de inmunidad innata de pez cebra, proporcionará una imagen más completa de la compleja y críticarespuesta inmune innata.