التلاعب الجيني في<em> Δku80</em> سلالات لتحليل الجينوم الوظيفي لل<em> التوكسوبلازما جوندياي</em
Summary
نحن هنا التقرير طريقة لاستخدام النوع الأول والنوع الثاني<em> Δku80</em> سلالات<em> التوكسوبلازما جوندياي</em> لتوليد بكفاءة الحذف الجينات المستهدفة وبدائل الجينات لتحليل الجينوم وظيفية.
Abstract
التلاعب الجيني المستهدفة باستخدام إعادة التركيب مثلي هو الأسلوب المفضل لتحليل الجينوم وظيفية للحصول على عرض تفصيلي لوظيفة الجين والنمط الظاهري (ق). تطوير سلالات متحولة مع الحذف المستهدفة الجين، والطفرات المستهدفة، وتكمل وظيفة الجين، و / أو الجينات الموسومة يوفر استراتيجيات قوية لمعالجة وظيفة الجين، لا سيما إذا كانت هذه التلاعب الجيني يمكن أن تستهدف بكفاءة إلى موضع الجينات ذات الاهتمام باستخدام بوساطة التكامل بالنقر المزدوج عبر أكثر من مثلي إعادة التركيب.
وقد يرجع ذلك إلى معدلات عالية جدا من امتماثلان إعادة التركيب، والتحليل الجيني وظيفية من المقوسة الغوندية تقتصر في السابق بسبب عدم وجود وسائل فعالة لاستهداف الجينات الحذف والاستبدال الجيني لمواضع جينية محددة. مؤخرا، ونحن ألغى مسارا رئيسيا من إعادة التركيب امتماثلان في النوع الأول والنوع الثاني من سلالات T. المقوسة عن طريق حذف encodin الجينز 1،2 بروتين KU80. سلالات Δku80 تتصرف بشكل طبيعي خلال tachyzoite (الحادة) والمتباطئة مراحل (المزمنة) في التجارب المختبرية والحية ويحمل في جوهره تردد 100٪ من إعادة التركيب مثلي. سلالات ku80 Δ جعل دراسات الجينية وظيفية مجدية على جين واحد، وكذلك على مقياس الجينوم 1-4.
هنا، ونحن التقرير أساليب لاستخدام النوع الأول والنوع الثاني سلالات Δku80Δhxgprt لتعزيز نهج استهداف الجينات في T. المقوسة. ونحن الخطوط العريضة وسائل فعالة لتوليد الحذف الجينات، واستبدال الجينات، والجينات الموسومة من قبل الإدراج أو الحذف المستهدفة من هيبوزانتين-الزانثين-جوانين ناقلة الفسفوريبوزيل (HXGPRT) علامة اختيار. الجين هو موضح استهداف بروتوكول يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من الطرق في Δku80 سلالات للنهوض تحليل وظيفي للجينوم الطفيل وتطوير سلالات واحدة التي تحملمتعددة تستهدف التلاعب الجيني. إن تطبيق هذه الطريقة الوراثية وفحوصات المظهري لاحقة تكشف عن جوانب أساسية وفريدة من نوعها لبيولوجيا T. المقوسة وما يتصل بها من مسببات الأمراض البشرية الهامة التي تسبب الملاريا (المتصورة س.) وداء خفيات الأبواغ (الكريبتوسبوريديوم).
Introduction
التوكسوبلازما جوندياي هو مشترك تلزم طفيلي داخل الخلايا التي في كثير من الأحيان ويصيب بشكل مزمن مجموعة واسعة من الحيوانات والبشر 5. وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 1 مليار البشر حاليا وبالعدوى بشكل مزمن من قبل هذا الممرض. بالإضافة إلى أهمية الأمراض التي تسببها T. عدوى المقوسة، وزيادة توفر أدوات تجريبية، والموارد الجينوميات قوي 6، وسهولة في النمو المختبر ونماذج الماوس ممتازة جعلت T. المقوسة نظام نموذجا رائدا لدراسة أوسع نطاقا من مسببات الأمراض بين الخلايا حقيقية النواة وغيرها من الطفيليات apicomplexan كبيرة التي تسبب الأمراض المدمرة مثل الملاريا (المتصورة س.) وآريبتوسبوريديوم (الكريبتوسبوريديوم) 5،7. لقد كان وجود قيود كبيرة من المقوسة الغوندية باعتباره النموذج الحي الانتعاش غير الكفء للذرية التي تحمل تستهدف التلاعب الجيني. هذه مشاكلم في استهداف الجين ويرجع ذلك إلى التردد المنخفض من إعادة التركيب مثلي نسبة إلى تردد عال جدا من إعادة التركيب امتماثلان في السلالات البرية من نوع T. المقوسة حتى عندما يتم توفير التماثل DNA واسعة في الجزيئات المستهدفة الحمض النووي المستخدمة في الدراسات الوراثية 2.
ونحن في الآونة الأخيرة منعت وراثيا المسار الرئيسي لإعادة التركيب امتماثلان في النوع الأول والنوع الثاني من سلالات المقوسة التوكسوبلازما عن طريق حذف الجينات التي تشفر بروتين 1،2 KU80. النوع الناتج الأول والنوع الثاني Δ ku80 سلالات تظهر معدلات النمو الطبيعي، وحجم والسلوك على حد سواء في المختبر والمجراة خلال tachyzoite ومراحل المتباطئة في المختبر والمجراة، ومع ذلك، هذه السلالات يحمل أساسا على تردد 100٪ من إعادة التركيب مثلي وهذا النمط الظاهري يزيد من احتمال عزل بسرعة ذرية المطلوب من التلاعب الجيني المستهدفة من قبل عدة مئات إلى عدة ثوusand أضعاف 1،2،4. استخدام الأخيرة على نطاق المجتمع المحلي من النوع الأول والنوع الثاني Δ سلالات ku80 ورفعت بشكل ملحوظ على وتيرة ومتنوعة، فضلا عن نسبة نجاح النهج الوراثية المستهدفة في T. المقوسة 1-4،8-13. نحن هنا وصف بروتوكول شامل للحذف استهداف الجينات، واستبدال الجينات، ووضع علامات الجينات في Δ ku80 سلالات من T. المقوسة. ونحن لشرح كيفية تصميم واستهداف موثوق التلاعب الجيني لجينات معينة أو مواضع الوراثية في Δ ku80 سلالات المقوسة التوكسوبلازما.
Protocol
1. استهداف الجينات إلى حذف الجينات في المصالح ويهدف هذا البروتوكول للجيل كفاءة من سلالة متحولة الذي يحتوي على حذف الجينات المستهدفة في موضع الجينية المحددة. ت التي سبق وصفها يستخدم المقوسة هيبوزانتين-الزانثين-جوانين ناقلة الفسفوريبوزيل (HXGPRT) علامة اختيار في هذا البروتوكول بالنسبة آمنة وموثوق بها الإدراج علامة بعد mycophenolic حامض والزانثين (MPA + X) اختيار 14-16. يستخدم هذا البروتوكول طريقة التحقق من صحة وفعالية من حيث التكلفة لبناء جزيئات الحمض النووي التي تستهدف يعتمد على الخميرة استنساخ تهجيني 17،18. متاحة تجاريا لبناء جزيئات استهداف المؤتلف باستخدام أساليب استنساخ تهجيني البكتيرية، في المختبر طرق الاستنساخ تهجيني، أو الانصهار PCR عدة بروتوكولات بديلة. البروتوكول هو موضح أدناه يوفر أعلى كفاءة وموثوقية يتعافى المستنسخة الفقراتخائبي امتلاك حذف الجينات المستهدفة في Δ ku80 سلالات من T. المقوسة. 1.1 إعداد استهداف الحمض النووي وصول ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) للحصول على تسلسل الجيني لالجينات في المصالح (الحكومة العراقية). ملاحظة: ينبغي الحصول على تسلسل الجينوم من النوع الأول أو الثاني أو الثالث الجينوم تسلسل في قاعدة البيانات ToxoDB التي هي الأقرب إلى سلالة يجري التلاعب بها. على سبيل المثال: GT1 لRH وME49 لPRU. تصميم التداخل محددة الاشعال التي تضخيم 5 'و 3' الجيني الأجنحة استهداف الجينات في المصالح (الحكومة العراقية) دمج 33 BP التداخل مع المكوك الخميرة ناقلات pRS416 (أو بدلا من pRS426) وتشتمل على 33 BP التداخل مع علامة اختيار ( HXGPRT) (أرقام 1A-B). إضافة فريدة من نوعها موقع انزيم التقييد في كل التمهيدي في كلا طرفي 'على 5 أالثانية 3 'الأجنحة استهداف الجيني، وضعت بين 33 التداخل BP وT. تسلسل التمهيدي المقوسة محددة (ق) (أرقام 1A-B). ملاحظة: A أكبر من 30 سنة مضت التداخل مطلوب لكفاءة الخميرة استنساخ إعادة التركيب. 5 'و 3' الأجنحة استهداف الجيني تم تصميمها لتضخيم شظايا الحمض النووي محددة بين 800 و 1،400 شركة بريتيش بتروليوم التي تحدد الحذف المستهدفة. كن على علم بأن الأجنحة أقصر من شأنه أن يقلل استهداف الكفاءة في Δ Δ ku80 hxgprt الخلفية 2. PCR تضخيم 5 'الجهة المستهدفة باستخدام بادئات F1 وR1، وPCR تضخيم 3' الجهة المستهدفة باستخدام التمهيدي F2 وR2 (أرقام 1A-C) من الحمض النووي الجيني 3. بشكل منفصل، PCR تضخيم ~ 2 KBP HXPGRT الجينات بما في ذلك 5 المرتبطة بها 'و 3' DHFR المرافقة مناطق HXGPRT [كدنا] كاسيت pminiHXGPRT 14 باستخدام بادئات HXF وHXR(أرقام 1B-C). ملاحظة: تضخيم الأجنحة الهدف باستخدام الحمض النووي الجيني من سلالة الأبوية إلى أن خلايا. ملاحظة: ضع علامة HXGPRT في التوجه إلى الأمام بالنسبة لل5 'و 3' الحمض النووي استهداف الأجنحة لتسهيل التلاعب الجيني فعالة لاحقة، مثل إزالة المستهدفة من HXGPRT من موضع تعطلت. تحقق من الصحيح أحجام المنتج PCR بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام وتقدير تركيز جزء الحمض النووي باستخدام معايير agarose هلام أو طريقة أخرى لتحديد تركيز الحمض النووي. توليد مأخوذة الخميرة المختصة كما هو موضح في GIETZ وSchiestly 17. الجمع بين 50 نانوغرام من 5 'الجيني الجهة الاستهداف، 50 نانوغرام من 3' الجيني الجهة الاستهداف، 100 نانوغرام من HXGPRT اختيار علامة، و 50 نانوغرام من ناقلات المكوك خطي العقيمة مع H 2 O لتحقيق الحجم النهائي من 10 -20 ميكرولتر. تحويل الخميرة المختصة مع المنتجات PCR ثلاثة والخميرة E. ناقلات المكوك القولونية لاستنساخ تهجيني باستخدام بروتوكول صفها GIETZ وSchiestly 17. لوحة حولت الخميرة على الحد الأدنى من اليوراسيل ناقص لوحات أجار المتوسطة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2 – 3 أيام. ملاحظة: يتم يسرت الجمعية أمر من البلازميد، 5 'الجهة المستهدفة، وعلامة HXGPRT، و3' الجهة المستهدفة من قبل المهندسة 33 BP التداخل بين شظايا الحمض النووي (أرقام 1A-B) ويتم بوساطة إعادة التركيب مثلي في الخميرة. الخميرة الحصاد عن طريق إضافة 2 مل من YPAD 2X إلى لوحات اليوراسيل ناقص وتجريف بلطف لإزاحة المستعمرات دون تعطيل أجار. أجهزة الطرد المركزي في حل الخميرة لمدة 5 دقائق عند 5،000 XG وتجاهل طاف. Resuspend والخميرة بيليه في 250 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق يحتوي RNaseA وإضافة 50-100 ميكرولتر منالخرز الزجاجي إدارة البحث الجنائي التي يجرفها إلى الحل. دوامة لمدة 5 دقائق على أعلى سرعة لسحق خلايا الخميرة. السماح للالخرز الزجاجي لتستقر في قاع الأنبوب ونقل طاف ل2 مل أنبوب إيبندورف. عزل الحمض النووي الخميرة باستخدام الحمض النووي miniprep عدة العزلة، إعادة التعليق في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر ~. خلط 2 ميكرولتر الحمض النووي الخميرة (~ 50 نانوغرام) مع 40 ميكرولتر من DH10B electroporation المختصة E. أبقى القولونية على الجليد. نقل الحل إلى المبردة 2 ملم الفجوة كفيت electroporation وelectroporate الخلايا البكتيرية عند 2.4 كيلو فولت و 129 Ω. الخلايا الانقاذ عن طريق إضافة 0.8 مل SOC المرق إلى كل كفيت والحل نقل إلى 14 مل الأداة الإضافية كاب فالكون أنبوب. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية على الأسطوانة ل40 – 60 دقيقة. لوحة E. القولونية على 2XYT + الأمبيسلين لوحات (AMP)، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل. اختر ~ 6-8 المستعمرات واحد وتنمو في 3 مل 2XYT + AMP ل~ 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. <li> إعداد 30٪ الجلسرين الأسهم الفريزر من كل E. استنساخ القولونية. عزل البلازميد من E. pΔGOI استنساخ القولونية باستخدام عدة miniprep، إعادة التعليق في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر ~. تحقق من صحة pΔGOI باستخدام انزيم تقييد هضم لقياس حجم الحمض النووي البلازميد والتحقق من الحمض النووي pΔGOI المتوقعة النطاقات أنماط. وضع اللمسات الأخيرة المصادقة على pΔGOI بواسطة تسلسل الحمض النووي من 5 'و 3' الأجنحة استهداف الجيني للتحقق من تسلسل الحمض النووي 100٪ على أساس البيانات تسلسل الجينوم في http://www.ToxoDB.org . ملاحظة: قريب من الكمال التماثل تسلسل أمر ضروري لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة استهداف الجينات 3 لأن كل الفرق الزوج يشكل قاعدة قطع المقابلة في طول التماثل الكمال. ملاحظة: تسلسل الجينوم من نوع II Δku80 سلالة استنادا إلى PRU الوالدين القديسالمطر لم يعد متوفرا في الوقت الحالي. يستخدم هذا العمل من النوع الثاني ME49 تسلسل الجينوم كما الجينوم بديل للنوع الثاني Δ ku80 السلالة. استنادا إلى بيانات تسلسل في عدد من مواضع الوراثية، ويقدر أن جينوم ME49 وPRU الجينوم يحمل الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة على تردد ~ 1 في 10،000 النيوكليوتيدات، أو أقل من ذلك. توليد> 200 ميكروغرام من الأسهم pΔGOI، فحقن ~ 250 مل 2XYT + AMP الثقافة بين عشية وضحاها مع الأسهم الجلسرين من التحقق من صحة E. القولونية miniprep استنساخ. عزل pΔGOI DNA البلازميد من ثقافة كبيرة باستخدام الحمض النووي maxiprep عدة العزلة، إعادة التعليق في الحجم النهائي من ~ 1،000 ميكرولتر. كرر انزيم تقييد هضم، أو تسلسل الحمض النووي من pΔGOI maxiprep الحمض النووي للتحقق من الصحيح استهداف جزيء DNA قبل ترنسفكأيشن. خطي ~ 15 ميكروغرام pΔGOI في 5 'نهاية باستخدام تقييد انزيم فريدة X (RE.X)موقع هضم بنيت في 5 'الجهة المستهدفة (أرقام 1B). ملاحظة: استهداف الجينات في T. يتطلب المقوسة ما لا يقل عن 10 ~ ميكروغرام من الحمض النووي استهداف للحصول على تردد كفاءة الاستهداف الأحداث في موضع الجينات في المصالح 2. التحقق من صحة الخطية من pΔGOI وتحديد تركيز الحمض النووي عن طريق الاغاروز الكهربائي للهلام أو طريقة بديلة. ملاحظة: إذا تقييد انزيم الهضم في 5 'الجناح لا تسفر الخطية كاملة، و3 تصميم' يمكن استخدامها كموقع بديل عن الخطية من pΔGOI فريدة من نوعها موقع هضم RE.Y. ملاحظة: A الخطي تماما استهداف جزيء الحمض النووي أمر ضروري لنجاح استهداف الجين إعادة التركيب مثلي في سلالات ku80 Δ. تحييد انزيم التقييد بواسطة incubatجي في 68 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة. تحضير لا يقل عن 15 ميكروغرام من البلازميد الخطي في 100 ميكرولتر من العقيمة H 2 O. مخزن خطي pΔGOI في -20 درجة مئوية حتى وقت ترنسفكأيشن. 1.2 إعداد T. الطفيليات المقوسة، ترنسفكأيشن، واختيار، subcloning، التحقق من صحة والأرشفة وصيانة سلالات التلاعب بها وراثيا الطرق العامة للثقافة والتلاعب T. موصوفة المقوسة في الخلايا الليفية الخلايا القلفة الإنسان (HFF) 19-21. وku80 Δ Δ سلالات hxgprt تكرار عادة في عدوى طفيل المتوسطة (النسور متوسطة الأساسية الدنيا (EMEM) متوسطة النمو تستكمل مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ مضاد فطري للمضادات الحيوية المخفف من الأسهم 100X) 1،2. يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال مع المقوسة الغوندية باستخدام مستوى السلامة الأحيائية 2 الإجراءات. ت. المقوسة RHΔ ku80 2 حلجقد ولدت سلالة ntal من hxgprt سلالة RHΔ من المختبر روس 14. تم إنشاء PruΔku80 1 سلالة الأبوية من PruΔhxgprt (PRU gniaud سلالة BSG-4 22) الذي يحتوي على ثابت متكامل علامة اختيار CAT والبروتين (GFP) مراسل الفلورية الخضراء تحت سيطرة المرحلة المتباطئة محددة LDH2 المروج. تطعيم 25 سم 2 قارورة تحتوي على خلايا HFF متموجة مع 1 × 10 6 نوع قابلة للحياة أنا RH Δ Δ ku80 الطفيليات hxgprt، أو تطعيم اثنين 25 سم 2 قوارير مع 2 × 10 6 قابلة للحياة من النوع الثاني Prugniaud (PRU) Δ Δ ku80 الطفيليات hxgprt. ملاحظة: يتم تعريف الطفيليات قابلة للحياة الطفيليات خارج الخلية التي هي lysed طازجة خارج. ملاحظة: </strong> يوفر هذا المقياس عدد كاف من الطفيليات قادرة على البقاء لمدة ثلاث تجارب ترنسفكأيشن. تفقد الثقافات Δ Δ ku80 hxgprt المصابين ~ 68-72 ساعة بعد العدوى. التحقق من وجود طفيليات قادرة على البقاء و~ 90 – تحلل 95٪ من الخلايا HFF للتخطيط لتوقيت دقيق من ترنسفكأيشن. ملاحظة: عزل الطفيليات egressed طازجة أمر ضروري لنجاح هذا البروتوكول بسبب انخفاض الجدوى الطفيلي سوف تلغي استهداف الجينات ذات الكفاءة. تستنهض الهمم الطفيليات قابلة للحياة إلى حل عن طريق إغلاق غطاء المكونات ختم على 25 سم 2 قارورة ويهز بقوة القارورة ذهابا وإيابا للتحريض على الطفيليات من على سطح النمو دون الرش السائل على الجهة الداخلية من الغطاء أو عنق القارورة . ملاحظة: الحصاد الطفيلي لا يتطلب بروتوكول الإفراج حقنة ذات إبرة لنوع I أوالنوع الثاني Δ ku80 السلالات. نقل الحل الطفيلي إلى حقنة 10 مل تعلق على حامل مرشح تحتوي على غشاء ميكرون (3) ووضع وحدة مرشح على رأس مفتوح 15 مل أنبوب المسمار الحد الأقصى. حقنة تحديد الطفيليات في 15 مل أنبوب المسمار الحد الأقصى. ملاحظة: تصفية الطفيليات من خلال الغشاء يزيل الخلايا المصابة والحطام الخلوية. تحديد تركيز الطفيليات (أشكال tachyzoite لكل مل) باستخدام عدادة الكريات. ملاحظة: اختياري: استخدام الحل الطفيلي، وإنشاء وحدة لوحة التشكيل (PFU) مقايسة 21 التي سيتم قراءة 7 – 8 أيام في وقت لاحق لتحديد الجدوى كافية من الطفيليات transfected (PFU إلى tachyzoite نسبة ≥ 0.2). الطفيليات بيليه لمدة 7 دقائق في الساعة 1400 x ج ونضح طاف إلى ~ 0.4 مل من دون إزعاج الطفيلي بيليه. تدور لمدة 2 دقيقة في 1،400 XG ونضح طاف المتبقية إلى ~ 0.01 مل من دون إزعاج الطفيلي بيليه. Resuspend والطفيليات بيليه بواسطة عبها الجزء السفلي من أنبوب ويضاف فورا cytomix 23 العازلة (1.33x تركيز) للطفيلي بيليه للحصول على تركيز الطفيليات من 4-5 × 10 7 طفيلي / cytomix مل. ملاحظة: تجاهل إضافة ATP والجلوتاثيون لcytomix منذ هذه الإضافات لم تتحسن كفاءة استهداف الجينات. ذوبان الجليد في قسامة ميكرولتر 100 من خطي pΔGOI من بروتوكول 1.1 (الخطوة 26). نقل 0.3 مل من محلول cytomix الطفيلي (~ 1،3-1،6 × 10 7 الطفيليات) إلى 100 ميكرولتر من خطي pΔGOI من بروتوكول 1.1 (الخطوة 26)، ونقل على الفور بأكمله 0.4 مل الطفيلي + pΔGOI المزيج ليبرد ملم الفجوة 2 كفيت electroporation. Electroporate الطفيليات عند 1.4 كيلو فولت و 24 Ω. الدقةر كفيت ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة ل~ 5 دقائق ثم نقل محتويات كفيت ترنسفكأيشن إلى 150 سم 2 قارورة تحتوي على خلايا HFF متموجة مع 30 مل المتوسطة العدوى واحتضان الثقافة المصابة بين عشية وضحاها. تبدأ في اختيار mycophenolic حامض + الزانثين (MPA + X) ~ 20 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الشكل 2A) عن طريق استبدال المتوسطة العدوى مع MPA + X المتوسطة التحديد (MPA (25 ميكروغرام / مل)، والزانثين (50 ميكروغرام / مل) في إصابة متوسطة). ملاحظة: لا تخل MPA تفرخ + X اختيار القارورة. ويقدر العدد الإجمالي للPFUs في MPA + X اختيار قارورة ~ 8 أيام بعد ترنسفكأيشن بتفحص أحادي الطبقة. التحقق من وجود تنمية المناطق PFUs وصحية من العدوى بواسطة المجهر الضوئي. ملاحظة: إذا كان لويحات ليست واضحة بعد يوم 8، والحفاظ على اختيار ومراقبة لدلائل على العدوىأيون منذ سلالات متحولة قد يقل لديهم معدل النسخ المتماثل. ملاحظة: ku80 Δ hxgprt سلالات طفيلي Δ لديهم خلفية منخفضة للغاية من الأحداث nontargeted غير مرغوب فيها، والذي يسمح لعزل الناجح لسلالات متحولة مع شديدة جدا، لكن عيوب نمو لم تكن قاتلة. إذا كان الجين ضروري وأنه لا يمكن حذفها، وترنسفكأيشن الأولية، أو مرت السكان الطفيلي في وقت لاحق، قد تكشف عن وجود النمط الظاهري حيث وقف الطفيليات لتكرار خلال اختيار كما يحل السكان إلى بالضربة القاضية المستهدفة. هز القارورة كما في الخطوة 3 لطرد الطفيليات من خارج الخلية أحادي الطبقة [بعد وقد وضعت لويحات واضحة] لتوليد حل الطفيلي. نقل ~ 0.5 مل من محلول الطفيلي من MPA + X اختيار قارورة إلى 25 سم 2 MPA + X قارورة تحتوي على خلايا HFF اختيار متكدسة (تعين هذه الثقافة تمريرة 1A). طرد الطفيلياتق في الطول 150 MPA الأصلي 2 + X اختيار قارورة في وقت لاحق ~ 3 أيام، ونقل ~ 0.5 مل من محلول الطفيلي للمرة الثانية 25 سم 2 MPA + X قارورة تحتوي على خلايا HFF اختيار متكدسة (تعين هذه الثقافة تمريرة 1B). السماح مناطق العدوى إلى تطوير في تمرير 1A و / أو تمرير قوارير 1B ل~ 5 أيام. تحقق بصريا بواسطة المجهر الضوئي أن 1A تمريرة وقوارير 1B تحتوي على الحد الأدنى من 25 PFUs قابلة للحياة مع المناطق الصحية للعدوى. اختيار إما 1A تمريرة تمريرة أو قارورة 1B لاستمرار مرور في MPA + X المتوسطة التحديد في 25 سم 2 قوارير. الحفاظ على ممر تحت MPA + X التحديد. ملاحظة: يجب أن يكون مثقف الطفيليات لعدد كاف من أجيال لحذف episomes استمرار nonintegrated من السكان قبل subcloning. لا يؤدون subcloning قبل 20 يوما بعد ترنسفكأيشن لنوع RH أنا Δ Δ ku80 hxgprt، أو قبل 25 أيام بعد ترنسفكأيشن للالنوع الثاني PRU Δ Δ ku80 الطفيليات hxgprt لإتاحة الوقت الكافي لتمييع episomes nonintegrated 1،2. الطفيليات Subclone في علبة 96-جيدا تحتوي على خلايا HFF متموجة مع MPA + X اختيار المتوسطة. إعداد علبة واحدة بتركيز من 1 طفيلي / جيد وصينية الثاني بتركيز 2 الطفيليات / جيد. ملاحظة: الطفيليات Subclone التي هي lysed مؤخرا (~ 90 – 95٪ من الخلايا HFF في 25 سم 2 قارورة) لضمان أن تكون لديها قابلية عالية الطفيليات. ملاحظة: تم تأسيس الإطار الزمني الأمثل بعد ترنسفكأيشن لsubcloning من خلال قياس مدى سرعة تنشأ الطفيليات استهدفت بنجاح في ذات تردد عال في السكان مختارة 1. الاستمرار في مرور السكان الأساسية من الطفيليات transfected في MPA + X اختيار المتوسطة باستخدام جدول زمني مرور الأسبوعية من اصابة A 25 سم 2 HFF قارورة مع 10 ميكرولتر من الحل الطفيلي. ملاحظة: إذا لم يتم الحصول على الحيوانات المستنسخة تحمل الحذف الجينات المستهدفة (بالضربة القاضية) من subcloning الأولى في الخطوة 18، resubclone الطفيليات من المحافظة باستمرار السكان ~ 10-12 أسابيع بعد ترنسفكأيشن. ملاحظة: واحد من الأسباب لم يتم الحصول على حذف الجينات ينشأ من استمرار episomal من بعض البلازميدات pΔGOI. يتم تحديد استمرار Episomal بواسطة تسلسل الواردة في 5 'و 3' الجيني الأجنحة استهداف ولا يبدو أن تنشأ من عنصر وراثي HXGPRT. ما يقرب من 5 – 10٪ من البلازميدات استهداف تظهر استمرار episomal الهامة التي يتطلب وقت لاحق من subcloning السماح للسكان الطفيلي عددا كافيا من المرات جيل إلى تمييع episomes استمرار وحل السكان إلى integrants مستقرة في المقام الأول. <ol start = "20"> النتيجة ال 96 جيدا صينية 6-7 أيام بعد subcloning (نوع I الطفيليات) أو 7-8 أيام بعد subcloning (نوع الطفيليات II) للآبار التي تحتوي على PFU واحد، حدد كمنطقة واحدة من عدوى في المجهر الضوئي في إما 40X 60X أو القوة. بمناسبة نقطة صغيرة على غطاء علبة 96 جيدا للدلالة على مكان وجود PFU في البئر. خلط محتويات كل منها يحتوي على بئر PFU واحد باستخدام ماصة الغروب في 50 ميكرولتر (200 غيض ميكرولتر) من خلال توجيه تدفق السوائل خلال PFU لتفريق الطفيليات في البئر. ملاحظة: خلط البئر يسرع تحلل طفيلي أحادي الطبقة من HFF. النوع الأول سلالات RH سوف ليز البئر ~ 4 أيام بعد الاختلاط، والنوع الثاني الطفيليات PRU ليز جيدا ~ 5 أيام بعد الاختلاط. اختر عشرات الآبار هي lysed (استنساخ) والصفر عبر الجزء السفلي من كل من هذه الآبار هي lysed باستخدام ،5-10 ميكرولتر طرف ماصة بينما في وقت واحد رسم المتابعة 6 ميكرولتر من الحل الطفيلي. ترانسفر من ميكرولتر من محلول 6 الطفيلي إلى بئر في صينية 24 أيضا تحتوي على خلايا HFF متكدسة في 1 مل MPA + X اختيار المتوسطة. ملاحظة: من الضروري أن تخدش قاع البئر للحفاظ على افتتاح تحملت من طرف ماصة على اتصال دائم مع الطفيليات يقيمون في قاع البئر. رصد صينية 24 جيدا لتحلل الخلايا HFF. ملاحظة: النوع الأول الطفيليات RH سوف ليز عادة بشكل جيد في تنسيق 24 بشكل جيد في ~ 4 أيام. والنوع الثاني الطفيليات PRU ليز عادة بشكل جيد في ~ 5 أيام. نقل 2 ميكرولتر من حل قابل للحياة طفيلي خدش من الجزء السفلي من كل بئر في تنسيق 24 أيضا إلى البئر المقابلة من علبة 24 بئر جديدة تحتوي على خلايا HFF متكدسة و1 مل MPA + X اختيار المتوسطة لكل بئر. ملاحظة: يمكن لجميع طفيليات الحيوانات المستنسخة وخطوط يكون الهدف الرئيسي مستمريعتقلون وذلك بتمرير 2 ميكرولتر من حل قابل للحياة طفيلي كل 7 أيام في هذا الشكل صينية 24 أيضا. تحقق من أن الطفيليات تم نقل بنجاح إلى علبة-24 بئر جديدة عن طريق التفتيش بصريا مع المجهر الضوئي ~ 18 ساعة بعد مرور. الطفيليات الحصاد من الآبار هي lysed من الدرج 24 أيضا من الخطوة 23-24 باستخدام إما 1 مل أو 10 مل ماصة ونقل الحل الطفيلي إلى أنبوب إيبندورف. بيليه الطفيليات في 1،400 ز س لمدة 7 دقائق، وشطف مرة واحدة في 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وبيليه مرة أخرى في 1،400 ز س لمدة 3 دقائق. نضح PBS من بيليه، ثم إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لبيليه إلى resuspend والطفيليات. تجميد الحل الطفيلي في -80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي. عزل الحمض النووي الطفيلي من كل استنساخ باستخدام الأنسجة DNA العزلة minikit. تحقق من صحة الحذف الجينات المستهدفة (خروج المغلوب) التي PCR باستخدام بادئات التحقق من الصحة (أرقام 2A-C). اختبار للغياب الترميز المنطقة وظيفية من الجينات في المصالح واستخدام CXF المنبع والمصب CXR الاشعال الحمض النووي الجيني (أرقام 2A-B) اختبار لوجود منتجات PCR التي تمتد على الأجنحة استهداف الجيني وHXGPRT لإثبات الصحيح 5 'و 3 'استهدفت دمج الجين HXGPRT في موضع الجين حذفها. ملاحظة: يجب الاشعال للمصادقة تكون فريدة من نوعها لهذا الجين من فائدة أو نتيجة إيجابية كاذبة يمكن الحصول عليها. التصميم التمهيدي يمكن التحقق من صحة على http://www.toxodb.org بواسطة التفجير تسلسل التمهيدي إلى الجينوم (ق) للتحقق الاشعال هي فريدة من نوعها. استنساخ طفيلي مرور على جدول زمني أسبوعي كما هو موضح في الخطوة 24. مرة واحدة وقد تم التحقق من صحة الحذف المستهدفة، والاستمرار في اختيار MPA + X هو اختياري. الأرشيف الطفيلي الحيوانات المستنسخة من خلال إعداد مخزونات الفريزر. بيليه طفيليات خارج الخليةمن الخلايا HFF هي lysed في 25 سم 2 قارورة الثقافة، وإزالة وسائل الاعلام وبلطف resuspend الطفيلي بيليه في خلية ثقافة تجميد المتوسطة في تركيز الطفيليات> 4 × 10 7 الطفيليات لكل مل. نقل مأخوذة إلى cryovials والطفيليات مخزن لأجل غير مسمى في النيتروجين السائل، أو في -80 درجة مئوية. 2. حذف HXGPRT ويهدف هذا البروتوكول لإزالة علامة HXGPRT من موقع اندماجها في الجينوم من التلاعب وراثيا Δ ku80 السلالة. إزالة HXGPRT يسمح للانتعاش علامة وتوليد سلالات مع التلاعب الجيني متعددة باستخدام التحديدات فقط على أساس HXGPRT 1-3. في حين أن البروتوكول المفصلة أدناه توضح طريقة لإعادة استهداف موضع حذف HXGPRT، تجدر الإشارة إلى أن إزالة HXGPRT في موضع الجينات في المصالح كما تسمح في وقت واحد إعادة دمج الجين البرية من نوع (جomplementation)، وإعادة إدماج الجين الطافر، فضلا عن إعادة دمج الجين الموسومة (N-أو C-محطة GFP، HA العلامة، الخ)، مما يسمح لمجموعة متنوعة من التلاعب الجيني. آليات العمل 24 واستهداف البروتوكولات باستخدام التحديدات 6 thioxanthine وقد وصفت سابقا 1-3،15. 2.1 حذف HXGPRT المكوس علامة اختيار HXGPRT من pΔGOI من قبل هضم مع RE.Z إلى خفض في مواقع انزيم التقييد فريد المرافقة HXGPRT (1B الشكل). تحقق الهضم كاملة من الحمض النووي عن طريق الاغاروز الكهربائي للهلام. عزل أكبر من العصابات اثنين من الجل الاغاروز. ملاحظة: أكبر من العصابات اثنين يحتوي على البلازميد جنبا إلى جنب مع 5 'و 3' الأجنحة الهدف الحمض النووي، ولكن ليس هذا الجين HXGPRT. وضع قسم الاغاروز التي تحتوي على الحمض النووي الفرقة أكبر في عمود layin تدورز الشقة الجل على الغشاء. تدور العمود في 13،000 ز س لمدة 4 دقائق على RT. إضافة العقيمة H 2 O إلى التدفق من خلال لتبرزي حجم إلى 100 ميكرولتر. ملاحظة: وسائل التجارية الأخرى المتوفرة لعزل الحمض النووي من الاغاروز. تركيز الحمض النووي عن طريق ETOH هطول، إعادة التعليق على الحمض النووي في الحجم النهائي من 18 ميكرولتر العقيمة H 2 O. مزيج 1 ميكرولتر من الحمض النووي مركزة مع 7 مل H 2 O، 1 ميكرولتر العازلة ربط 10X و 1 ميكرولتر يغاز DNA T4 (5 وحدات) ووضع رد الفعل في 4 درجات مئوية خلال الليل لتوليد pΔGOIc (pΔGOIclean) (الشكل 3A). ملاحظة: شظايا الحمض النووي مع RE.Z إنتهاء تحتوي على الحمض النووي يمكن أن تصمم وشملت في هذه الخطوة لإنشاء البلازميدات مناسبة لالمستهدفة إعادة دمج الجين البرية من نوع (تكامل)، استهدفت إعادة إدماج الجين الطافر وكذلك استهدفت إعادة إدماج الجينات الموسومة(N-أو C-محطة GFP، HA العلامة، الخ). تمييع 2X رد فعل العقيمة مع H 2 O قبل electroporation. تحويل pΔGOIc إلى E. القولونية كما هو الحال في بروتوكول 1.1 إلى subclone، عزل، والتحقق من صحة استهداف البلازميد. ثم يصبح خطي pΔGOIc استعدادا لترنسفكأيشن (انظر الخطوات 1.1.11 إلى 1.1.26). كرر بروتوكول ترنسفكأيشن الطفيلي على النحو المبين في بروتوكول 1.2 (الخطوات من 1 إلى 11). ملاحظة: قبل إجراء الخطوات 1-8، تحقق من أن إزالة المستهدفة من HXGPRT يكون مجديا في سلالة متحولة. تصيب 150 سم 2 قارورة من الخلايا HFF متموجة مع 1 × 10 6 tachyzoites من سلالة متحولة باستخدام 6 thioxanthine (6TX) متوسطة التحديد (200 ميكروغرام / 6TX في المتوسط عدوى مل)، ووضع القارورة في فحص PFU. فحص القارورة بعد 8 أيام للتحقق من عدم وجود (أو عدد قليل جدا، <10) PFU مرئية، وهو أمر ضروري لإثبات أن الهياجوسوف تستهدف الجين TIAL كفاءة تتجاوز أي الارتداد العفوي المحتملة من سلالة متحولة إلى النمط الظاهري مع انخفاض التعبير HXGPRT (مقاومة 6TX النمط الظاهري). ملاحظة: حوالي 5-10٪ من مواقع التكامل HXGPRT يحمل تردد كبير وعفوية المقاومة 6TX على الرغم من أن علامة HXGPRT لا تزال متكاملة في الموقع المستهدف (انظر القسم ممثل النتائج لشرح). بدء اختيار 6TX ~ 20 ساعة بعد ترنسفكأيشن عن طريق تغيير المتوسطة في سم 2 قارورة 150 إلى 6TX اختيار المتوسطة. ملاحظة: لا تزعج القارورة ل~ 10 أيام بعد ترنسفكأيشن. فحص القارورة لتشكيل PFU في يوم 10-12 بعد ترنسفكأيشن (نوع I الطفيليات) أو يوم 10-16 بعد ترنسفكأيشن (نوع الطفيليات الثاني). ملاحظة: Parasi فيسوف TES استهدافهم لحذف HXGPRT لا تبدأ في النمو تحت اختيار 6TX حتى يتم حذف هذا الجين HXGPRT ومرنا، والمعطل البروتين HXGPRT المتبقية. هز قارورة اختيار لإيجاد حل الطفيلي، ونقل 0،5-1،0 مل من محلول الطفيلي إلى الجديد 25 سم 2 قارورة تحتوي على خلايا HFF متكدسة و5 مل 6TX المتوسطة الاختيار. تكرار نقل من المرحلة الابتدائية و150 سم 2 إلى 25 سم 2 جديدة قوارير مرة واحدة في اليوم لمدة يومين آخرين. ملاحظة: يزيد أخذ العينات متعددة من فرص التقاط الطفيليات المستهدفة قابلة للحياة التي فقدت الجين HXGPRT. تفقد 25 سم 2 قوارير ~ 5 أيام بعد العدوى إلى التحقق من وجود النامية PFUs مع مناطق الطفيليات تكرار صحية. اختيار واحد أو اثنين من قوارير تحتوي على مناطق للعدوى. ملاحظة: </sترونج> الطفيليات حذف من تكرار الجين HXGPRT بمعدل النمو الطبيعي في اختيار 6TX. يواصل مرور الطفيليات في 6TX المتوسطة الاختيار. Subclone السكان الطفيليات بعد 25 – 30 يوما من الاختيار. اقامة واحدة صينية 96 جيدا مع ~ 1 طفيلي / جيد وآخر مع ~ 2 الطفيليات / جيد. إعداد الحمض النووي الطفيلي من الحيوانات المستنسخة المعزولة والحفاظ على الحيوانات المستنسخة في ثقافة الشكل 24 أيضا وفقا لبروتوكول 1.2 (الخطوات 19-29). تحقق من صحة الحذف من HXGPRT بواسطة PCR باستخدام استراتيجية المبينة في أرقام 3A-B. 3. توصيف C-محطة من البروتينات ويهدف هذا البروتوكول لمحطة سي علامات من البروتينات من خلال استهداف شعارا لتكامل عبر الصليب الضعف خلال إعادة التركيب مثلي في مكان الجريمة الجيني للجين باستخدام MPA + X التشكيلة 2،4. هذا البروتوكول يعمل بكفاءة وذلك لأن 5 'تسلسل DHFR لل <eم> HXGPRT علامة هو وظيفي المنطقة غير مترجمة التحقق من صحتها بالكامل 3 'للجينات أخرى 2،4. 3.1 المباشرة علامات C-محطة من البروتينات في مواضع الوراثية الذاتية إنشاء استهداف pΔGOItag البلازميد بناء باستخدام الخميرة استنساخ تهجيني (الشكل 4) والطرق الموضحة في بروتوكول 1.1. 5 'الجيني الجهة استهداف يحتوي على 800 إلى 1،200 مشاركة BP من المنطقة الترميز (أو الحمض النووي الجيني) من الحكومة العراقية، باستثناء يتم نقل رامزة إنهاء لموقف 3' إلى العلامة من خيار (HA العلامة، والعلامة MYC، والعلامة صاحب ، الخ.) إنشاء الإدراج المستهدفة من العلامة C-محطة في موضع الذاتية من البروتين الترميز الجينات باتباع الخطوات في بروتوكول 1.1 و 1.2 باستخدام استراتيجية المذكورة (الشكل 4). تحقق من الإدراج من العلامة C-محطة في موضع الجين الذاتية باستخدام استراتيجية PCR. إعادة التوجيه موضع الجينات باستخدام الأساليب المذكورة في البروتوكول 1 و 2 إلى بروتوكول دذف علامة اختيار HXGPRT لإنشاء الذاتية موضع الجين ينظم على وجه التحديد التي تعبر عن بروتين الموسومة. أيضا يسترد هذا البروتوكول علامة اختيار HXGPRT التي يمكن استخدامها مرة أخرى لاستهداف موضع آخر في سلالة الموسومة (انظر البروتوكول 1).
Representative Results
ويرد قالب مفصلة لبناء البلازميد استهداف لحذف الجينات، بما في ذلك وضع مواقع انزيم التقييد وتوليد الاشعال التي تسهل استهداف الوراثية والتحقق من استهداف الجينات، وكذلك بناء البلازميد لحذف لاحقة من HXGPRT في عملية من خطوة واحدة (أرقام 1A-C، الشكل 2A، الشكل 3A). ويرد التخطيطي العام لجعل حذف الجينات المستهدفة (الشكل 2A)، وأزواج التمهيدي تستخدم للتحقق من صحة الحذف من خروج المغلوب، على سبيل المثال، يتم عرض نوع I rop18 (الشكل 2B)، ونتائج ممثلة من التحقق من صحة PCR (الشكل 2C). ويظهر هذا نتيجة ممثل لتوضيح مجموعة من النتائج التي يمكن الحصول عليها في مواضع الوراثية التي يصعب نسبيا إلى الهدف. وهناك حذف الجينات المستهدفة بنجاح يؤدي إلى عدم وجود الجين من فيterest المنتج PCR (PCR 1)، وجود 3 'الجيني الجهة استهداف (PCR2)، وجود علامة اختيار HXGPRT متكاملة بشكل صحيح بين 5' و 3 'الأجنحة استهداف الجيني التي تحدد الحذف (PCR3 وPCR4) . استنساخ 3، 4، 5، 6، 8، 9، و 11 يتم التحقق من صحة الحذف الجينات المستهدفة (بالضربة القاضية) حيث حلت محل HXGPRT الحكومة العراقية (الشكل 2C). نسخة قابلة للأن لا يحتوي على حذف الجينات يمكن أن تكون ممثلة من قبل مجموعة متنوعة من أنماط النطاقات. عادة، سوف استنساخ دون حذف الجينات تعكس سلالة الأبوية (نمط الوالدين) مع العصابات التي لوحظت PCR1 وPCR2، ولكن ليس لPCR3 أو PCR4 كما رأينا لاستنساخ 1 و 2 (الشكل 2C). هذا "نمط الأبوية" تنشأ من عدد قليل من الآليات المحتملة. أحيانا، MPA الطفيليات اختيارها مقاومة تحمل nonintegrated episomes المستمرة من pΔGOI استهداف البلازميد، ونلاحظ أن الانتقاء المستمر غالبا ما يدفع هذه episomesلدمج. ونحن نلاحظ أيضا بعض خلفية نادرة في النوع الأول Δ ku80 سلالة بسبب التكامل غير مقصودة من pΔGOI استهداف البلازميد، والذي يحتوي على [كدنا] HXGPRT أعرب عن طريق DHFR 5 'و 3' عناصر المروج، إما إلى موضع DHFR أو في HXGPRT حذف جزئيا الموضع 14. في حين أن هذا حدث نادر هو التكامل المستهدفة، لم يكن التكامل المنشود ويخدم كنقطة محورية لنتذكر في تصميم أي استراتيجية استبدال الجينات. تناظر DNA أكبر من 120 شركة بريتيش بتروليوم التي تقوم على pΔGOI الاستهداف البلازميد قد توفر موقع بديل لإعادة التركيب في Δ ku80 سلالات 2 التي يمكن أن تعطي مرة أخرى على خلفية غير مرغوب فيها. في النوع الثاني PRU Δ ku80 سلالة يتم تقليل هذه الخلفية أو معدومة مقارنة مع النوع الأول لأنه يعتمد على علامة اختيار HXGPRT على النوع الأول من متواليات التي لديها أشكال متعددة من تركيبة بالمقارنة مع النوع الثاني الحمض النووي التييقلل إلى حد كبير من هذه الخلفية نادرة في التجارب باستخدام نوع II PRU Δ ku80 سلالة 1. إذا كان موضع الجين ضروري (لا يمكن حذف)، أو لديه الجين منخفضة للغاية استهداف تردد في مكان الجريمة، أو إذا المستمرة [nonintegrated] لم يتم القضاء episomes بسهولة عن طريق النمو والاختيار، وهذا نمط الأبوية تهيمن على نمط لوحظ في MPA استنساخ مقاومة. بدلا من ذلك، لوحظ جزيء الحمض النووي التي تستهدف في بعض الأحيان إلى دمج في فقط 5 'أو 3' لوحظ الجيني تستهدف حماية والفرقة من أجل إما PCR3 أو PCR4 (ولكن ليس على حد سواء) جنبا إلى جنب مع PCR1 وPCR2 كما رأينا لاستنساخ 10 (5 'التكامل) واستنساخ 7 (3' التكامل) (الشكل 2C). هذه الأنماط تشير إلى وقوع نادرة من كرة عرضية واحدة على التكامل من استهداف البلازميد في مكان الجريمة أن يدمج HXGPRT ولكن هذا التكامل المستهدفة لا حذف الجينات في المصالح. هذا النمط (الحارات 7 و 10 في الشكل 2C) مphasizes ضرورة إبلاغ بيانات PCR للتحقق من وقعت أن التكامل المستهدفة بدلا من واحد مثلي عبور أكثر والتكامل الثاني امتماثلان للجزيء الاستهداف. نادرا ما، نلاحظ خليط الوراثية التي يمثلها استنساخ 12 (الشكل 2C) الذي يمثل كلا من نمط الأبوية ونمط الحذف المستهدفة. هذا النمط على الأرجح تنشأ في بعض الأحيان من اثنين من المورثات الطفيليات التي تكون موجودة في نفس الموقع في استنساخ جيدا. ويرد التخطيطي العام لإزالة HXGPRT من Δ ku80Δgoi :: HXGPRT لحذف HXGPRT من سلالة (الشكل 3A). الزوج التمهيدي تستخدم للتحقق من صحة إزالة HXGPRT من Δ Δ ku80 gra2 :: HXGPRT (الشكل 3B) يضاعف فريدة من نوعها ~ 1.2 KBP الفرقة في PCR5 كما رأينا في استنساخ 4 و 7 و 9 و 11 و 12 (الشكل 3C). إذا لم تتم إزالة HXGPRT من موضع، و~ 3.لوحظ 4 KBP الفرقة (استنساخ 1، 2، 3، 6، 8، 10، والرقابة الأبوية). عدة آليات العمل على أن تكون إزالة HXGPRT (6TX اختيار) أكثر صعوبة وأقل كفاءة من التكامل من HXGPRT (MPA + X اختيار). MPA الاختيار هو ببساطة أكثر كفاءة من 6TX اختيار 14،16. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى مستويات أعلى من التعبير HXGPRT لاختيار 6TX من لتحديدات MPA 16،24. ونتيجة لذلك، يمكن أن الطفرات التي قد تقلل من نشاط انزيم HXGPRT أو طفرات أو تغيرات جينية التي تقلل من مستوى التعبير عن HXGPRT في موضع الجين يحتمل إلغاء فعالية اختيار 6TX. حتى مع هذه التحديات من اختيار 6TX، فإن نسبة النجاح من اختيار 6TX في سلالات ku80 Δ أكبر من 90٪ في المحاولة الأولى 1-3. ويرد المخطط العام لمباشرة وضع علامات C-محطة من البروتين الترميز الجينات (الشكل 4). هذايستخدم نظام التكامل المباشر عبر الصليب الضعف خلال إعادة التركيب مثلي من HXGPRT 3 'من الجينات المرتبطة دلاليا ويعمل أيضا التحقق من صحة استراتيجيات مماثلة لتلك المذكورة أعلاه. عندما يشتبه في أن تكون الجينات الجين ضروري هذا يمكن التحقق باستخدام ترنسفكأيشن الثاني مع معزولة بشكل مستقل استهداف الحمض النووي البلازميد. طرق بديلة، مثل خطط لتنظيم التعبير الجيني، متاحة لمزيد من التحقق ما إذا كان الجين ضروري 25. الشكل 1. نظرة عامة على تصميم DNA البلازميد استهداف. A. تخطيطي لتصميم تتداخل الاشعال تستخدم لتضخيم PCR 5 'و 3' الأجنحة هدف مع 33 التداخل BP لناقلات المكوك pRS416 وHXGPRT كاسيت minigene. كانت الاشعال مبين في التخطيطييستخدم لتوليد 5 'و 3' الأجنحة الهدف من pΔROP18 10. B. الاستراتيجية العامة لتصميم جزيء DNA الاستهداف. العمود الفقري للpΔGOI هو pRS416 المكوك ناقلات المحتوية على اليوراسيل (URA) والأمبيسلين (AMP) علامات للاختيار. إدراجها في pRS416 هو ~ 1 KBP 5 'DNA الجهة المستهدفة من تضخيم الحمض النووي الجيني مع تداخل للكاسيت minigene HXGPRT وpRS416 باستخدام الاشعال F1 وR1، A ~ 1 KBP 3' يتم تضخيمه DNA الجهة المستهدفة من الحمض النووي الجيني مع تداخل لل الكاسيت minigene HXGPRT وpRS416 باستخدام الاشعال F2 وR2 وكاسيت minigene HXGPRT. يتم إضافة ما يلي انزيم التقييد فريد مواقع هضم لالاشعال: RE.X (تقييد انزيم قطع موقع X) في التمهيدي F1 لخفض البلازميد في 5 'نهاية 5' DNA الجهة المستهدفة، RE.Y في R2 التمهيدي لخفض البلازميد في 'نهاية 3' 3 الهدف DNA حماية وRE.Z في الاشعال R1 و F2 لاستئصال دقيقة HXGPRTكاسيت igene. C. تسلسل التمهيدي تستخدم لتوليد بناء استهداف لحذف rop18. المناطق جريئة تتوافق مع T. تسلسل الجينوم المقوسة، والمناطق nonbold تتوافق مع مواقع انزيم التقييد ومتواليات التي تتداخل مع pRS416 وكاسيت minigene HXGPRT. الزوج التمهيدي HX_F وHX_R تضخيم HXGPRT minigene كاسيت 14. الاشعال قراءة من 5 'إلى 3'. الجدول مقتبس من Fentress وآخرون 10. انقر هنا لعرض أكبر شخصية . الشكل 2. نظرة عامة على بروتوكول لحذف الجين باستخدام HXGPRT. A. Disruptioن من الحكومة العراقية في ku80Δhxgprt سلالة Δ قبل عبور مزدوج مثلي حدث إعادة التركيب باستخدام ~ 1 KBP 5 'DNA الهدف حماية و~ 1 KBP 3' الحمض النووي الجهة المستهدفة على pΔGOI البلازميد. ويرد استراتيجية PCR باستخدام PCR1، PCR2، PCR3، وPCR4 (وليس إلى نطاق) التي تمكن التحقق التركيب الوراثي للتحقق من صحة الحيوانات المستنسخة مع التكامل المستهدفة من HXGPRT وحذف موضع العراقية. B. أزواج التمهيدي الممثل مصممة للتحقق من صحة الحذف من rop18 . ROP18_DF وROP18_DR تضخيم PCR1، ROP18_ExF وROP18_CxR تضخيم PCR2، ROP18_CxF وDHFR_CxR تضخيم PCR3 وDHFR_CxF وROP18_CxR تضخيم PCR4 (انظر الشكل 2A). الاشعال قراءة من 5 'إلى 3'. الجدول مقتبس من Fentress وآخرون 10. C. ممثل النتائج من التحقق من صحة الحذف الجينات المستهدفة (rop18) باستخدام HXGPRT. ترنسفكأيشن عقب البلازميد pΔROP18 إلى Δ ku80Δhxgprt والتحديد في MPA +X، MPA + ويعاير X استنساخ مقاومة لحذف rop18. التحكم سلالة الأبوية هو إيجابي للPCR 1 (~ 400 BP) وPCR 2 (~ 650 BP) المنتج والسلبية لPCR 3 (~ 1،200 BP) وPCR 4 (~ 1،300 BP) المنتج. A العراقية خروج المغلوب المستهدف هو إيجابي للPCR2، PCR3 وPCR4 المنتجات وسلبية على PCR 1 المنتج (انظر الشكل 2A). المعروضة هي لوحات ممثل عن نتائج PCR1 وPCR2 (اللوحة العلوية)، PCR3 (لوحة الأوسط)، وPCR4 (اللوحة السفلية). استنساخ 3، 4، 5، 6، 8، 9 و 11 يحمل نمط النطاقات الصحيح من PCR 1، PCR2، PCR3 وPCR4 أن يحدد الجين حدث الحذف المستهدفة في استنساخ. استنساخ 1 و 2 و 7 و 10 و 12 ليست الحذف الجينات، وتتوافق مع غيرها من نتائج ممثل المحتملة. (C = الأبوية سلالة تحكم Δ ku80Δhxgprt، M = علامات حجم). انقر هنا لعرض أكبر شخصية . الشكل (3). نظرة عامة على بروتوكول لإعادة استهداف الجينات في المصالح لحذف HXGPRT. A. استراتيجية لإزالة علامة اختيار HXGPRT قبل عبور مزدوج مثلي إعادة التركيب حدث في سلالة Δ ku80Δgoi :: HXGPRT باستخدام ~ 1 KBP 5 'DNA الهدف حماية و~ 1 KBP 3' الحمض النووي الجهة المستهدفة على pΔGOIc البلازميد. وصفت استراتيجية PCR للتحقق الوراثي باستخدام زوج التمهيدي لفحص للمنتج PCR (PCR5) الذي يمتد حذف (وليس إلى نطاق). B. زوج التمهيدي ممثل مصممة للتحقق من صحة إزالة علامة اختيار HXGPRT من gra2 موضع في سلالة Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. الاشعال GRA2 _CLF وGRA2_CxR تضخيم PCR5. الاشعال قراءة من 5 'إلى 3' لوحة. C. الممثل من الحيوانات المستنسخة مقاومة لل6TX التي يمكن الحصول عليها ترنسفكأيشن التالية من pΔGOIc البلازميد في Δ ku80Δgoi :: HXGPRT والتحديد في 6TX. استنساخ 4 و 7 و 9 و 11 و 12 يحمل نمط النطاقات الصحيح من PCR5 الذي يتوافق مع حذف المستهدفة من علامة HXGPRT (~ 1.2 KBP المنتج الذي يمتد 'الجناح مع تداخل طفيف مع 5' 3 الجناح وخارجه 3 ' الجناح). استنساخ 1، 2، 3، 6، 8، و 10 (هذه الفرقة هي ضوء) تمثل نمط النطاقات المتوقعة من حوالي ~ 3.4 KBP الذي يتوافق مع النمط الوراثي استنساخ الوالدين، على الرغم من هذه الحيوانات المستنسخة أظهرت درجة من المقاومة لل6TX أن يسمح اختيارهم (هذا النمط الظاهري يمكن أن تنشأ أحيانا بشكل عفوي من قبل الغلق من HXGPRT التعبير (انظر الملاحظة في بروتوكول 2.1 (الخطوة 8) وقسم ممثل النتائج). (C = الأبوية سلالة تحكم Δ ku80Δgoi :: HXGPRT، M = علامات حجم).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية. الشكل 4. تم تصميم جزيء DNA استهداف لوضع علامة على نهاية C-محطة من البروتين. تستند الاستراتيجية على قدرة علامة HXGPRT لتعمل أيضا باسم المنطقة التنظيمية المصب 3 '. العمود الفقري للpΔGOItag هو pRS416 المكوك ناقلات تحتوي على اليوراسيل (URA) والأمبيسلين (AMP) علامات للاختيار. إدراجها في pRS416 هو ~ 1 KBP 5 'DNA الجهة المستهدفة من تضخيم الحمض النووي الجيني مع تداخل للكاسيت minigene HXGPRT وpRS416 باستخدام Fgoi وRtag الاشعال، A ~ 1 KBP 3' يتم تضخيمه DNA الجهة المستهدفة من الحمض النووي الجيني مع تداخل لل الكاسيت minigene HXGPRT وpRS416 باستخدام F2 وR2الاشعال وكاسيت minigene HXGPRT. 5 'DNA الجهة المستهدفة يستبدل رامزة إنهاء مع علامة (HA، MYC، صاحب، الخ)، يليه كودون إنهاء الاستبدال. MPA + X اختيار يدمج علامة C-محطة وHXGPRT المصب، ويحرك 3 'UTR إلى موضع التالية علامة HXGPRT. يتم إضافة ما يلي انزيم التقييد فريد مواقع هضم لالاشعال: RE.X (تقييد انزيم قطع موقع X) في التمهيدي Fgoi لخفض البلازميد في 5 'نهاية 5' DNA الجهة المستهدفة، وRE.Y في التمهيدي R2 لخفض البلازميد في 'نهاية 3' 3 DNA الجهة المستهدفة، وRE.Z في Rtag والاشعال F2 لاستئصال كاسيت minigene HXGPRT للاستخدام لبناء البلازميد لإعادة استهداف موضع الجينات المرتبطة دلاليا حذف علامة HXGPRT الذي سيعيد وضع 3 'UTR.
Discussion
ونحن هنا نقدم بروتوكول لجينة فعالة تستهدف في Δ ku80 سلالات طفيلي لتمكين استرداد فعالة من ذرية التلاعب بها وراثيا التي تمتلك الحذف استهداف الجينات، واستبدال الجين، و / أو الجينات الموسومة. تنفيذ متسلسلة من هذه الأساليب يوفر نهجا موثوق بها لعزل المسوخ طفيلي التي تحتوي على التلاعب الجيني المستهدفة واحد أو عدة 1-3. في حين أن الجيل من حذف استهدفت يعتمد على عوامل متعددة، استخدام Δ ku80 سلالة مع الاستراتيجية المقدمة وبروتوكول يزيد بشكل كبير من كفاءة وسهولة صنع سلالات متحولة محددة بدقة من T. المقوسة للدراسات الجينية وظيفية.
جينوم T. وفرداني المقوسة خلال مراحل اللاجنسي. وبالتالي النظر إلى جعل عند التخطيط لحذف الجين هو أن هذا الجين لا يجب أن يكون أساسيا في المختبر. ومع ذلك، فإن كفاءة targeتينغ بالضربة القاضية جين في Δ ku80 سلالات عالية جدا، وهذا يتيح للعزل سلالات متحولة مع معدلات تكرار ضعاف بشكل ملحوظ. إذا كان الجين المستهدف هو ضروري، والطفيليات غالبا ما تتوقف لتكرار أثناء الاختيار. آخر عاملا حاسما في التلاعب الجيني المستهدف هو أن التماثل الكمال مع ما لا يقل عن 620 شركة بريتيش بتروليوم من الجهة استهداف الجيني هو مطلوب للحصول على التكاملات كشف استهدفت 2. المناطق أطول من التماثل إنتاج كفاءات أعلى من الاستهداف وباستخدام استهداف الأجنحة الحمض النووي من حوالي 1،000 سنة مضت هو نهج موثوقة وفعالة 1-4. لهذا السبب من المهم أن يتم إنشاء الأجنحة استهداف الجيني من نفس السلالة من T. المقوسة (RH، PRU) لان السلالة التي يتم التلاعب بها وراثيا. عدم تناظر كافية يمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان في التكامل استهدفت واحدة من الجينوم الجهة الاستهداف، ولكن ليس غيرها. التكامل ناقصة أو عدم الحصول على ماجستير خروج المغلوبY يكون أيضا بسبب استمرار episomal. مباشرة بعد ترنسفكأيشن، يتم nonintegrated كل من الجزيئات التي تستهدف episomes، وأحيانا تستهدف الجزيئات يمكن أن تستمر كما episomes لأجيال عديدة. باستخدام الأجنحة DNA الهدف من ~ 1 KBP والاستمرار في تمرير الطفيليات تحت الاختيار قبل إعادة subcloning كثيرا ما يحل المشاكل المرتبطة استمرار episomal.
بمجرد التحقق من صحة بالضربة القاضية ويتم إزالة علامة HXGPRT، ويمكن تكرار هذه الاستراتيجية تستهدف الجين على الحكومة العراقية الثانية لتوليد متعددة الحذف الجينات في سلالة الطفيلي واحدة 1-3. ويمكن أيضا توليد الحذف، واستبدال، أو الجينات الموسومة إنجازه باستخدام علامات اختيار مختلفة (بليوميسين، CAT، بيريميثامين مقاومة DHFR، الخ). على الرغم من أن علامة اختيار CAT موجود في النوع الثاني Δ ku80 PRU الجينوم 1 حاليا، يمكن إزالة هذه العلامة باستخدام HXGPRT </EM> بروتوكول اختيار صفها هنا. في أيدينا، HXGPRT الاختيار هو الأكثر أمانا والأكثر كفاءة مع علامة أعلى كفاءة الاستهداف حيث A-نسخة واحدة الإدراج المستهدف هو كاف لاختيار القوي في MPA + X المتوسطة. HXGPRT يوفر أيضا النهج الوحيد المفيد حاليا للحذف المستهدفة من علامة اختيار (الشكل 3) باستخدام 6 thioxanthine (6TX) اختيار 2،3. وهكذا يوفر هذا البروتوكول النهج الحالي فقط لتطوير سلالات متحولة تعريف مع العديد من التلاعب الجيني المستهدفة.
يوفر هذا البروتوكول طريقة قيمة وفعالة للتلاعب الجيني المستهدفة في Δ ku80 سلالات من المقوسة الغوندية وينطبق على تحليل جين واحد، عائلة من الجينات، أو على نطاق الجينوم دراسات الجينية وظيفية. قبل توافر Δ ku80 سلالات 1،2، وكانت هذه الطرق غير مجدية على نطاق واسع بسبب المعهد الوطني للإحصاءfficiency من هذه الأساليب. وبالتالي، فإن هذا البروتوكول ينطبق على نطاق واسع للتلاعب الجيني المستهدفة من المقوسة الغوندية ومتاح لجميع المحققين مهتمون في معالجة مجموعة من الأسئلة على الطفيليات علم الأحياء، استجابة المضيف، وعلم الجينوم وظيفية.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة لDJB (AI041930، AI073142، AI075931، AI091461 و).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Overlap Primers | Integrated DNA Technologies | 4 nmole Ultramer DNA oligos | |
| Validation Primers | Integrated DNA Technologies | 100 nmole DNA Oligo | |
| Yeast Strain #90845 | ATCC | Designation FY834 | |
| Shuttle Vector pRS416 | ATCC | 87521 | |
| DH10B E. coli | Invitrogen | 12033-015 | SOC broth in kit with E. coli |
| Resuspension Buffer | Qiagen | Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
| Glass Beads | Scientific Industries | SI-BG05 | 0.5 mm acid-washed |
| Qiacube Automated Robotic Work Station | Qiagen | ||
| Electroporation Cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | 2 mm-gap |
| BTX600 electroporator | BTX | ||
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12662 | QIAprep Spin Maxiprep Kit |
| 25 cm2 Canted neck plug seal flask | Corning | 430168 | |
| 150 cm2 Canted Neck plug seal flask | Corning | 430823 | |
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | ATCC | SCRC1041 | |
| Swin-lok Filter Holder | Whatman | 420200 | 25-mm-diameter |
| Membrane | Whatman | 110612 | Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter |
| Mycophenolic acid (MPA) | Sigma | ||
| Xanthine (X) | Sigma | ||
| 96-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
| 24-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
| MEM Eagle Media | Lonza Biowhittaker | 12-611F | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-111 | |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Spin Column | Primm Labs | PAE-100 | Easy Clean DNA Extraction Spin Kit |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | ||
| 6-thioxanthine | Acros Organics | ||
| Tissue DNA Minikit | Qiagen | 51104 | QIAamp DNA Blood Mini Kit |
| Cell Culture Freeze/Recovery Media | Gibco | 126-48-010 | |
| Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30028.02 | minus calcium, minus magensium |
Riferimenti
- Fox, B. A., et al. Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection. Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).
- Fox, B. A., Bzik, D. J. Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5′-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii. Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).
- Hortua Triana, M. A., et al. Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).
- Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma gondii: the model apicomplexan. Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).
- Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).
- Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma: the next 100 years. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).
- Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).
- Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility. Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).
- Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).
- Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA. Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).
- Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii. PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).
- Szatanek, T., et al. Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).
- Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation. J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis. Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).
- Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).
- Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).
- Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation. Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).
- Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).
- vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).
- Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).
- Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion. Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).
Citazione di questo articolo
Rommereim, L. M., Hortua Triana, M. A., Falla, A., Sanders, K. L., Guevara, R. B., Bzik, D. J., Fox, B. A. Genetic Manipulation in Δku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (77), e50598, doi:10.3791/50598 (2013).