منهج Decellularization لإنتاج وغير خلوي الطبيعية المعوية ماتريكس
Summary
يصف المقال منهجية لإنتاج مصفوفة ديكي من الأمعاء الفئران. اشتقاق السقالات المعوية المهم للتطبيقات المستقبلية في هندسة الأنسجة، بيولوجيا الخلايا الجذعية واختبار المخدرات.
Abstract
هندسة الأنسجة ناجحة ينطوي على مزيج من السقالات المناسبة مع الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي. قد تكون السقالات الاصطناعية، وبطبيعة الحال المستمدة أو المشتقة من الأنسجة / الأعضاء. ويتم الحصول على هذه الأخيرة باستخدام تقنية تسمى decellularization. قد تنطوي على مزيج من Decellularization الفيزيائية والكيميائية، وأساليب الأنزيمية. الهدف من هذه التقنية هو لإزالة كل آثار الخلوية مع الحفاظ على الهندسة المعمارية الدقيقة الكلي والنسيج الأصلي.
هندسة الأنسجة المعوية وقد استخدمت حتى الآن السقالات بسيطة نسبيا والتي لا تكرار بنية معقدة من الجهاز الأصلي. محور هذه الورقة هو لوصف تقنية فعالة لdecellularization الفئران الأمعاء الدقيقة. يوصف العزلة من الأمعاء الدقيقة وذلك لضمان المحافظة على اتصال الأوعية الدموية. مزيج من المحاليل الكيميائية والأنزيمية لإزالة الخلايا حين إلىتم تعيين الحادي الحفاظ على محور زغابة سرداب في الجانب اللمعية من السقالة أيضا. أخيرا، وتناقش تقييم السقالات المنتجة للخصائص المناسبة.
Introduction
هندسة الأنسجة (TE) توفر بديلا العلاجية لزرع الأعضاء، وتجاوز القضايا من نقص المناعة والجهاز. تمت زيارتها مؤخرا TE التطبيقات الناجحة في العيادة، مع استبدال الأجهزة مثل المثانة 1، 2 مجرى البول والقصبة الهوائية، سواء في البالغين والأطفال 3،4 5.
بناء الجهاز الأنسجة المهندسة يتطلب مزيجا من السقالة مع الخلايا المناسبة. يمكن إعداد السقالة باستخدام المشتقة طبيعيا (مثل الكولاجين) والاصطناعية (مثل بولي-L-حمض الجليكوليك؛ PLGA) مواد، أو أن يحصل عليها decellularization الأعضاء والأنسجة الأصلية. وكانت السقالات التي استخدمت حتى الآن لTE المعوية أساسا إما decellularized (تحت مخاطية الأمعاء الصغيرة) أو الاصطناعية (بولي-L-حمض الجليكوليك وحمض اللبنيك بولي) 6-13. هذه الحيوية هي بسيطة جدا في كل من العمارة الكلي والجزئي، والذيقد لا يكون مثاليا إذا الأمعاء الأنسجة المهندسة هو أن تترجم سريريا. ينبغي أن يكون مادة بيولوجية الأمثل لالأمعاء شجرة الأوعية الدموية الفطرية التي يمكن توصيلها إلى إمدادات الدم المضيف، جدار أنبوبي المستويات مع خصائص مختلفة لتعكس طبقات من جدار الأمعاء ومحور زغابة سرداب على الجانب اللمعية للمساعدة في إعادة تعمير بواسطة الخلايا الجذعية الظهارية.
Decellularization هي منهجية الرواية التي تنتج عن طريق إزالة السقالات الخلايا من الأجهزة كلها مع الحفاظ على العمارة الأصلية 14. هذا هو أفضل من السقالات الموجودة بالفعل لأنها لا تكرار، ليس فقط هيكل الجهاز ولكن أيضا تحتوي على منبهات الكيميائية جزءا لا يتجزأ من داخل المصفوفة خارج الخلية (ECM) أن المساعدات انتشار الخلوي والتمايز. في عام 2008 تم decellularized والقصبة الهوائية جثي 14، المصنف مع خلايا المريض نفسه، وزرعها لاستبدال القصبة اليسرى الرئيسي في شاب <sup> 3. منذ ذلك الحين، وأفاد عدد من المجموعات إنتاج السقالات decellularized للقلب 15، 16،17 الكبد، والرئة 18-20 في الحيوانات الصغيرة والكبيرة.
تكيفنا أيضا نفس المنهجية لإنتاج سقالة decellularized الأمعاء الصغيرة 21. الهدف من الطريقة الموصوفة هنا هو إنتاج مصفوفات المعوية decellularized التي تحافظ على الخصائص العيانية من النسيج الأصلي مثل تدفق الدم، فضلا عن الهندسة المعمارية مجهرية من المحور زغابة سرداب في لمعة الأمعاء. نعتقد يمكن اعتماد هذه المنهجية في نهاية المطاف عن الأجهزة الأخرى لتحسين كفاءة decellularization.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر صعوبة في إقامة هذه التجربة تنطوي على القسطرة من SMA وإنشاء وصيانة العقم. يمكن Cannulating المتوسط الحسابي في القوارض دون تمزق الجدار سيكون من الصعب جدا نظرا لحجم وموقع السفينة. بدلا من ذلك، قد يتم وضع خياطة حول الأبهر الداني قبل SMA الأصل، ثم عن طريق القسطرة من الشريان الأورطي نفسه بشكل أقصى، وتوجيه قنية البلاستيك في SMA. خلال decellularization مزيج من سوء وضع قنية ومعدلات تدفق عالية قد يؤدي إلى فقدان الوصول الى الاوعية الدموية. العقم هو مشكلة كبيرة نظرا لكمية من النباتات البكتيرية الموجودة في الأمعاء الدقيقة. غسل مع PBS / AA التالية الحصاد مهم جدا، ويجب إزالة أي علامة على البراز أو الحطام من التجويف. يجب وضع جزء من السقالة في أنبوب الصقر مع DMEM في الحاضنة بعد التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية يكون مؤشرا إذا كان قد تم تحقيق العقم. في حالةالاستعمار الجرثومي، فإن وسائل الإعلام تغيير درجة الحموضة مع لونه تحول من الأحمر إلى الأصفر. للتعامل مع هذا، وينصح كذلك دورات للأشعة فوق البنفسجية وكذلك الغسيل مع برنامج تلفزيوني يحتوي على نسبة عالية من المضادات الحيوية / مضاد فطري.
ومن شأن التعديل الممكن الحصول على السقالة مع وصول كل من الأوعية الدموية الوريدية وتكون ليقني؛ يدخل القنية في الوريد الأجوف السفلي (IVC) فضلا عن SMA. ينبغي محاولة Decellularization من الجانبين وريدي والأوعية الدموية بشكل متقطع لجميع الحلول الثلاثة. decellularization المستمر قد تنفجر الشعيرات الدموية من خلال وجود ضغط إيجابي على كلا الجانبين.
على مر السنين كان هناك عدد من الجهود في الأمعاء TE باستخدام تركيبات مختلفة الخلايا سقالة في المختبر والمجراة 6،9،12. وقد تم تنفيذ معظم أعمال باستخدام أنبوبي محبوكة 95٪ PGA-5٪ السقالات PLGA المغلفة مع نوع الكولاجين أنا 6،7،13،22. بعد غرس البذور مع المعويةوحدات الظهارية عضوي (الأوس) وفترة الزرع في الثرب من الفئران، فإنها تشكل كيسات مع العضلات على الخارج وظهارة في الداخل ومن ثم يمكن tubularized. ومع ذلك، فإن المسامية والبساطة في تصميم هذه السقالات لا يسمح لجيل من القطع الكبيرة من الأمعاء في بيئة اصطناعية في المختبر مثل تلك التي من مفاعل حيوي. بالإضافة إلى ذلك، فإن عدم وجود شبكة الأوعية الدموية الفطرية التي يمكن توصيلها إلى المتلقي مزيد يحد من استخدام هذه السقالة للترجمة السريرية. إلى جانب التجارب مع السقالات PGA-PLGA، استخدمت جماعات أخرى الكولاجين أو SIS السقالات، وكلاهما لا تكرار المعضلة من الأمعاء. SIS على وجه الخصوص هي المنهجية الوحيدة السابقة التي نشرت في هندسة الأنسجة المعوية واستخدمت في أكثر من 150 الإعدادات الطبية، مما يدل على قدرة السقالات decellularized لتوفير الاستقرار الميكانيكية وتشجيع نمو الخلايا في حين الرصاصجي إلى أي استجابة المناعية. ومع ذلك، فإن عدم وجود البنية الكلي والجزئي المناسبة، أدى إلى سوء النتائج في 'استخدام لأغراض المعوية TE 9-11،23.
وتشمل فوائد منهجية decellularization وصفناها الحفاظ على الخصائص المجهرية مثل اللمعية العمارة سرداب-زغابة التي تمثل بيئة مناسبة لإعادة تعمير من قبل الأمعاء المتخصصة الخلايا الجذعية. في الجانب العيانية، فإن وجود شبكة الأوعية الدموية الهرمي تمكين المرفق إلى المستلم، مما يتيح توفير المواد المغذية والأكسجين إلى كل طبقة من الأمعاء TE-21. ما هو أكثر من ذلك، الحفاظ على مكونات ECM مثل الكولاجين، والإيلاستين وglyocosaminoglycans دورا هاما ليس فقط للخصائص الميكانيكية ولكن أيضا توجيه الانتشار الخلوي والتمايز. الأهم من ذلك، من قدرة منهجية decellularization يتم تصعيده إلى كبيرةص الأنسجة مع الحفاظ على نفس الخصائص هو سمة هامة للترجمة السريرية من الشركة المصرية للاتصالات.
تطوير مصفوفة المعوية الطبيعية مع شبكة الأوعية الدموية يتيح إنشاء شرائح أكبر من الأمعاء الاصطناعي التي يمكن توصيلها إلى المضيف.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفان بالشكر إلى معهد ويك فوريست للطب التجديدي لمساعدتهم في تطوير هذا البروتوكول. نحن نعترف الدعم من المنح المقدمة من المؤسسة الخيرية مستشفى جريت أورموند ستريت، ومؤسسة أوجينيو يتا (جنيف، سويسرا)، ومجلس البحوث الطبية، والكلية الملكية للجراحين في انكلترا، والإحسان الطبية سباركس للأطفال، وزارة الخارجية البريطانية في المملكة المتحدة / الولايات المتحدة الأمريكية الخلايا الجذعية جائزة التعاون وصندوق البحوث ميتال. نود أيضا أن نشكر مؤسسة الجمعية الملكية / ولفسون للهندسة الأنسجة منحة تجديد المختبرات التي حصل عليها لجراحة الأطفال قسم في معهد صحة الطفل. معتمدة PDC وSE بنسبة الخيرية جريت أورموند ستريت مستشفى الأطفال.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
Riferimenti
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
- Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
- Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
- Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
- Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. Angiogenesis in tissue-engineered small intestine. Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).
- Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
- Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for lung engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).
- Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
- Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
- Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).
