إعداد نموذج البروتين من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من نسيج
Summary
الفورمالين الأرشيفية ثابتة وجزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) العينات السريرية هي مادة قيمة للتحقيق من الأمراض. نحن هنا يبرهن على وجود إعداد سير العمل عينة مما يتيح تحليل متعمق البروتين من الأنسجة FFPE microdissected.
Abstract
المواد السريرية الحفاظ هو مصدرا فريدا للتحقيق البروتين من اضطرابات الإنسان. نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل مما يسمح التحليل الكمي على نطاق واسع من الفورمالين الثابتة وجزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الأنسجة. ويتألف الإجراء أربع خطوات متميزة. أول واحد هو إعداد الأبواب من المواد FFPE وتسليخ مجهري للخلايا الفائدة. في الخطوة الثانية هي هي lysed الخلايا المعزولة ومعالجتها باستخدام 'تصفية بمساعدة عينة إعداد' (FASP) التقنية. في هذه الخطوة، ونضبت البروتينات من الكواشف المستخدمة للتحلل العينة ويتم هضمها في يومين الخطوات باستخدام endoproteinase LysC والتربسين.
بعد كل عملية الهضم، يتم جمع الببتيدات في كسور منفصلة ويتم تحديد محتواها باستخدام قياس مضان حساسة للغاية. أخيرا، ومجزأة الببتيدات على microcolumns 'ماصة طرف'. يتم فصل LysC-الببتيدات إلى 4 كسور في حين أن المؤسسة العامة زيتيةيتم فصل ptides في 2 الكسور. بهذه الطريقة عينات أعدت تسمح تحليل proteomes من كميات ضئيلة من المواد إلى عمق 10،000 البروتينات. وبالتالي، فإن سير العمل وصفها هي تقنية قوية لدراسة الأمراض في نطاق المنظومة الموضة فضلا عن تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة والأهداف المخدرات.
Introduction
تحديد مع امتصاص العرق وتضمينها في البارافين (FFPE) هو الأسلوب القياسي لحفظ والتحقيق pathomorphologic المواد الأنسجة السريرية. المجهري للأنسجة المحفوظة يسمح تحديد المرض المرتبطة تغيرات شكلية، وكشف وسجل وقوع المرض مستضدات ذات الصلة. منذ يستخدم عادة سوى جزء صغير من العينة FFPE في هذه التحليلات، لا تزال كميات كبيرة من المواد السريرية أرشفة ويمكن استغلالها في أنواع أخرى من الدراسات.
خلال العقد الأخير تم تعزيز البحوث في علوم الحياة عن طريق التكنولوجيا البروتين قوية. يسمح هذا تقنية التعرف على الهوية والكميات الآلاف من البروتينات في مخاليط معقدة البروتين. سمة هامة من التكنولوجيا هو أن هناك حاجة إلى كميات ضئيلة فقط من المواد ليحلل نطاق واسع. أظهرت دراسات حديثة أن البروتينات البروتين يمكن دراستها على مقياس من شركات تقريباوليته proteomes 1، 2. هذا النوع من التحقيقات تمكن نظام رؤى واسعة في تكوين الخلايا وتحديد مجموعات من البروتينات التي تحدث في مستويات الشاذة في الأمراض. في حين أن هذه الدراسات من القدرات اللازمة الطيفي كتلة كبيرة، وقد أثبتت أعمال حديثة أن مدى مماثلة لتحديد الهوية لا يمكن أن يتحقق في غضون يوم واحد من قياس 3.
متطلبات منخفضة نسبيا كمية العينة، ومدى توافر واسعة من العينات السريرية الحفاظ إغراء لنا وللآخرين لتطوير أساليب تمكين استكشاف البروتين من المواد FFPE (لاستعراض رؤية 4). الاستفادة من عكس اتجاه التثبيت الفورمالين تحت المعالجة الحرارية وضعنا بروتوكولا يسمح استخراج كمية من البروتينات من الأنسجة الثابتة 5. لقد أظهرنا أن الإجراء تثبيت يحفظ البروتينات فحسب، ولكن أيضا على الأقل بعض التعديلات ما بعد النقل. Phosphorylation وN-ارتباط بالغليكوزيل يمكن دراستها باستخدام عينات FFPE 5، ومع ذلك شرطا أساسيا لأنها تسيطر تماما جمع الأنسجة وتخزين وتثبيت الأوضاع. المقبل، ونحن قد اشتركا في تطوير طريقة لالتقاط الليزر تسليخ مجهري للأنسجة الثابتة وللمفاعل على أساس عينة البروتين تجهيز 6، 7. دراسة على نطاق واسع على سرطان القولون والمستقيم يسمح التحليل الكمي من 7،500 البروتينات من microdissected من المواد السريرية 8. أخيرا، فقد قمنا بتحسين طريق استكشاف المواد microdissected من خلال تطبيق مرتين متتاليتين البروتين خطوة الهضم بروتوكول 9. في مقارنة لاستراتيجيات مشتركة باستخدام انزيم الهضم واحد، وهذا الإجراء يمكن توليد المزيد من الببتيدات تسلسل فريدة من نوعها، وبالتالي يؤدي إلى عمق أكبر من تحديد البروتين. تحليل microdissected غدي القولون الإنسان يسمح تحليل البروتين إلى عمق 9،500 البروتينات في عينة 3. في هذا عشيقذ نحن تعيينها 55،000 الببتيدات لكل عينة مما يتيح تحديد 88-89٪ بروتينات مع لا يقل عن 2 الببتيدات. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لإعداد عينات من المواد لتحليلها FFPE LC-MS/MS. ويتألف هذا البروتوكول إعداد شرائح الأنسجة لتسليخ مجهري، تحلل الخلايا المعزولة، وتجهيز العينات في شكل مفاعل (FASP) 6. ثم نحن تصف تقرير spectrofluorometric من غلة الببتيد؛ مهمة ذات أهمية عالية لتحديد الببتيد الأمثل من قبل مطياف الكتلة. أخيرا، علينا أن نظهر مبادل أنيون قوية (ساكس) القائمة على تقنية فصل للتجزئة الببتيد. في هذه الطريقة يتم تنفيذ كل من الفصل الببتيد وتنظيف النهائي خارج باستخدام microcolumns ماصة طرف 10 و 11. هذه الخطوة اختيارية ولكن ينصح في الدراسات التي أكثر من عدد قليل ميكروجرام الببتيدات يمكن الحصول عليها من عينة واحدة. وSAX-تجزئة يمكن زيادة كبيرة في عدد ومجموعة ديناميكية من الايدنتifications وتوسيع نطاق تغطية تسلسل البروتين 3، 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على دراسة المواد FFPE من البروتين التكنولوجيا إلى عمق مقارنة مع تسلسل الحمض النووي وتقنيات ميكروأري يفتح آفاقا جديدة في العلامات البيولوجية واكتشاف الهدف المخدرات. بروتوكول صفها تمكن توصيف وتحديد الكميات من proteomes السكان من الخلايا microdissected على مقياس من 10،000 البروتينات. عند استخدام أقل للمواد microdissected يمكن إنشاء قواعد البيانات أصغر، ولكن ربما في كثير من الحالات يمكن أيضا أن توفر تلك البيانات السريرية قيمة. وبالتالي، إما العينات يمكن تحليلها مباشرة بعد العملية MED-FASP أو يمكن فصلها في أقل الكسور. منذ الإجراء FASP متوافق مع أي نوع من الأنزيم البروتيني، والانزيمات الأخرى أو الجمع بينهما يمكن استخدامها من الهضم من البروتين 6.
نوعية المواد FFPE يبدو أن المسألة الأكثر أهمية من التحليل. وقد عانينا من أن الأنسجة الثابتة من نفس الأصل ولكن يأتي من تختلفكان عيادات الأنف والحنجرة خصائص متميزة. استخدام الأنسجة من مصدر واحد وكنا قادرين على توليد عوائد عالية في الببتيدات، في حين كانت مواد مماثلة من عيادة أخرى عديمة الفائدة تقريبا. فمن المحتمل أن تثبيت تطبيق وإجراءات تضمين فضلا عن ظروف التخزين هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على خواص المادة 12 السريرية. وبالتالي فإنه من المستحسن لاختبار خصائص بعض العينات قبل البدء في مشروع أكبر.
وذكرت العديد من المنشورات استخدام المواد FFPE في الماضي. ومع ذلك، فإن عدد من البروتينات التي تم تحديدها في هذه الدراسات لا تتعدى أكثر من 1،000-2،000 البروتينات 4. النظر في حجم proteomes محددة الخلية البشرية تضم أكثر من 10،000 والبروتينات، وكانت فقط قادرة على تقديم صورة سطحية للغاية، وتقتصر تقريبا على البروتينات وفيرة للغاية المشاركة في مهام التدبير المنزلي مثل هذه الدراسات. بروتوكول لدينا تمكن العزلة الفعالة من المواد البيولوجية أو السريرية ومدمج الحفاظ على الأنسجة ويتم تحسينه لتحلل، وتجهيز البروتين والببتيد prefractionation. ونتيجة لذلك لدينا عينة إعداد سير العمل، عندما يقترن إلى مطياف الكتلة الراقية، ويتيح نظرة ثاقبة على proteomes كاملة تقريبا. ملحوظة، وهذا ممكن في متطلبات كمية عينة دقيقة.
والميزة الرئيسية لاستخدام الأنسجة المحفوظة هو توافرها واسعة نسبيا. عينات FFPE أرشفة لسنوات وعقود عديدة، وتعتبر في بعض الأحيان غير مجدية كما، والآن، وذلك بفضل التكنولوجيا البروتين، كما تظهر المواد ذات قيمة عالية للبحوث السريرية. في حين أن العديد من الأمراض يمكن دراستها باستخدام التحقيق المواد الطازجة أو المجمدة من المواد FFPE يبدو أن تكون ذات أهمية خاصة لدراسة الأمراض النادرة 12، وجمع مجموعة تمثيلية من العينة عادة ما يستغرق وقتا طويلا.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف بفضل الدكتور ماتياس مان للدعم المستمر والسيدة كاتارينا من Zettl لبيان الأسلوب.
وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك لتقدم العلوم.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9041-000 | |
| Adhesive Cap 200 opaque | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9181-000 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Sigma-Aldrich St. Louis, MO | MHS32 | |
| Forensic 30k | Merck Millipore Darmstadt, Germany | MRCF0R030 | (Previously sold as Microcon YM-30) |
| Empore Anion | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2252 | |
| Empore C18 | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2215 | |
| Trypsin | Promega | 2014-06-27 | |
| Endoproteinase Lys-C | Wako | 129-02541 |
Riferimenti
- Nagaraj, N., et al. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Molecular systems biology. 7, 548 (2011).
- Beck, M., et al. The quantitative proteome of a human cell line. Molecular systems biology. 7, 549 (2011).
- Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics. Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).
- Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
- Ostasiewicz, P., et al. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).
- Wisniewski, J. R., et al. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature. 6 (5), 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers. Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).
- Wisniewski, J. R., et al. Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma. Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).
- Wisniewski, J. R., Mann, M. Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis. Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome. J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).
- Thompson, S. M., et al. Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Proteomics Clin. Appl. , (2012).
