Создание<em> В пробирке</em> Система по изучению внутриклеточных Поведение<em> Candida glabrata</em> В человека ТНР-1 макрофагов
Summary
В данной статье описываются протокол о создании в пробирке модель культуры клеток системы для изучения взаимодействия факультативного внутриклеточного человека грибкового патогена Candida glabrata с человеческих макрофагах, которые будут полезным инструментом для продвижения наших знаний о грибковых механизмов вирулентности.
Abstract
Модель культуры клеток системы, если близкий имитировать принимающих условий окружающей среды, может служить в качестве недорогого, воспроизводимым и легко можно манипулировать альтернативы животных модельных систем для изучения конкретного шага микробного возбудителя инфекции. Моноцитарный линия клеток человека ТНР-1, которая после лечения эфира форболовым, дифференцируется в макрофаги, ранее был использован для изучения вирулентности стратегии многих внутриклеточных патогенов, включая микобактерий туберкулеза. Здесь мы рассмотрим протокол ввести в действие в пробирке модель культуры в клетки Система, использующая ТНР-1 макрофагов, чтобы очертить взаимодействие оппортунистической человека дрожжей возбудителя Candida glabrata с хост фагоцитов. Эта модель системы является простым, быстрым, поддаются высокой пропускной экранов мутантных, и не требует сложного оборудования. Типичный ТНР-1 макрофагов инфекция эксперимент занимает около 24 час с дополнительным 24-48 часов, чтобы позволить восстановленный внутриклеточныхдрожжей расти на богатой среде для колониеобразующих единиц на основе анализа жизнеспособности. Как и другие в пробирке модельных систем, возможное ограничение этого подхода является трудность при экстраполяции результатов, полученных в очень сложной схемы иммунных клеток, существующих в человеческого организма. Тем не менее, несмотря на это, в настоящее время протокол является очень полезным для выяснения стратегии, которые грибковая возбудитель может использовать, чтобы избежать / противодействовать антимикробной ответ и выжить, приспособиться, и размножаются в бедных питательными веществами среде принимающих иммунных клеток.
Introduction
Виды Candida являются ведущей причиной угрожающих жизни инвазивных грибковых инфекций у пациентов с иммунодефицитом 1. Candida glabrata, возникающие внутрибольничные патоген, является вторым или третьим наиболее часто изолированы видов Candida от пациентов отделения интенсивной терапии в зависимости от географического положения 1-3. Филогенетически С. glabrata, гаплоидны бутонизации дрожжи, более тесно связаны с непатогенными модель дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE чем патогенного Candida SPP. включая C. Albicans 4. В соответствии с этим, C. glabrata не хватает некоторых ключевых грибковых вирулентности черты в том числе спаривания, выделяемый протеолитической активности и морфологической пластичности 4-5.
Хотя С. glabrata не образует гифы, она может выжить и размножаться в мышиных и человеческих макрофагах 6-8 предполагая, что она разработала уникальные механизмы патогенез. Общество с ограниченной информация доступна о стратегиях, что C. glabrata работают, чтобы выжить бедных питательными веществами внутриклеточный макрофагов среды и противодействия окислению и неокислительного ответов хоста, установленные принимающими иммунных клеток 5. Уместно макрофагов модель системы является необходимым условием, чтобы очертить взаимодействие C. glabrata с фагоцитирующих клеток-хозяев с помощью функциональных геномики и протеомики подходов. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и мозга, полученных макрофаги костей (BMDMs) человеческого и мышиного происхождения, соответственно, раньше использовались для изучения взаимодействия C. glabrata с принимающими иммунных клеток 7,9. Тем не менее, трудности в получении МНПК и BMDMs, их ограниченная продолжительность жизни и внутренняя изменчивость между различными донорами млекопитающих ограничить использование этих клеток, как универсальные модели системы.
Здесь мы опишем метод для создания системы в пробирке для изучения intracellulар поведение С. glabrata клетки макрофагов, полученных из клеточной линии моноцитов человека ТНР-1. Общая цель этого протокола было принять простой, недорогой, быстрый и воспроизводимый культуры клеток модельную систему, которая может быть легко манипулировать для изучения различных аспектов принимающей-грибкового патогена взаимодействия.
Клетки ТНР-1 ранее использовались, чтобы расшифровать иммунного ответа против широкого спектра патогенных микроорганизмов, включая бактерии, вирусы и грибки 10-12. Моноцитарные клетки ТНР-1 просты в обслуживании и могут быть дифференцированы, при обработке форбол эфира, с макрофагами, которые имитируют моноцитарных макрофаги людских и выражают соответствующие маркеры макрофагов 13. Основные преимущества ТНР-1 макрофагов модельной системы являются простота в использовании и отсутствие сложных требований оборудования.
Протокол, представленные здесь легко адаптируется для изучения взаимодействия других человека грибковых патогенов с шлюшкат иммунные клетки. Нынешний процедура также может быть использован для идентификации факторов вирулентности для возбудителя интереса, используя высокую пропускную способность экранов мутантные. Это доказательство правильности концепции был примером чего является успешное использование ТНР-1 модели культуры системы выявления набор 56 генов, которые необходимы для выживания С. glabrata в человеческих макрофагах 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Врожденной иммунной системы играет важную роль в контроле патогенных грибковых инфекций. Макрофаги способствовать противогрибковым защиту при приеме внутрь и разрушения грибкового патогена. Таким образом, выяснение факторов, которые необходимы для выживания и / или противодействия …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Инновационная Молодая биотехнолог Award BT/BI/12/040/2005 и BT/PR13289/BRB/10/745/2009 грант от Департамента биотехнологии Правительства Индии и основных фондов Центра по ДНК отпечатков пальцев и диагностики, Хайдарабад. МПР и ГБ являются получателями младший и старший научный стипендий Совета научных и промышленных исследований в направлении достижения степень доктора философии университета Manipal. СО является получателем младший и старший научный стипендий Департамента биотехнологии к погоне за степень доктора философии университета Manipal.
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
Riferimenti
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
