유전 조작<em> Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한> 균주<em> 톡소 포자충</em

1. 관심의 유전자를 삭제하는 표적 유전자 이 프로토콜은 정의 유전 현장에서 표적 유전자의 삭제가 돌연변이 균주의 효율적인 생성을 위해 설계되었습니다. 앞에서 설명한 T. gondii의 산틴 – 크 산틴-구아닌의 phosphoribosyltransferase (HXGPRT) 선택 마커 mycophenolic 산 및 크 산틴 (MPA + X) 선택 14-16에 따라 안전하고 신뢰할 수있는 마커 삽입이 프로토콜에서 사용됩니다. 이 프로토콜은 효모 재조합 복제 17,18에 따라 DNA 표적 분자를 구성하기위한 검증하고 비용 효율적인 방법을 사용합니다. 몇 가지 다른 프로토콜은 체외 재조합 복제 방법, 또는 융합 PCR에 세균 재조합 복제 방법을 사용하여 재조합 표적 분자를 구성 상업적으로 사용할 수 있습니다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 복제를 복구하는 항의 가장 높은 전반적인 효율성과 신뢰성을 제공합니다T의 Δ ku80 변종 타겟 유전자 삭제를 가진 ITES gondii의. DNA를 대상으로 1.1 준비 ToxoDB 6 (액세스 http://www.toxodb.org을 관심의 유전자 (GOI)에 대한 게놈 서열을 얻기 위해). 참고 : 게놈 시퀀스가 조작되고 변형에 가장 가까운 ToxoDB 데이터베이스 유형 I, II 또는 III 게놈 시퀀스에서 확인하셔야합니다. 예를 들면 : 저기, 대한 RH와 ME49를위한 GT1. 5 '과 3'효모 셔틀 버스로 33 bp의 중복을 통합 관심의 유전자 (GOI)의 게놈 대상 측면을 증폭 설계 특정 오버랩 프라이머 벡터 pRS416 (또는 양자 택일 pRS426)와 선택 마커로 33 bp의 중복을 통합 ( HXGPRT) (그림 1A-B). 5 '의 양쪽 끝에 각 프라이머의 독특한 제한 효소 사이트를 추가33 bp의 중복과 T. 사이에 차 3 '게놈 대상 측면, gondii의 특정 프라이머 시퀀스 (들) (그림 1A-B). 참고 :이 30 bp의 중복보다 큰 효율 효모 재조합 복제가 필요합니다. 5 '과 3'게놈 대상 측면은 800 타겟 삭제를 정의하는 1,400 bp의 사이에 특정 DNA 조각을 증폭하도록 설계되었습니다. 짧은 측면이 크게 Δ ku80 Δ hxgprt 배경 2의 효율성을 대상으로 감소된다는 점에 유의해야합니다. PCR는 5 '프라이머 F1과 R1을 사용하여 대상 측면을, 그리고 PCR은 3 증폭'증폭 게놈 DNA 3의 프라이머 F2와 R2를 (그림 1A-C)을 사용하여 대상 측면입니다. 따로, PCR은 관련 5 '와 3'DHFR이 프라이머 HXF 및 HXR를 사용하여 HXGPRT cDNA를 pminiHXGPRT 카세트 (14)의 측면 지역을 포함하여 1 ~ 2 KBP HXPGRT 유전자를 증폭(그림은 1B-C). 참고 : 형질 전환 할 부모의 변형으로부터 게놈 DNA를 사용하여 대상 측면을 증폭. 주 : 5 '와 3'DNA 등의 혼란 현장에서 HXGPRT의 대상 제거와 같은 후속 효율적인 유전자 조작을 용이하게하는 측면을 대상으로 상대 전진 방향으로 배치 HXGPRT 마커. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 정확한 PCR 제품 크기를 확인하고 아가로 오스 겔 표준을 사용하여 DNA 단편 농도 또는 DNA 농도를 결정하기위한 다른 방법을 추정한다. 로 Gietz 및 Schiestly 17에서 설명 관할 효모의 aliquots를 생성합니다. 5 50 NG '게놈 대상 측면 3 50 NG'게놈 대상 측면, HXGPRT 선택 마커의 100 NG, 10의 최종 볼륨을 달성하기 위해 멸균 H 2 O와 선형 셔틀 벡터의 50 NG를 결합하십시오 -20 μL. 세 PCR 제품과 효모 E.와 관할 효모를 변환 Gietz 및 Schiestly (17)에 의해 기술 된 프로토콜을 사용하여 재조합 복제에 대한 대장균의 셔틀 벡터입니다. 플레이트 우라실 마이너스 최소 배지 한천 플레이트에 효모를 변환하고 2 30 ° C에서 알을 품다 – 6 일. 참고 : 플라스미드, 5 '목표 측면, HXGPRT 마커, 및 3'대상 측면의 주문 어셈블리는 DNA 조각 (그림 1A-B) 사이의 설계 33 bp의 중복에 의해 촉진되고있는 상동 재조합에 의해 중재됩니다 효모. 유라 마이너스 접시에 배 YPAD 2 ㎖를 추가하고 부드럽게 한천을 방해하지 않고 식민지를 꺼 내려 긁어 수확 효모. 5,000 XG에서 5 분 동안 효모 용액을 원심 분리하고 상층 액을 버린다. RNaseA를 포함하는 부유 버퍼 250 μL에 효모 펠렛을 resuspend을 50 추가 – 100 μl를솔루션 CID 씻어 유리 구슬. 효모 세포를 분쇄하는 최고 속도에서 5 분 소용돌이. 유리 구슬은 튜브의 바닥에 정착하고 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 뜨는을 전송 할 수 있습니다. ~ 100 μL의 최종 볼륨 현탁, miniprep의 DNA 분리 키트를 사용하여 효모의 DNA를 분리합니다. DH10B 일렉트로 관할 E. 40 μL 2 μL 효모 DNA (~ 50 NG)를 혼합 대장균 얼음에 보관. 냉장 2mm 간격의 electroporation의 큐벳에 솔루션을 전송하고 2.4 kV의 및 129 Ω에서 박테리아 세포를 electroporate. 각 큐벳과 14 ML 스냅 캡 팔콘 튜브로 전송 용액에 0.8 ML SOC 국물을 추가하여 구조 세포. 60 분 – 40 롤러 드럼에 37 ° C에서 세포를 품어. 판 E. 2XYT + 암피실린 (AMP) 접시에 대장균 및 37 ° C에서 하룻밤 번호판을 품어. ~ 6 선택 – 8 하나의 식민지를하고 37 ℃에서 ~ 16 시간 동안 3 ML 2XYT + AMP 성장 <li> 각 E.의 30 % 글리세롤 냉장고 재고를 준비 대장균의 복제. E.로부터 플라스미드 pΔGOI 분리 대장균 클론 ~ 100 μL의 최종 볼륨 현탁, miniprep 키트를 사용하여. 제한 효소를 사용하여 pΔGOI가 DNA 플라스미드 크기를 측정하고 예상 pΔGOI의 DNA 패턴을 밴딩 확인 다이제스트 확인합니다. DNA는 5 '와 3'의 게놈 시퀀스 데이터를 기반으로 100 % DNA 시퀀스를 확인하는 게놈 대상 측면의 순서로 pΔGOI의 유효성 검사를 완료 http://www.ToxoDB.org을 . 참고 : 완벽에 가까운 순서 상동는 각 염기쌍의 차이 완벽한 동성의 길이에 해당 컷을 구성 이후 효율성 3을 대상으로 유전자를 극대화하기 위해 필수적입니다. 참고 : 저기, 부모의 성을 기준으로 유형 II Δku80 균주의 게놈 서열비는이 시간에 사용할 수 없습니다. 이 작품은 유형 II Δ ku80 변형에 대한 대리 게놈과 유형 II ME49 게놈 시퀀스를 사용합니다. 유전 좌위의 숫자에서 시퀀스 데이터를 기반으로, 그것은 ME49 게놈 저기, 게놈 ~ 1 만 당 뉴클레오티드, 이하의 주파수에서 단일 염기 다형성을 나타내는 것으로 추정된다. 검증 E.에서 글리세롤 주식과 ~ 250 ML 2XYT + AMP 하룻밤 문화를 접종하여 pΔGOI 주식의> 200 μg을 생성 대장균 miniprep 클론. ~ 1000 μL의 최종 볼륨 현탁 maxiprep의 DNA 분리 키트를 사용하여 대형 문화 pΔGOI 플라스미드 DNA를 분리합니다. 이전 형질에 대한 올바른 대상 DNA 분자를 확인 pΔGOI maxiprep DNA 시퀀싱 제한 효소 소화, 또는 DNA를 반복합니다. 독특한 제한 효소 X (는 re.X)​​를 사용하여 5 '끝에 ~ 15 μg의 pΔGOI을 선형화다이제스트 사이트 5 '대상 측면 (그림의 1B)에 내장. 참고 : T. 타겟팅 유전자 gondii의 관심 2 유전자 현장에서 이벤트를 대상으로하는 효율적인 주파수를 얻기 위해 DNA를 타겟팅 ~ 10 μg의 최소 필요합니다. pΔGOI의 선형화를 확인하고 아가로 오스 겔 전기 영동 또는 다른 방법으로 DNA 농도를 결정합니다. 주 : 5에서 제한 효소 소화 '측면이 완료 선형화를 얻을하지 않습니다, 설계 3'경우 고유 RE.Y 다이제스트 사이트가 pΔGOI의 선형화를위한 대안 사이트로 사용할 수 있습니다. 참고 : 완전 선형화 대상으로 DNA 분자는 Δ ku80 균주에서 상동 재조합에 의해 대상으로 성공적인 유전자 필수적이다. incubat에 의해 제한 효소를 중화15 68 ° C에서 ING – 20 분. 살균 H 2 O. 100 μL의 선형화 플라스미드의 적어도 15 μg을 준비 형질 전환의 때까지 -20 ° C에서 보관 선형 pΔGOI. T. 1.2 준비 gondii의 기생충, 형질 전환, 선택, 서브 클로닝, 검증, 보관 및 유전자 조작 종자의 유지 T의 문화와 조작을위한 일반적인 방법 인간의 포피 섬유 아세포 (HFF) 세포 gondii의는 19-21 설명되어 있습니다. Δ ku80 Δ hxgprt의 변종 기생충 감염 매체 (이글 최소 필수 매체 (EMEM) 1 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 항진균 항생제 100X 주식에서 희석으로 보충 성장 매체 1,2)에서 정상적으로 복제합니다. 톡소 포자충 모든 작업은 바이오 안전성 수준이 절차를 사용하여 수행해야합니다. T. gondii의 RHΔ ku80 2 깎다ntal 변형이 로스 연구소 14에서 RHΔ hxgprt 균주로부터 생성되었습니다. PruΔku80 1 부모의 변형이 안정적으로 통합 CAT 선택 마커 bradyzoite 단계 특정 발기인 LDH2의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자를 포함 PruΔhxgprt (저기, gniaud 변형 BSG-4 22)로부터 생성되었습니다. 1 X 10 6 가능한 유형 I RH Δ ku80 Δ hxgprt 기생충에 합류 HFF 세포를 포함하는 25cm 2 플라스크에 접종 또는 2 × 10 6 가능한 유형 II Prugniaud (저기,) Δ ku80 Δ hxgprt 기생충 두 25cm 2 플라스크에 접종. 참고 : 실행 가능한 기생충 갓 밖으로 용해가 세포 외 기생충으로 정의됩니다. 참고 : </strong>이 스케일은 세 가지 형질 전환 실험에 대한 가능한 기생충의 충분한 수를 제공합니다. Δ ku80 Δ hxgprt 감염 문화를 검사 ~ 68-72 시간이 포스트 감염. 형질의 정확한 타이밍을 도모하기 위해 HFF 세포의 95 % 용해 – 가능한 기생충 ~ 90의 존재를 확인합니다. 참고 : 낮은 기생충 생존 유전자 타겟팅 효율성을 폐지하기 때문에 갓 egressed 기생충의 분리는이 프로토콜의 성공을 위해 필수적입니다. 25cm 2 플라스크에 플러그 씰 뚜껑을 닫아 솔루션으로 가능한 기생충을 선동하고 적극적으로 뚜껑의 내부 또는 플라스크의 목에 액체가 튀는없이 성장 표면의 기생충을 선동 앞뒤로 플라스크를 흔들어 . 참고 : 기생충 수확 유형 I 또는 주사기 바늘 방출 프로토콜을 필요로하지 않습니다II Δ ku80 변종을 입력합니다. 3 μm의 멤브레인을 포함하는 필터 홀더에 부착 된 10 ㎖ 주사기에 기생충 솔루션을 전송하고 오픈 15 ML 스크류 캡 튜브의 상단에있는 필터 장치를 놓습니다. 주사기 15 ML 스크류 캡 튜브에 기생충을 필터링합니다. 참고 : 세포막을 통해 기생충을 필터링하여 감염된 세포와 세포 파편을 제거합니다. 혈구를 사용하여 기생충 농도 (ML 당 tachyzoite 형태)를 결정합니다. 참고 : 선택 사항 : 기생충 솔루션을 사용하여 플라크 형성 단위 (PFU) 7 읽 분석 21 설정 – 팔일 이후 형질 전환 기생충의 충분한 가능성 (PFU는 ≥ 0.2의 비율을 tachyzoite하기)를 결정합니다. 7 1,400 XG에 분, 기생충 펠렛을 방해하지 않고 ~ 0.4 ML에 뜨는을 대기음을위한 펠렛 기생충. 1,40에서 2 분 동안 회전0 XG와 대기음은 기생충 펠렛을 방해하지 않고 ~ 0.01 ML에 상층 남아. 튜브의 바닥을 쓸어 기생충 펠렛을 resuspend을 즉시 4 기생충 농도를 얻기 위해 기생충 펠렛 cytomix 23 버퍼 (1.33 배 농도)를 추가 – 5 × 10 7 기생충 / ㎖ cytomix합니다. 참고 : 이러한 추가는 유전자 타겟팅 효율성을 개선하지 않기 때문에 cytomix에 ATP와 글루타티온의 추가를 생략합니다. 프로토콜 1.1 (26 단계)에서 선형 pΔGOI의 100 μL 나누어 지는를 해동. 기생충 cytomix 솔루션 (~ 1.3-1.6 × 10 7 기생충)의 0.3 ML 전송 프로토콜 1.1 (26 단계)에서 선형 pΔGOI의 100 μL로 즉시 냉장 2mm 간격으로 전체 0.4 ML 기생충 + pΔGOI 믹스를 전송 electroporation의 쿠 베트. 1.4 kV의 24 Ω에서 기생충을 Electroporate. 해상도t ~ 5 분 다음 30 ML 감염 매체에 합류 HFF 세포를 포함 150cm 2 플라스크에 형질 큐벳의 전체 내용을 전송하고 하룻밤 감염된 문화를 품어 상온에서 형질 큐벳. mycophenolic 산에 선택하기 + 크 산틴 (MPA + X) ~ 20 시간으로 감염 매체를 대체하여 포스트 형질 (그림 2A) MPA + X 선택 배지 (MPA (25 ㎍ / ㎖) 및 크 산틴 (50 ㎍ / ml)에 감염 매체). 참고 : + X 선택 플라스크 잠복기 MPA를 방해하지 마십시오. 시각적 단층을 조사하여 MPA + X 선택 플라스크 ~ 8 일 포스트 – 형질의 PFUs의 총 수를 추정한다. 가벼운 현미경에 의해 감염 PFUs하고 건강한 지역 개발의 존재를 확인합니다. 주 : 패 하루 8으로 표시되지 않은 경우, 감염의 징후에 대한 선택과 모니터를 유지돌연변이 균주 이후 이온은 감소 복제 속도를 가질 수있다. 참고 : Δ ku80 Δ hxgprt 기생충의 변종이 매우 심한 가진 돌연변이 균주의 성공적인 분리를 허용 원하지 않는 nontargeted 이벤트의 매우 낮은 배경을 가지고 있지만, 치명적인없는 성장하자. 유전자가 필수적이며이를 삭제할 수없는 경우, 기본 형질 또는 이후 기생충 인구 전달, 인구는 대상 녹아웃에 해결로 기생충 선택시 복제를 중단 표현형을 보여줄 수 있습니다. 단층의 세포 기생충을 쫓아하는 3 단계로 플라스크를 흔들어 [보이는 패는 개발 한 후] 기생충 솔루션을 생성 할 수 있습니다. 전송 ~에서 기생충 솔루션의 0.5 ML MPA + 25cm 2 X 선택 플라스크 MPA + 합류 HFF 세포 (이 문화 패스 1A를 지정)를 포함하는 X 선택 플라스크. 기생충시키다의 원래 150cm 2 MPA + X 선택 2 ~ 3 일 후 플라스크 및 전송 ~ 두 번째 25cm 2-0.5 ML 기생충 솔루션 MPA + 합류 HFF 세포 (이 문화 패스 1B를 지정)를 포함하는 X 선택 플라스크. 감염의 영역이 패스 1A 및 / 개발하거나 2 ~ 5 일에 대한 1B 플라스크를 통과 할 수 있습니다. 시각적으로 패스 1A와 1B 플라스크 감염의 건강 영역이 25 가능한 PFUs의 최소 포함하는 광학 현미경으로 확인합니다. 25cm 2 플라스크에 MPA + X 선택 배지에서 계속 통과를 위해 패스 1A 또는 패스 1B 플라스크 중 하나를 선택합니다. MPA + X 선택에 따라 흐름을 유지한다. 참고 : 기생충은 사전에 서브 클로닝에 인구에서 비 통합 지속되고 episomes을 삭제하는 세대 충분한 수의 배양해야합니다. 유형 I RH Δ ku80 Δ hxgprt, 또는 그 이전 이십오일 후 형질에 대한 위하여 사전 이십일 후 형질에 서브 클로닝을 수행하지 마십시오유형 II 저기, Δ ku80 Δ hxgprt 기생충이 통합되지 않은 episomes에게 1,2를 희석 할 수있는 충분한 시간을 허용합니다. MPA + X 선택 배지로 합류 HFF 세포를 포함하는 96 – 웰 트레이에 Subclone 기생충. 1 기생 / 잘 2 기생충 / 잘 농도에서 두 번째 트레이의 농도에 하나의 트레이를 준비합니다. 참고 : 최근 (~ 90 – 25cm 2 플라스크에 HFF 세포의 95 %) 용해가 Subclone 기생충 기생충이 높은 가능성을 가지고 있는지 확인 할 수 있습니다. 참고 : 서브 클로닝을위한 최적의 기간 후 형질 전환이 성공적으로 목표 기생충 선택한 인구의 1에서 높은 주파수에서 발생하는 시간을 측정하여 설립되었다. 통로에 계속 감염 주간 통로 일정을 사용하여 MPA + X 선택 배지에서 형질 전환 기생충의 주요 인구기생충 용액 10 μL와 25cm 2 HFF 플라스크. 참고 : 대상 유전자 삭제 (녹아웃) 휴대 클론 18 단계, resubclone 지속적으로 유지 인구의 기생충의 첫 번째 서브 클로닝에서 얻을하지 않는 경우 ~ 10-12주 후 형질 전환. 참고 : 유전자의 삭제를 획득하지 않는 이유 중 하나는 일부 pΔGOI 플라스미드의 에피 솜 지속성에서 발생합니다. 에피 솜 지속성 5에 포함 된 시퀀스 '와 3'게놈 대상 측면에 의해 결정되며 HXGPRT 유전 적 요소에서 발생하는 나타나지 않습니다. 약 5 – 대상 플라스미드의 10 %가 기생충 인구에게 세대 수 차례 지속되고 episomes을 희석 주로 안정 integrants의 인구를 해결할 수 있도록하는 서브 클로닝의 이후 시간을 필요로 상당한 에피 솜 지속성을 나타냅니다. <ol start = "20"> 점수를 96 – 웰 트레이 6 -에서 광학 현미경에 감염 한 지역으로 식별 한 PFU를 포함하는 우물 팔일 후 서브 클로닝 (유형 II 기생충) – 칠일 후 서브 클로닝 (유형 I 기생충) 또는 7 40X 또는 60X 파워 하나. 우물 PFU의 위치를​​ 지정하는 96 잘 트레이 뚜껑에 작은 점을 표시합니다. 잘 잘 기생충을 분산 PFU 이상 유체의 흐름을 지시하여 50 μL (200 μL 팁)로 설정 피펫을 사용하여 단일 PFU를 포함하는 각의 내용을 섞는다. 참고 : 잘 혼합하면 HFF 단층의 기생충 용해를 가속화합니다. I RH 변종이 잘 용해됩니다 ~ 4 일 혼합 한 후, 타입 II 저기, 기생충은 잘 용해됩니다 2 ~ 5 일 혼합 한 후 입력하십시오. 10 μL 피펫 팁 기생충 솔루션을 동시에 드로잉 최대 6 μL 동안 – 0.5을 사용하여 이러한 용해 우물의 각각의 맨 아래에 우물을 (클론) 용해 다스와 스크래치를 선택합니다. 트랜스1 ML MPA + X 선택 배지에 합류 HFF 세포를 포함하는 24 잘 트레이에서 잘하는 기생충 솔루션의 6 μL FER. 참고 : 개방 우물의 바닥에 존재하는 기생충과 지속적인 접촉 피펫 팁의 구멍 계속 잘 바닥에 흠집을하는 것이 필수적입니다. HFF 세포의 용해를위한 24 잘 트레이를 모니터링 할 수 있습니다. 참고 : I RH 기생충은 일반적으로 1 ~ 4 일 24 잘 형식으로 잘 용해됩니다 입력합니다. 유형 II 저기, 기생충은 일반적으로 2 ~ 5 일에 잘 용해된다. + X 선택 매체 잘 당 합류 HFF 세포와 1 ML MPA를 포함하는 새로운 24 잘 트레이의 해당 well에 24도 형식으로 각 우물의 바닥에서 긁어 가능한 기생충 용액 2 μL를 전송합니다. 참고 : 모든 기생충 클론과 선이 계속 메인이 될 수 있습니다이 24 잘 트레이 형식으로 매 7 일마다 실행 가능한 기생충 용액 2 μL를 전달하여 의한 것. 확인하는 기생충이 성공적으로 시각 광학 현미경 ~ 18 시간이 포스트 흐름과 함께 검사하여 새 24 잘 트레이로 옮겨졌다. 도 1 ML, 10 ML 피펫과 에펜 도르프 튜브에 기생충 솔루션을 전송을 사용하여 24 – 23 단계에서 24 잘 트레이의 용해 우물에서 수확 기생충. 펠릿 7 분, 일단 1 ML 인산에 씻어 1,400 X g에서 기생충은 3 분 동안 1,400 X g에서 다시 식염수 (PBS)와 펠렛을 버퍼. 펠렛의 대기음 PBS 다음, 기생충을 resuspend을 위해 펠릿에 PBS 200 μl를 추가합니다. DNA 분리 될 때까지 -80에서 기생충 솔루션 ° C를 고정합니다. 조직 DNA 분리 minikit를 사용하여 각 클론의 기생충 DNA를 분리합니다. 검증 프라이머 (그림 2A-C)를 사용하여 PCR에 의한 목표 유전자 삭제 (녹아웃) 확인합니다. 에 대한 테스트그 유전자의 기능을 코딩 영역의 부재 상류 CXF와 하류 CXR 게놈 DNA 프라이머를 보여 게놈 대상 측면과 HXGPRT에 걸쳐 PCR 제품의 존재 (그림이 2A-B) 테스트 정확한 5 '및 3 사용 '삭제 된 유전자 현장에 HXGPRT 유전자의 통합을 목표로. 주 : 검증을위한 프라이머를 얻을 수있는 이익이나 거짓 긍정적 인 결과의 유전자 고유해야합니다. 프라이머 디자인에 유효성을 검사 할 수 http://www.toxodb.org 프라이머가 고유 확인 게놈 (들)에 프라이머 시퀀스를 폭파 있습니다. 주간 일정에 통과 기생충 클론은 24 단계의 설명. 대상 삭제가 확인되면, MPA + X에서 계속 선택 사항입니다. 냉동 주식을 준비하여 보관 기생충 클론. 펠렛 세포 기생충25cm 2 배양 플라스크에 용해 HFF 세포에서 기생충 농도에서 세포 배양 냉동 매체에 미디어를 제거하고 부드럽게을 Resuspend 기생충 펠릿> 4 × 10 ㎖ 당 7 기생충.에게 액체 질소에 무기한 cryovials 및 저장 기생충에 분주을 전송하거나, -80 ° C. 2. HXGPRT 삭제 이 프로토콜은 유전자 조작 Δ ku80 균주의 게놈에있는 그것의 통합 사이트에서 HXGPRT 마커를 제거하기 위해 설계되었습니다. HXGPRT 제거 마커 복구 및 HXGPRT 1-3에 따라 만 선택하여 여러 유전자 ​​조작과 변형의 생성을 허용합니다. 아래에 설명 된 프로토콜은 다시 대상으로 현장 HXGPRT를 삭제하는 방법을 설명하지만, 그것은 관심의 유전자 현장에서 HXGPRT의 제거는 야생형 유전자 (C의 재 통합을 동시에 허용하는 주목해야한다omplementation), 유전자 조작의 다양한 수있는 돌연변이 유전자의 재 통합뿐만 아니라, 태그 유전자 (N-또는 C-말단 GFP, HA 태그, 등)의 재 통합. 작업 24의 메커니즘과 6 thioxanthine 선택을 사용하여 프로토콜을 대상으로는 이전에 1-3,15을 설명하고있다. 2.1 삭제 HXGPRT HXGPRT을 (그림 1B) 측면에서는 독특한 제한 효소 사이트에서 잘라 RE.Z으로 소화하여 pΔGOI에서 소비세 HXGPRT 선택 마커. 아가로 오스 겔 전기 영동으로 DNA의 완전한 소화를 확인합니다. 아가로 오스 겔에서 두 개의 밴드의 큰 분리합니다. 참고 : 두 밴드의 큰은 5 '와 3'DNA 목표 측면,하지만 HXGPRT 유전자와 함께 플라스미드를 포함합니다. 스핀 열 누운에 큰 DNA 밴드를 포함하는 아가로 오스 섹션을 배치G 멤브레인 젤 평면. RT에서 5 분 동안 13,000 X g에서 열을 회전. 100 μL의 볼륨을 가지고 흐름을 통해에 멸균 H 2 O를 추가합니다. 참고 : 다른 광고 방법은 아가에서 DNA를 분리 할 수​​ 있습니다. 18 ㎕의 멸균 H 2 O의 최종 볼륨 DNA를 현탁, 에탄올 침전으로 DNA를 집중 7 ML H 2 O, 1 μL 10X 내고 버퍼 1 ㎕의 T4 DNA ligase를 (5 대)를 집중 DNA 1 μL를 혼합하고 4시에 반응을 배치 ° C pΔGOIc (pΔGOIclean) (그림 3A)를 생성 하룻밤. 참고 : RE.Z 포함하는 DNA의 끝 DNA 조각이 아니라 대상으로 돌연변이 유전자의 재 통합 대상 야생형 유전자 (보완)의 재 통합 대상에 적합한 플라스미드를 만들려면이 단계에서 설계 포함 할 수 있습니다 태그 유전자의 재 통합(N-또는 C-말단 GFP, HA 태그 등). 이전의 electroporation에 멸균 H 2 O로 반응 배 희석. E.에 pΔGOIc 변환 프로토콜 1.1으로 대장균, subclone 분리 및 대상 플라스미드를 확인합니다. 다음 (1.1.26 단계 1.1.11 참조) 형질 전환에 대비 pΔGOIc 선형화. 같은 프로토콜 1.2 (단 1-11)에 나와있는 기생충의 transfection 프로토콜을 반복합니다. 참고 : 이전 8 단계를 수행하기 HXGPRT의 대상 제거를 확인하는 돌연변이 균주에 가능합니다. 6 thioxanthine (6TX) 선택 배지 (200 ㎍ / ㎖ 감염 매체 6TX)와 PFU 분석에서 플라스크를 배치를 사용하여 돌연변이 균주 1 X 10 6 tachyzoites에 합류 HFF 세포의 150cm 2 플라스크를 감염. 더 (또는 매우 적은; <10) 있는지 확인 8 일 후 플라스크 검사 설정하는 것이 필수적입니다 PFU는 표시되지 않습니다가, 그 poten재판 유전자 효율성을 타겟팅 감소 HXGPRT 식 (6TX 저항 표현형)과 표현형 변이 균주의 잠재적 자연 복귀를 초과합니다. 주 : 약 5 – HXGPRT 통합 사이트의 10 %가 HXGPRT 마커가 아직 대상 사이트 (설명을 보시려면 대표 결과 섹션 참조)에 통합되어 있더라도 6TX 저항의 의미와 자연 주파수를 나타냅니다. 6TX 선택 배지에 150cm 2 플라스크에 매체를 변경하여 6TX 선택하기 ~ 20 시간의 포스트 형질을 시작합니다. 참고 : ~ 10 일이 후 형질 전환을위한 플라스크를 방해하지 마십시오. 12 포스트 형질 (유형 I 기생충) 또는 일 – 10 – 16 후 형질 (유형 II 기생충) 일 10시 PFU 형성에 플라스크를 검사합니다. 참고 : Parasi에HXGPRT의 삭제 타겟이되고 TES는 HXGPRT 유전자의 mRNA가 삭제 될 때까지 6TX 선택에서 성장을 시작하지 않으며, 잔류 HXGPRT 단백질이 비활성화됩니다. 합류 HFF 세포와 5 ML 6TX 선택 매체를 포함하는 새로운 25cm 2 플라스크에 기생충 솔루션의 1.0 ML – 기생충 솔루션 및 전송 0.5을 만들기 위해 선택 플라스크를 흔들어. 두 가지 이상의 일 동안 하루에 한 번 새 25cm 2 플라스크에 대한 기본 150cm 2의 전송을 반복합니다. 참고 : 다중 샘플링 HXGPRT 유전자를 잃은 가능한 대상 기생충을 캡처의 기회를 증가시킵니다. 건강한 복제 기생충의 영역이 PFUs 개발의 존재를 확인하기 위해 2 플라스크 ~ 5 일, 감염 후 25 센티미터 검사합니다. 감염의 영역을 포함하는 하나 또는 두 개의 플라스크를 선택합니다. 참고 : </strong> 기생충 6TX 선택의 정상적인 성장 속도로 HXGPRT 유전자 복제의 삭제. 6TX 선택 배지에서 통과 기생충을 계속 진행합니다. 선택 30 일 – 25 일 이후 기생충 인구 Subclone. 1 ~ 기생충 / 잘 / 잘 ~ 2 기생충과 다른 한 96 잘 트레이를 설정합니다. 고립 된 클론 기생충 DNA를 준비하고 (단계 19-29) 프로토콜 1.2에 따라 24 잘 포맷 문화의 클론을 유지한다. 그림 3A-B에 설명 된 전략을 사용하여 PCR로 HXGPRT 삭제를 확인합니다. 3. 단백질의 C-말단 태그 이 프로토콜은 MPA를 사용하여 유전자의 게놈 현장에서 상동 재조합을 통해 더블 크로스를 통해 통합을위한 태그를 대상으로 단백질의 C-말단에 태그를 위해 설계 + X 선택 2.4. 이 프로토콜은 효율적으로 작동하기 때문에의 5 'DHFR 순서 <em> HXGPRT 마커는 다른 유전자 2,4에 대한 완전한 검증 기능 3 '비 번역 영역입니다. 내생 유전자 좌위에서 단백질의 3.1 직접 C-말단 태그 만들기 pΔGOItag 대상 플라스미드 효모 재조합 복제 (그림 4)와 프로토콜 1.1에 설명 된 방법을 사용하여 구성. 선택의 태그 (HA 태그, Myc와 태그, 그의 태그에 5 '종료 코돈은 3 위치로 이동 제외 게놈 대상 측면은 GOI의 코딩 영역의 마지막 800 1,200 BP (또는 게놈 DNA)를 포함' 등) (그림 4)에 설명 된 전략을 사용 프로토콜 1.1 및 1.2 단계를 수행하여 단백질 코딩 유전자의 내생 현장에 C-말단 태그의 타겟 삽입을 만듭니다. PCR 전략을 사용하여 내생 유전자 현장에서의 C-말단 태그의 삽입을 확인합니다. D에 프로토콜 1, 프로토콜 2에서 설명한 방법을 사용하여 대상을 변경할 유전자 현장태그 단백질을 표현 정확하게 조절 내생 유전자 현장을 만들 수 HXGPRT 선택 마커를 elete. 이 프로토콜은 태그 변형 (프로토콜 1 참조)에서 다른 궤적을 대상으로 다시 사용할 수 있습니다 HXGPRT 선택 마커를 복구합니다.