Doğal Aselüler Bağırsak Matrix'in üretimi için bir Decellularization Metodoloji
Summary
Makalede, sıçan bağırsaktan bir hücresel olmayan matrisinin üretimi için bir yöntem anlatılmaktadır. Bağırsak iskelelerinin türetme hücre biyolojisi ve uyuşturucu testi kök, doku mühendisliği gelecekteki uygulamalar için önemlidir.
Abstract
Başarılı bir doku mühendisliği in vitro ya da in vivo olarak uygun bir hücre ile iskeleler kombinasyonunu içerir. Iskele, sentetik, doğal olarak türetilmiş ya da doku / organ türetilmiş olabilir. İkincisi decellularization adı verilen bir teknik kullanılarak elde edilir. Decellularization fiziksel, kimyasal ve enzimatik yöntemlerin bir arada içerebilir. Bu tekniğin amacı, orijinal doku makro-ve mikro-mimari muhafaza ederken, her hücresel izlerini ortadan kaldırmaktır.
Bağırsak doku mühendisliği bugüne kadar yerli organın karmaşık mimarisini çoğaltmak değil nispeten basit iskeleleri kullandı. Bu çalışmanın odak noktası sıçan ince bağırsak için etkili bir decellularization tekniği tanımlamaktır. Ince bağırsağın izolasyon vasküler bağlantısının korunmasını sağlayacak şekilde tarif edilmiştir. Whil Hücreleri çıkarmak için kimyasal ve enzimatik çözümleri kombinasyonuiskele luminal açıdan villus-kript ekseni koruyucu st de belirtilmiştir. Son olarak, uygun özelliklere için üretilen iskelelerinin değerlendirilmesi tartışılmıştır.
Introduction
Doku mühendisliği (TE) immünosüpresyon ve organ sıkıntısı konuları atlayarak, organ nakli için bir tedavi alternatifi sunar. TE son zamanlarda bu tür yetişkinler 3,4 ve çocuklarda 5 hem de mesane 1, üretra 2 ve trakea gibi organların değiştirilmesi ile, klinikte başarılı uygulamaları olmuştur.
Bir doku mühendisliği organı Bina uygun hücreler ile bir iskele kombinasyonunu gerektirmektedir. Bir skafold doğal kaynaklı (örneğin, kolajen) kullanılarak hazırlandı ve sentetik (örneğin, poli-L-glikolik asit, PLGA) olabilir maddeler ya da doğal organ ve dokuların decellularization ile elde edilebilir. Intestinal TE için, şimdiye kadar kullanılmış olan iskele esas olarak 6-13 (poli-L-glikolik asit ve poli-laktik asit) decellularized (ince bağırsak mukoza) ya da sentetik ya da olmuştur. Bu biyomalzemeler, makro ve mikro-mimarisi hem de çok basit olandoku mühendisliği bağırsak klinik tercüme edilmesi için ise ideal olmayabilir. Bağırsak için optimal bir biyo materyal ile yardımcı olmak için lumen tarafında konağın kan gitmesi, bağırsak duvarının katmanları yansıtmak için, farklı özelliklere sahip bir katmanlı bir boru şeklinde duvar ve bir villus-kript eksenine bağlanabilir doğuştan gelen bir damar ağacı olmalıdır epitel kök hücreleri tarafından repopulation.
Decellularization kendi özgün mimarisini 14 koruyarak bütün organların hücrelerini kaldırarak iskeleleri üreten bir roman yöntemdir. Bu, organ yapısını taklit değil, aynı zamanda hücre dışı matris (ECM) yardım hücre çoğalması ve farklılaşması içinde gömülü kimyasal ipuçları içeriyor sadece önceden bu yana yapı iskelesi mevcut olan tercih edilir. 2008 yılında kadavra trakea hastanın kendi hücreleri ile seribaşı, 14 decellularized ve genç bir adam sol ana bronşu yerine nakil oldu <sup> 3. O zamandan beri, grup bir dizi küçük ve büyük hayvanlarda kalp 15, 16,17, karaciğer ve akciğer 18-20 için hücresizleştirilmiş iskeleler üretimini bildirmiştir.
Ayrıca küçük bağırsak decellularized iskele 21 üretilmesi için aynı metodoloji adapte edilmiştir. Burada tarif edilen yöntemin amacı bu kan akımı gibi orijinal doku, hem de bağırsak lümeninde villus-kript ekseninin mikroskobik mimarisinin makroskopik özelliklerini korumak decellularized bağırsak matrisleri üretmektir. Biz bu metodoloji sonuçta decellularization verimliliğini artırmak için diğer organlar için kabul edilebilir inanıyorum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu denemeyi kurarken en zor adımlar SMA kanülasyon ve kuruluş ve kısırlık bakımını içerir. Duvar yırtmadan kemirgenlerde SMA kanülü nedeniyle kabın boyutu ve konumu oldukça zor olabilir. Seçenek olarak ise, bir ameliyat dikiş ipliği SMA içine plastik kanül yönlendirilmesi, distal aort kendisinin kanül, ardından önceki SMA orijine proksimal aort etrafına yerleştirilebilir. Decellularization sırasında kötü kanül yerleştirilmesi ve yüksek akış oranları bir arada damar erişimi kaybetmenize neden olabilir. Sterilite, ince bağırsakta mevcut bakteri florasının miktarı nedeniyle önemli bir konudur. Hasat sonrası PBS / AA ile yıkanması çok önemlidir, ve dışkı veya enkaz herhangi bir işaret lumeninden kaldırılması gerekir. Kısırlık elde edilmiş ise UV sterilizasyondan sonra inkübatör içerisinde DMEM ile bir Falcon tüpüne iskeletin bir kısmını yerleştirme göstergesi olmalıdır. Durumdabakteriyel kolonizasyon, medya kendi rengi sarı kırmızı dönüm ile pH değişecek. Bu başa çıkmak için, daha fazla UV çevrimi PBS antibiyotik / antimikotik ajanın yüksek bir konsantrasyon içeren yıkama hem de tavsiye edilir.
Damar ve venöz hem de erişimi olan bir iskele elde etmek için olası bir değişiklik inferior vena kava (IVC) yanı sıra, SMA kanüle olacaktır. Venöz ve damar taraftan Decellularization her üç çözelti için aralıklı olarak denenmelidir. Sürekli decellularization iki tarafta pozitif basınç alarak kılcal damarları patlayabilir.
Yıllar boyunca in vitro ve in vivo 6,9,12 farklı hücre-iskelet kombinasyonları kullanılarak bağırsak TE içinde çabaları bir dizi olmuştur. Işin çoğunluğu kolajen tip I 6,7,13,22 ile kaplanmış boru şeklindeki dokuma olmayan% 95 PGA-PLGA% 5 yapı iskelesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Intestinal ile ardından mibzerepitel organoid birimleri (OU) ve farelerin omentum içine implantasyon dönemi, daha sonra tübülerize edilebilir iç dış ve epiteli üzerinde kas kist oluştururlar. Bununla birlikte, bu iskelelerinin tasarımında gözeneklilik ve basitlik bir biyoreaktör edilen gibi bir in vitro ortamda yapay bağırsak büyük parçalarının üretimi için izin vermez. Buna ek olarak, ayrıca alıcıya bağlı olabilir bir doğal damar ağının eksikliği klinik çeviri için bu iskele kullanımını sınırlar. PGA-PLGA iskeleler olan deneylerde yanı sıra, diğer gruplar bağırsak yolunun karışıklık kopyalamazlar, her ikisi de kollajen veya SIS iskeleleri, kullandık. SIS özellikle intestinal doku mühendisliği sadece daha önce yayınlanmış bir yöntemdir ve mekanik sağlamlık sağlamak ve talebi sırasında hücre büyümesini teşvik etmek için hücresizleştirilmiş iskelelerinin yeteneğini gösteren, 150'den tıbbi ortamlarda kullanılmaktadırhiçbir immünojenik tepki meydana getirmez ing. Ancak, uygun makro-ve mikro-mimarisi eksikliği, bağırsak TE amaçlar 9-11,23 için onun 'kullanımı kötü sonuçlara yol açmıştır.
Tarif ettiğimiz decellularization metodolojisinin faydaları bağırsak kök hücre niş tarafından repopulation uygun bir ortamı temsil gibi lümen crypt-villus mimarisi gibi mikroskobik özelliklerinin korunmasını içerir. Makroskopik açıdan, hiyerarşik bir damar ağının varlığının, TE-bağırsak 21 her katmana besin ve oksijen sağlanmasını sağlayan, alıcıya eki sağlayacaktır. Dahası, örneğin kolajen, elastin ve glyocosaminoglycans gibi ECM bileşenlerin bakım mekanik özellikleri için değil, aynı zamanda, hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını yönlendirilmesi de önemli bir rolü vardır. En önemlisi, decellularization metodolojinin yeteneği geniş içine ölçeklendirilebiliraynı özellikleri muhafaza ederken r dokular TE klinik çeviri için önemli bir özelliktir.
Vasküler ağ ile doğal intestinal matrisin gelişme ana bağlanabilir yapay bağırsak daha bölümlerinin oluşturulmasını sağlar.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi ile yardım için Rejeneratif Tıp Wake Forest Enstitüsü teşekkür ederim. Biz Great Ormond Street Hastanesi sadaka hibe ile destek kabul, Vakıf Eugenio Litta (Cenevre, İsviçre), Tıbbi Araştırma Konseyi, İngiltere için İngiltere Cerrahlar, Sparks Çocuk Tıp Charity, İngiliz Dışişleri Bakanlığı'nın Kraliyet Koleji / ABD Hücre İşbirliği Ödülü ve Mittal Araştırma Fonu Stem. Biz de Çocuk Sağlığı Enstitüsü, Çocuk Cerrahisi Anabilim Dalı için elde doku mühendisliği laboratuvar yenileme hibe için Royal Society / Wolfson Vakfı'na teşekkür etmek istiyorum. PDC ve SE Great Ormond Street Hastanesi Çocuk Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
Riferimenti
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
- Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
- Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
- Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
- Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. Angiogenesis in tissue-engineered small intestine. Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).
- Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
- Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for lung engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).
- Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
- Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
- Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).
