배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음
Summary
우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 – 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.
Abstract
MAUTHNER 세포 (M-세포) 경골 어류의 후뇌에있는 큰 reticulospinal 신경이다. 그들은 유기체가 위협을 인식 할 때 발생하는 C 시작 또는 도주 반응으로 알려진 특성 동작에 관련된 중요한 신경이다. M-세포가 광범위하게는 흥분성의 광범위한 억제 및 neuromodulatory 신호 1을 수신하기 위해 표시되었습니다 성인 금붕어에서 공부하고있다. 우리는 척추 준비 시냅스 개발의 측면을 연구하기 위해 제브라 피쉬 배아에 M-세포의 활동을 조사하고 있습니다. 1990 년대 후반 알리와 동료 CNS가 크게 손상 2,3,4시킨 제브라 피쉬 배아에있는 M-세포에서 기록 패치 클램프를위한 준비를 개발했다. 그 때의 목적은 손상 뇌 척수 제제 내의 기능적 시냅스 연결을 유지하면서 후뇌 신경 척수 뉴런과 트렁크 골격근에서 시냅스 활성을 기록했다.이 제제는 오늘날 우리의 실험실에서 사용된다. 기전 발달 시냅스 가소성을 조사하기 위해, 우리는 흥분 (AMPA 및 NMDA 매개) 5,6 및 M-세포를 개발의 억제 (GABA와 글리신) 시냅스 전류를 기록한다. 중요한 것은,이 독특한 준비는 우리가주의 깊게 배아 유기체의 시냅스 가소성과 신경 발달을 검사 준비에 준비에서 동일한 셀 (M-셀)에 반환 할 수 있습니다. 이 준비가 제공하는 장점은 1)를 포함 그대로, M-세포 상에 기능 시냅스 연결, 2) 상대적으로 저렴한 준비, 쉽게 사용할 수 배아의 3) 큰 공급 같은 세포 유형으로 돌아갑니다 4) 능력 (즉, M- 모든 준비 셀), 개별 셀의 수준에서 시냅스 개발이 물고기에서 물고기를 조사하고 할 수 있도록 5) 배아의 투명 특성상 모든 준비의 이미지.
Introduction
발달 신경 생물학에서 뛰어난 질문 중 하나는 시냅스 성숙하는 동안 시냅스 가소성 현상의 역할에 관한 것이다. 우리의 연구는 시냅스 개발의 맥락에서 동물의 행동을 이해의 전반적인 목표와 시냅스 개발의 기초가 가소성 메커니즘을 이해에 초점을 맞추고 있습니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 1990 년대 후반에 개발 연구에 상당한 견인력을 얻고있다 유기체 (제브라 피쉬, 다니오의 rerio)에 크게 손상 준비를 개발했다.
제브라 피쉬는 신경 발달 연구에 대한 몇 가지 뚜렷한 장점을 제공합니다. 예를 들어, 자사의 게놈 염기 서열을하고 하나는 유전자 활성 및 단백질 발현을 침묵 모르 폴리 노의 knockdowns 아연 손가락 핵산 분해 효소의 녹아웃을 수행 할 수 있습니다. 하나는 과잉 발현 연구를 수행 할 수있는 형질 전환 라인은 7-9을 구성 할 수있다. 배아는 취득하기가 비교적 쉽고 풍부하고,배아의 투명한 자연 잘 이미징 및 광학 유전 연구에 빌려 준다. 또한, 행동 분석이 수행 될 수 있고, 전기 생리 실험 한 생체 내에서 세포 기능을 검사 할 수있는 주로 본래 유기체에 근육 섬유, 척수 신경 뉴런 및 후뇌에 착수 할 수있다. 중요한 사실은, 우리는 준비에서 준비로, 세포의 단지 같은 클래스의 시냅스 활동을 검사하지만, 신경의 바로 그 쌍의 수 있습니다. 즉,이 하나의 발전을 연구, 반응계에서, 동일한 뉴런으로 돌아갈 수있는 레어 척추 제제의 하나이다.
최대한 가능한 신경 회로를 유지하기 위해, 우리는, 후뇌 및 척수가 그대로 남았다있는 제제를 개발 M-세포로부터 패치 클램프있다. 이러한 준비에서 뇌를 오버레이 눈, 턱, 피부는 부드럽게 제거하고 후뇌는 Peele 다음입니다있다멀리 척색에서 D, 후뇌의 복부 표면에 대한 액세스를 허용. reticulospinal 뉴런은 몇 마이크로 미터 깊이에 있으며 상대적으로 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 48 시간 포스트 수정 (HPF, 일부 약어는 표 1에 나와 있습니다)에서 세포를 전기적으로 컴팩트 한 충실히 (흥분성과 억제 전류 모두) 그들로부터 전압 문 전류 및 활동 전위가 시냅스의 활동을 기록 할 수 있습니다.
우리의 연구 결과는 시냅스 발달과 성숙의 여러 측면 전에 부화에 24 시간에 발생하는 것을 제안하고, 우리의 관심 때문에 많은 72 HPF 24 HPF에서 시대에 이르기까지 생물에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 72 HPF로, M-세포가 적은 전기 컴팩트하고 적절하게 공간 클램프에 어렵다. 기술은 M-세포,뿐만 아니라 그 유사체, 중간 2 cm 및 MiD3의 cm에서뿐만 아니라 기록하는데 사용될 수있다. 이론적으로, 하나는 SP에서 두 번 녹음을 수행 할 수있다원고 판 코드와 같은 기본 운동 신경 세포로 및 M-세포에서 신경 세포, 그러나 이것은 어려운이며 그런 어려운 기술에서 얻는 이점이 필요한 특별한 노력이 가치가되지 않을 수 있음을 주장 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명한 프로토콜은 하나가 M-세포와의 상동에서 클램프 기록을 패치 할 수 있습니다. 이 기술은 도전 손질 절차를 통해 몇 가지 주요 영역에주의해야한다. 우리는 지금이 지역의 일부를 설명하고 성공을 보장하기 위해 도움이되는 힌트를 제공 할 것입니다.
해부 / 기록 챔버의 구조는 실험의 중요한 측면이다. M-세포는 미분 간섭 콘트라스트를 사용하지 않으면 볼 어렵다. 노멀 스키 DIC는 깨끗한 유리 커버 슬립 가장 잘 작동하지만, 우리는 실 가드 (~ 1~2밀리미터)의 매우 얇은 층은 M 세포의 식별을 방해 할 정도에 DIC을 왜곡하지 않습니다 것을 발견했다. 그러므로, 우리는 작은 플라스틱 와셔 (~ 5mm 직경)에 배치되는 바닥에 얇은 유리 커버 슬립을 가지고 기록 챔버를 사용한다. 우리는 배양 접시에 실 가드 184 혼합주의 깊게 파스퇴르 피펫 세탁기의 내부에 액체 실 가드를 추가합니다. 싸이lgard 며칠 동안 실온에서 경화 될 수있다 또는 빠른 경화를 가열 할 수있다. 이 필요하지 않지만 세탁기, 실 가드는 치료 후 제거 할 수 있습니다. 해부 / 기록 챔버는 제되면 신선 실 가드 늘어선 유리 슬라이드가 필요하기 전에, 몇 주 동안 사용할 수있다.
절차의 다음 단계는 실험 (표 3)의 날에 관련된 모든 솔루션을 만드는 것입니다. ATP와 GTP하지만, 모든 것을 포함하는 세포 내 솔루션은 -20 ° C.에 사전에 5 ㎖의 분액에 저장됩니다 기록의 날에 나누어지는 실온 신선한 ATP에 해동되고 GTP가 추가됩니다. 용액을 280 mOsm하여 pH 7.4로 조정한다. 우리 손에, 우리는 발견 그 좋은 기록에 매일 결과에 신선한 ATP와 GTP의 추가. 모든 솔루션은 성공의 가장 좋은 기회를 살균 보관해야합니다.
세포 내 솔루션을 통해서 필터링 할 수 있어야합니다헥타르 0.22 μm의 필터 (시그마)의 기록에 영향을 줄 수있는 작은 입자와 이물질을 제거합니다. 이렇게하려면, 우리는 먼저, 1 ML의 주사기로 세포 내 솔루션을 그리는 주사기의 끝 부분에 필터를 부착하고 가열 및 필터의 끝에, 좋은 팁을 뽑아 플라스틱 피펫 팁을 추가하십시오. 이것은 우리가 유리 패치 피펫의 내부에 직접 여과 세포 내 솔루션을 적용 할 수 있습니다.
용액이 준비되면, 배아 마취 해부 될 수있다. 이전 해부에주의를 적절하게 유기체의 나이를 평가하기 위해주의해야한다. 약간 다른 속도로 클러치 나이의 각 배아. 유기체의 나이를 평가할 때 따라서는 somites의 수, 몸의 전체적인 모양과 계란 수정의 시간으로 표현형 단서를 사용하여 설립 절차 10, 13,에 따라 설정하는 것이 중요합니다. 모든 해부는 뒤몽 # 5 벌금 쌍으로 수행집게. 이들은 선명하고 좋은 근무 조건에서, 그렇지 않으면 후뇌의 복부 표면에 후뇌 및 결합 조직을 중첩 피부를 제거하는 것은 매우 어려운 것입니다 필요합니다. 우리는 종종 사용의 몇 주 후에 집게를 깎아 선명 돌이 자신을 수행해야합니다.
SYLGARD의 얇은 층에 물고기를 고정하기 위해, 우리는 잘 텅스텐 와이어 직경 0.001 인치에서 유행 핀을 사용합니다. 핀은 해부 현미경 아래 오래 된, 마이크로 해부 가위로 잘라, 오른쪽 척색을 통해 들어갈 정도로 작은 수 있습니다. 다른 시점에서 배아를 고정하는 것은 그들을 무력화하고 수행 할 해부 거의 불가능하게하지 않습니다. 먼저 레코딩을 수행하는 학습을 할 때, 그것의 상동에서 정체성 M-셀에 어려울 수 있습니다 (이웃 rhombomere에 있으며 특히 중간 2 cm – rhombomere 5). 일부 배아에서 세포의 두 쌍의 크기가 유사하게 나타납니다. 이석 프로M-세포의 식별을 돕기 위해 편리한 경계표를 확보합니다. 48에서 M-세포가 바로 옆에 이석 수있는 위치에 자리 잡고 있습니다 HPF, 그리고 이석이 해부하는 동안 제거 된 경우에도, 그들은 그들의 원래의 위치에 대한 마커 역할을하는 후뇌의 약간 손상된 측면 지역, 뒤에 둡니다. M-세포에서 GFP 또는 다른 형광 마커를 발현하는 형질 전환 어류, 새로운 실험자를위한 훌륭한 준비를 제공합니다. 작은 상동가 PF 12-14에 가까운 반면 우리 손에 M-세포는 48 HPF에서 약 18 ~ 24 PF의 막 용량이 있습니다. 더 큰 표면적을 가진 세포는 작은 세포에 비해 (피코 패럿 (PF) 측정) 큰 막 커패시턴스 값이 있습니다. 따라서, 멤브레인 커패시턴스는 더 큰 세포가 큰 커패시턴스 값이 셀 크기의 대략적인 지표로서 사용될 수있다. 이 전기 생리 특성은 M-셀은 그것의 동족체로부터 식별 할 수있는 다른 속성로서 기능한다. 마지막으로, 우리는 종종 루를 사용우리의 기록 우리가 녹음이 완료되면 형광 이미징을 사용하여 조사 세포 유형의 회사 식별을 수행 할 수 있습니다 (세포) 솔루션, 노란색 cifer.
3.5-4.5 MΩ의 범위의 피펫 팁 저항은 일반적으로 13 내지 15 MΩ의 범위 팁 크기 및 낮은 접속 저항, 간의 최상의 절충이다. ~ 0.1 밀리 초 (20 % -80)는 상승 시간과 ~ 0.5 밀리 지수는 12,14,15를 붕괴 (그림 3a 및 3b)이 빠른 반응 속도와 이벤트에 특히 중요합니다. 데이터는 50 ~ 100 kHz의 디지털화 속도 취득 5-10 kHz에서의 저역 주파수로 필터링된다. 패치 피펫과 관련하여, 우리는 그들이 불 닦은 기록을 얻을 수 필요가없는 것으로 나타났습니다하지만, 일화, 그것은 현미 피펫에 비해 좋은 물개를 얻는 약간 더 나은 기회를 제공하기 위해 나타납니다. 피펫 팁 비교적 큰이기 때문에, 우리는 버전 추가하지 마십시오용액에 들어가기 전에 피펫 Y 훨씬 양압. 그것은 압력의 과잉으로 적용하는 양압의 적절한 양에 결정 연습 너무 셀을 이동할 것이다 소요되고, 시일 형성을 방지 할 것이다. 셀이 부드럽게 원래의 위치에서 변위로 또한 시냅스 연락처가 손상 될 수 있습니다. 한편, 압력이 너무 낮 으면 더러운 팁의 결과와 좋은 물개를 형성하기에 충분히 세포의 표면을 청소하지 않습니다. 행복 매체는 상당한 연습과 경험에 의해 달성된다. 인감 형성은 피펫에 부정적인 전압의 응용 프로그램을 향상시킬 수있다. 우리는 일반적으로 전체 셀 모드로 혁신을위한 우수 1.2-2 GΩ의 실을 보유하고 있습니다.
되는 약물은 세포의 세포질에 적용 할 필요가있을 때, 우리는 이전에 피펫을 채우는 세포 내 솔루션에 포함. 에이전트의 손실을 방지하기 위해 피펫 솔루션을 준비 할 때주의해야합니다는 0.22 μm의 필터에 결합하는 데에 의해. 따라서, 우리는 먼저 세포 내 매체를 필터링 한 다음 신중하게 필터링 솔루션에 약물 에이전트를 추가합니다. 세포 내 구획 화합물의 응용 프로그램은 도전의 고유 한 집합이 있습니다. 예를 들어, 세포 배지에 약물의 첨가는 일반적 GΩ 시일을 형성하는 가능성을 감소 시키지만 포인트는 실험에 큰 지장없는 곳이다.
하나는 이와 같이 약리 제제의 애플리케이션이 에이전트가 전체 셀 구성의 개시로부터 셀에 대한 즉각적인 액세스를 갖기 때문에 실험자 가장 적절한 컨트롤을 기록하는 것을 허용하지 않는 실현한다. 우리는 이런 유형의 실험을 통해 데이터를 기록하는 동안 따라서, 하나는 다음으로 좋은 제어 에이전트의 비활성 형태의 세포 내 응용 프로그램입니다 알고 있어야합니다. 많은 경우에 이것은 열 – 불 활성화 된 화합물의 형태로, 스크램블 된 펩티드 O 소요공급 업체에서 얻은 비활성 이성질체 연구.
우리는 시냅스 전류 (mPSCs), 전압 – 게이트 전류와 활동 전위의 형태로 데이터를 수집. 우리가 Axograph X (존 클레멘츠)를 사용하는 것을 선호하지만, 소형 전류는 몇 가지 우수한 프로그램 (pClamp, Axograph 등)에 의해 분석 될 수있다. Axograph X는 모두 Windows 및 Macintosh 플랫폼에서 실행 및 전기 생리학 데이터의 수집 및 분석에 모두 사용 할 수 있습니다. mEPCs은 기록 자체에서 얻은 실험의 선택의 템플릿의 도움으로 찾았습니다. 개별 이벤트는 우리는 우리가 Axograph X.에서 이벤트 추적의 복사본을 포함하여 수치를 생성 할 수 칼레이다 (시너지 소프트웨어)에 데이터의 스프레드 시트를 내보낼 같은 상승 시간, 진폭, 반 폭과 부패 시간 등과 같은 속성에 대해 분석 할 수 있습니다
실험의 더 어려운 측면 중 하나는, 기록이 정리를 제공 할만큼 잘 수행되었는지 여부를 판정한다신뢰할 수있는 데이터. 큰 축삭과 수상 돌기 광범위한 프로세스가 M-세포에서 mPSCs를 기록 할 때 예를 들어, 공간 클램핑 문제가 발생할 수 있습니다. 되면 전압 클램핑 번 일반적 (프리 저항 (R 용)이 낮은 경우에는 특히) 합리적으로 잘 피펫의 끝 전압을 제어 할 수 있지만 작게되어 수지상 프로세스 또는 축삭에서 막전위의 적절한 제어가 없을 수도 멀리 피펫 팁에서. 셀이 올바르게 끼워 공간했는지 확인하는 한 가지 방법은 기록되었다 mPSCs의 진폭 대 상승 시간의 산점도를 생성하는 것이다. 데이터 사이의 상관 관계가 잘못된 공간을 클램핑의 암시이다. 공간 클램프이 좋지 경우 즉, 다음 피펫 부근에 발생 mPSCs은 빨리 멀리 피펫 거리를 발생하는 이벤트보다 시간과 더 큰 진폭을 증가해야합니다. 상관 관계가 존재한다면, 데이터는 문제가 있고 사용될 수 없다.
또 다른 측면해결되어야 전기 생리 레코딩의 누설 전류가 그 것이다. 전압이 그러한 나 + 또는 K + 전류 같은 전압 문 전류를 기록하기 위해 셀을 클램핑 할 때 특히 사실이다. 막 전위가 나머지로부터 이탈 될 때, 누설 전류는 전압 – 게이트 된 활동과 함께 기록 될 수있다. 누설 전류 (I의 L), 칼륨의 조합 (I K), 나트륨 (I NA) 및 비 – 전압 – 문이 채널을 통해 클로라이드 (I 망할 CIA) 현재 관심의 활동을 모호하게하고, 기록에서 제외해야합니다. 증폭기는 전형적으로 P / N 프로토콜 이른바 실행하여 촬영 중에 온라인으로이 기능을 수행 할 수있다. P / N 프로토콜 동안 앰프는 나머지에서 여러 개의 작은 depolarizations (또는 hyperpolarizations)를 실행하고 발생하는 결과 누설 전류를 기록합니다. 그것은 전압 문 채널을 활성화하지 않는 정도로 작은 펄스를 사용하는 것이 중요합니다. 현재이러한 펄스들 동안 발생하는 기록 및 이러한 누설 전류가 전압 게이트 된 채널 활동으로부터 감산 될 수 있도록 평균화된다.
마지막으로, 한 계정으로 세포 내 및 세포 외 용액 사이의 전극 팁에서 발생 접합 전위를 취할 필요가있다. 세포 내 및 세포 외 솔루션은 일반적으로 다른 활동과 이동성으로, 다른 이온으로 구성되어있다. 낮은 이동성을 가진 큰 이온은 작은 것보다 이온의 이동에 더 큰 저항을 제공하고이 솔루션의 교차점에 작지만 중요한 가능성의 차이가 발생할 수 있습니다. 셀에 의해 경험 적절한 전압을 결정할 때,이 접합 전위가 고려되어야한다.
여기에 제시된 기술은 몇 년 동안 우리가 실험실에서 사용되는 하나입니다. 그러나, M 세포에서 기록의 다른 방법이있다. 특히, 조셉 Fetcho와 동료가 개발 한ED 하나, 여기에 M-세포는 등쪽면 (16)에서 접근 위치를 제시보다 덜 침습적 인 방법으로 (4-5 일) 이전 이전 애벌레의 M-세포에서 기록 할 수있는 훌륭한 준비. 우리는 유사한 기술을 시도했지만 쉽게 셀 특히 어린 물고기 (즉 24 HPF HPF (72))에서, 뇌의 표면에 가까운 후뇌의 복부 측면으로부터 M-세포에 접근하는 것으로 확인했다. 또한, 등면에서 접근은 일반적으로 기록 추가 변수를 도입 할 가능성을 가지고 M-셀에서 형광 태그를 표현 형질 전환 라인의 사용을 필요로한다. 야생형 물고기를 사용하는 경우이 문제가 존재하지 않습니다. 그러나 여기에 제시된 기술로, 우리는 젊은 동물 (72 HPF 24 HPF)를 공부로 제한됩니다. 따라서, 각각의 접근 방식은 장점과 제한 사항이 있습니다.
리언의 분석 동안 스튜던트 t-테스트는 데이터의 두 그룹을 비교하는데 사용될 수있다CE (ANOVA)는 여러 그룹을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 관리는 비 파라 메트릭 데이터 대 파라 메트릭에 대한 적절한 사후 테스트를 선택하는주의해야합니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC)와 DWA에 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Equipment Name | Company | Catalogue Number |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 |
| 0.001″ Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
Riferimenti
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