Menneske neuroprogenitor celler (NPC) ble utvidet i henhold prolifererende forhold. NPC ble differensiert i neuron rike kulturer i nærvær av en kombinasjon av neurotrophins. Nevrale markører ble oppdaget av immunfluorescens farging. Å isolere en ren populasjon av nevroner, ble NPCer differensiert på PEN membran sklier og laser capture microdissection ble utført.
Neuroprogenitor celler (NPC) isolert fra human fetal hjerne ble ekspandert i henhold proliferative tilstander i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF), og fibroblast vekstfaktor (FGF) for å tilveiebringe en rikelig tilførsel av cellene. NPC ble differensiert i nærvær av en ny kombinasjon av nervevekstfaktor (NGF), hjerne-avledet neurotrop faktor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC), og retinsyre på skåler belagt med poly-L-lysin og mus laminin å skaffe neuron rike kulturer. NPC ble også differensieres i fravær av neurotrophins, DBC og retinsyre og i nærvær av ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), hvorved astrocyte rike kulturer. Differensierte NPCer ble preget av immunfluorescens farging for et panel av nevrale markører inkludert Neun, synapsin, acetylkolinesterase, synaptophysin og GAP43. Glial fibrillary surt protein (GFAP) og STAT3, astrocyte markører, ble påvist i 10-15% av differensierte NPCer. For å lettecelle-type spesifikke molekylære karakterisering, laser capture microdissection ble utført for å isolere nerveceller dyrket på polyetylen naphthalate (PEN) membran sklier. Metodene som beskrives i denne undersøkelsen gir verdifulle verktøy for å fremme forståelsen av den molekylære mekanismen for neurodegenerering.
Livs lang neurogenesis er kjent å forekomme i subventricular sone av den laterale ventrikler og i subgranular lag av dentate gyrus av den voksne hjernen hos pattedyr en. Neuroprogenitor celler (NPC) som stammer fra disse regionene er multipotente celler som kan differensieres til nevroner, astrocytter og oligodendrocytes to. NPC har vakt interesse på grunn av deres potensial til å bli transplantert i pasienter med forskjellige neurodegenerative forstyrrelser inkludert Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, slag og Alzheimers sykdom (AD) 3. Studier med NPC har generelt fokusert på denne transplantasjon vinkel, men potensialet for NPC-avledet nerveceller som en cellekulturmodell for å bestemme mekanismen for nevrodegenerasjon er ikke blitt fullt utnyttet. Tidligere studier har generelt brukt post-mitotiske neuroner isolert fra gnager hjernevev som må være isolert for hvert forsøk som de ikke erselvfornyende. Selv om menneskelig neuroblastom cellelinjer inkludert SH-SY5Y og SK-N-MC celler kan utvides, de har ikke de samme egenskapene av primære nevroner. Menneskelige NPC, på den annen side, gir både fordeler fordi de kan utvides for flere passeringer, og kan differensieres for å generere en cellepopulasjon med egenskapene til primære neuroner 4,5. I den aktuelle studien, beskriver vi en ny differensiering protokollen for å oppnå en konsistent nevron-rik befolkningen fra kommersielt tilgjengelige NPCer isolert fra menneskelig fosterets hjerne. Fordi disse kulturene inneholder en liten prosent av gliaceller, trenger vi flere metoder for å isolere en ren populasjon av nevroner for molekylær karakterisering. Laser-fangst microdissection (LCM) er en ny metode der en homogen populasjon av celler fra en vev delen kan være selektivt fanget genekspresjonsanalyser 6 for. Hjernen er et heterogent vev bestående av nerveceller, gliaceller og andre celle types. LCM er blitt brukt til å bestemme neuron-spesifikk genekspresjon analyser 7-10. Vi har tidligere utført LCM av hippocampus nevroner fra AD (Tg2576) mus hjerne seksjoner for å vise redusert uttrykk av syklisk AMP respons element bindende protein (CREB) og BDNF spesielt i hippocampus nevroner 11. I den foreliggende studien, beskriver vi prosedyrer for utvidelse av menneskelige NPCer, neuronal differensiering, immunofluorescent farging for nevronale markører og LCM for isolering av nerveceller dyrket på PEN membran sklier.
Vi beskriver i denne studien et nevron-rik cellekulturmodell ved differensiering av selvfornyende menneskelige neuroprogenitor celler og en metode for å isolere en ren populasjon av nevroner med laser capture microdissection. Vi har brukt en kombinasjon av NGF, BDNF, DBC og retinsyre for nevronal differensiering av NPCer. DBC brukes til å aktivere CREB, en transkripsjonsfaktor som forbedrer neurogenesis 12. Retinsyre induserer cellesyklus exit og reduserer glial befolkningen 13. Metoden som beskr…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Merit gjennomgang stipend (NEUD-004-07F) fra Veterans Administration (SP).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
Research Laboratories | |||
Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
Research Laboratories | |||
BSA | Sigma | A1653 | |
Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |