Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

1. Raccolta di embrioni di zebrafish e Raising Larve Vetro pyrex piatti a base di erba "fake" (realizzato in lana verde) (Figura 1) devono essere inseriti i serbatoi all'alba e lasciati in per due ore al fine di raccogliere embrioni di zebrafish. I piatti di vetro contenenti gli embrioni devono essere gettati su un colino palmare e risciacquati con acqua deionizzata. Gli embrioni devono poi essere coltivate in acqua uovo. L'acqua uovo contiene 60 mg / L di Instant Ocean in acqua deionizzata e 0,25 mg / L di blu di metilene, che è utilizzato come un inibitore stampo. A seconda della ipotesi dell'esperimento individuale, gli embrioni possono essere trattati immediatamente o durante specifici stadi di sviluppo utilizzando sostanze tossiche o prodotti farmaceutici. Le sostanze tossiche e farmaceutici sono solitamente disciolti in DMSO (concentrazione 1.000 X) e dovrebbero essere ulteriormente diluiti direttamente nel mezzo acqua uovo. Durante il trattamento embrionale e larvale con farmaci o sostanze tossiches, le larve e gli embrioni possono essere alloggiati in piatti profondi Petri con una densità di circa 50-60 larve per 50 ml fino a quando le analisi comportamentali alle 7 dpf (soluzione di acqua uovo deve essere cambiata almeno ogni due giorni per evitare la crescita di funghi / batteri da embrioni morti). 2. Preparazione Stampi per analisi comportamentali Appositamente sviluppato stampi di plastica, che misurano 11,7 centimetri x 7,6 cm x 5 mm sono stati realizzati su misura in-house. Gli stampi sono necessari per creare corsie utilizzando agarosio che viene versato in piatti di plastica e singoli da Thermo Scientific. L'unico provvedimento ben piastre 12,4 centimetri x 8,1 centimetri x 1,2 cm. Gli stampi contengono cinque corsie in cui i lati sono inclinati a 60 °. Le corsie in stampi sono 3,5 mm di altezza con una base di 18 mm nella parte superiore, che è la più ampia, mentre la larghezza inferiore è 14 mm. C'è un divario 4 mm tra le corsie nello stampo (Figura 2). Per preparare le corsie versare 50 ml di fuso agarosio (0,8% di agarosio in deionizzared acqua con 60 mg / L Instant Ocean) in un unico piatto bene. Lo stampo deve essere messo poi molto lentamente sopra il liquido agarosio per eliminare qualsiasi formazione di bolle e può essere rimosso quando l'agarosio si è raffreddato (che richiede circa 45 min). Le corsie agarosio dovrebbero essere non prima di un giorno prima dell'esperimento comportamentale è da eseguire (per evitare l'agarosio essiccazione) Le corsie possono essere conservati a temperatura ambiente con i coperchi sulle stoviglie fino a circa 36 ore. Le corsie agarosio deve essere utilizzato solo per un esperimento e devono quindi essere eliminati. 3. Acquisizione Immagine Fino a 20 larve può essere collocato in ogni corsia delle piastre. Tipicamente 5 larve per corsia sono utilizzati per facilitare il monitoraggio più accurato della velocità nuotata e di ridurre il numero di larve che sono necessari per esperimento. Le corsie possono essere riempiti con acqua uovo con o senza farmaci o sostanze tossiche a seconda dell'esperimento. Tuttavia, corsie non dovrebbero essere filled su tutto il senso fino a quando essi sono posti in armadi di imaging, questo impedirà di overflow. Per coerenza, le larve dovrebbe avere un periodo di acclimatazione di dieci minuti dopo essi sono posti in stampi agarosio e posizionati sulla parte superiore dello schermo del computer portatile. In modo efficiente lo spostamento delle larve dalla piastra di Petri per l'agarosio corsia contribuirà a ridurre lo stress larve. Questo è più facile quando le larve sono alloggiati in vasche poco profonde o piatti di Petri. Gli armadi di imaging includono una fotocamera digitale Canon usato per fotografia time-lapse e un computer portatile. La telecamera deve essere posizionato nella parte superiore del mobile, in direzione del fondo del mobile in cui un computer portatile 15,6 pollici schermo deve essere posizionato con schermo rivolto verso l'alto (Figura 3). Quattro piastre devono essere posizionate a mano direttamente sulla parte superiore dello schermo del computer portatile. In questo momento le corsie vengano coronata con acqua uovo o trattamento chimico in modo che sia a livello con la parte superiore della corsia (per eliminare le ombre sui bordi della lAnes nelle immagini). Una presentazione PowerPoint è usato come stimolo negativo per le larve. In passato si spostano palle rosse hanno mostrato di larve di zebrafish in 6 o 12 piastre multi-pozzetto 15,17,18. La corrente PowerPoint inizia con uno sfondo bianco bianco per 15 min, seguiti da 15 minuti di una barra rossa movimento sulla metà superiore della piastra (Figura 4). Al fine di eliminare il surriscaldamento delle larve, è meglio per l'acquisto di un computer portatile con una temperatura di schermo che non va oltre i 28 ° C. Per evitare l'evaporazione del liquido all'interno delle corsie di agarosio, il tempo di imaging massimo deve essere mantenuta al di sotto di un'ora. La fotocamera digitale deve essere programmata per fotografia time-lapse, scattare foto ogni 6 secondi per un totale di 300 immagini per esperimento. Tuttavia, la frequenza e la lunghezza può essere regolata a seconda della sperimentazione e quantificazione comportamentale. In tempi di imaging prolungati passati sono stati impiegati con intervalli più lunghi tra ogni immagine. La cameruna può essere impostato ad una risoluzione più bassa per l'imaging a velocità il video (30 fotogrammi al secondo). Mentre la risoluzione inferiore limita le registrazioni per un unico piatto multiwell, le registrazioni video sono appropriate per l'imaging rapido gare di nuoto 15. 4. Image Analysis Le immagini devono essere aperti con ImageJ ed utilizzati con una macro che è stato scritto specificamente in-house. La macro divide automaticamente i canali di colore in modo che il colore rosso può essere rimosso, sottrae il fondo, applica una soglia, e identifica l'larve mediante analisi delle particelle. La macro più attuale per cinque analisi corsia larvale è Zebrafish_macro25k. Utilizzare le istruzioni nella macro per impostare il numero di immagini, di colore da sottrarre, soglia di immagine, ecc Dopo che tutte le immagini è gestita attraverso la macro ImageJ, verrà visualizzato un file di risultati e conterrà le coordinate x, y del larve individuale per ogni immagine con il numero dell'immagine e il numero di corsia. </li> Il file dei risultati deve essere salvato in formato Excel e ordinati in base alla sfondo bianco vs mobile bar sfondo e poi il numero di bene. Un modello di Excel deve essere utilizzato, che ha equazioni costruite in che determina automaticamente il posizionamento di larve nei pozzi, la distanza tra le larve, velocità di movimento, e la quantità di riposo. Il modello di Excel più recente è 25ib creato nel Creton laboratorio, che è disponibile su richiesta. Grafici che mostrano i vari gruppi di trattamento dovrebbero essere integrati nel foglio Excel con t-test per il confronto tra i gruppi di trattamento e di controllo. Ulteriore analisi statistica può essere eseguita utilizzando SPSS.