Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (<em> Apis mellifera</em>)
Summary
Bu protokol, biz aynı anda bal arıları iki gen (çift gen demonte) bastırmak iki strateji açıklar. Sonra bal arısı tat algısı çift gen demonte etkisini incelemek için burnumun uzantısı yanıt (PER) testi nasıl kullanılacağı mevcut.
Abstract
Bu video çift zincirli RNA (dsRNA) enjeksiyonları kullanarak bal arıları aynı anda iki gen downregülasyon RNA girişim (RNAi) 'nin yeni teknikler gösterilmiştir. Ayrıca tat algı ölçümü için hortum uzantısı yanıt (PER) testinin bir protokol sunar.
RNAi-aracılı gen demonte hedef gen ifadesi Aşağı doğru düzenleme etkili bir tekniktir. Bu teknik genellikle tek gen manipülasyonu için kullanılan, ancak etkileşimler ve genler arasında ortak etkileri tespit etmek için sınırlamalar vardır. Bu videonun ilk bölümünde, biz aynı anda iki gen (çift gen demonte olarak adlandırılır) yıkmak için iki strateji sunuyoruz. Biz her iki stratejinin etkili bir düzenleyici geri besleme döngüsü olan iki gen, vitellogeninin (vg) ve Ultraspiracle (USP), bastırmak edebiliyoruz göstermektedir. Bu çift gen demonte bir yaklaşım genler arasındaki ilişkileri incelemek için kullanılabilir ve kolayca uygulanabilirfarklı böcek türü.
Bu videonun ikinci kısmı çift gen demonte tedavisi sonrasında bal arıları içinde burnumun uzantısı yanıt (PER) testi bir örneğidir. BAŞINA testi bal arılarının, bir bal arısı davranışsal olgunlaşma ne kadar hızlı için önemli bir belirleyici olduğu da tat algısı ölçmek için standart bir testtir. Yuva arıların daha fazla tat algısı genellikle polen uzmanlık yiyecek arama ve yiyecek arama başlama erken yaşta ile ilişkili artan davranışsal gelişim gösterir. Buna ek olarak, BAŞINA test bal arıları içinde doyma veya açlık metabolik durumları tanımlamak için uygulanabilir. Son olarak, test PER arılar da yaygın olarak bal arıları öğrenme ve bellek çalışmaları için kullanılan klima için farklı koku uyaranlara eşleştirme ile birlikte.
Introduction
RNA interferans (RNAi) ökaryotik organizmaların bir yelpazede oluşur RNA temelli transkripsiyon sonrası gen susturma vardır. RNAi işlemi endojen veya eksojen çift sarmallı RNA (dsRNA) öncüleri tarafından tetiklenir. DsRNA bağlar ve küçük parçaları (20-25 bp) için dsRNA parçalayarak ribonükleaz protein Dicer harekete geçirir. Daha sonra dsRNA kılavuzun küçük parçalara argonaute proteinler tarafından tamamlayıcı mRNA bir tanıma ve bölme, RNA'ya bağlı susturma kompleksi (RISC), 1 katalitik bir bileşeni. Memelilerde, 30 nt daha uzun dsRNA'ları, RNA transkript 2 spesifik olmayan bozulmasına yol açan bir antiviral (interferon yanıtı, IFN) aktif hale. Ancak, uzun dsRNAs bu IFN 3 eksikliği olduğu için böcekler etkili ve spesifik olduğu kanıtlanmıştır.
Uzun dsRNA'ları farklı böcek türü, hedef genin baskılanması için kullanılmıştır. Bal arıları pion biridirEER böcek organizmalar hangi gelişim ve davranış birçok önemli genlerin fonksiyonları dsRNA 4,5 ile ortaya konmuştur. Çeşitli dsRNA teslimat yöntemleri bal arıları içinde gerçekleştirilmiştir: dsRNA enjeksiyon bal arısı embriyo 4 ve yetişkin arıların 7,8 gen demonte için etkili bir yaklaşım ise dsRNA besleme verimli, bal arısı larva 6 hedef gen downregüle.
Böceklere dsRNA uygulayarak sergilenen gen demonte etkiler geçicidir ve lokalize bulunmaktadır. Çalışmalar karın dsRNA enjeksiyonları ve göğüs dsRNA enjeksiyonları hem etkili böcek 9,10 karın yağ vücut hücrelerinde hedef gen ifadesi bastırmak göstermiştir. DsRNA hücreleri 10 yıkandığı hemolimf gelen dsRNA almak edebiliyoruz karın ve göğüs boşlukları ve vücut yağ hücrelerine enjekte edilir. Bununla birlikte, böyle bir yumurtalık ve beyin gibi diğer organlarda, gen ya tarafından hedeflenemezkarın veya göğüs enjeksiyonları. Bal arısı beyinde genlerin hedef için, dsRNA beyin enjeksiyonu aynı zamanda etkin bir yerel beyin alanları 11, hedef genin ifade etkileri, gerçekleştirilmiştir. Burada, yalnızca yetişkin bal arıları daha sık kullanılan karın dsRNA enjeksiyon belgelemek.
RNAi öncelikle tek bir gen hedef için kullanılmıştır ve gen fonksiyonu ortaya çıkarmak için güçlü bir araç olmuştur. Ancak, herhangi bir gen diğerlerinden izole değil, karmaşık düzenleyici ağlarda olduğunu. Biyolojik bir süreci anlamak için bir anahtar genlerin çoklu genlerin aynı anda manipülasyonlar yerine tek bir gen demonte gerektiren, birbirleriyle etkileşim nasıl incelemek için. Memeli hücre hatlarında, bilim adamları dağıtım sistemleri 12 ya da çok-microRNA (miRNA) saç tokası tasarımları 13 ile aynı anda inhibe iki veya üç gen başardı. Ama böceklerde, birden fazla gen hakemin hala test edilmemiştir. Burada, presenbir çift gen demonte elde edebilirsiniz t farklı enjeksiyon stratejileri. Bir yumurta sarısı proteini habercisi kodlar, ve çocuk hormon (JH) için varsayılan reseptör kodlar ve Ultraspiracle (USP) bal arılarının içinde JH 14 tepkiler aracılık bir transkripsiyon faktörü olarak hizmet edebilir vitellogeninin (VG): Biz iki genin hedef. Vg ve JH bir geri besleme döngüsü 15 birbirlerine düzenleyen ve bal arısı davranışsal düzenleme 9 katılmaktadırlar. Çift gen demonte kullanarak, kafasını karıştırmak Vg hem JH yolları, ve ortaklaşa bal arısı davranışı ve fizyolojisi ve nasıl vg, USP ve JH 9 etkileşim nasıl etkilediğini keşfedin.
Tat algısı bal arısı sosyal davranış 16 için bir davranış belirleyicisidir. Yüksek tat algısı ile davranış gelişimi, yuva arı davranışsal olgun hızlı ve genellikle yaşamın erken dönemlerinde yem açısından ve polen 16,17 toplamak için tercih. Rağmen düzenleyici mtat algısı altında yatan echanisms çalışmalar tat algısı iç enerji metabolizmaları 9, hormonal salgı 18,19 ve biyogenetik amin 20 yollarının bağlantılı olduğunu göstermiştir, hala belirsiz. Vg ve JH hem oransal tat algısı 7,21 önemli hormonal düzenleyicileri vardır. Laboratuvarda, bal arıları içinde tat algı bir varyasyon farklı sakaroz çözümler için burnumun uzantısı yanıt (PER) test ederek değerlendirilebilir. Her bir arı 0.1 bir seri artan konsantrasyonu, 0.3, 1, 3, 10,% 30 sakaroz ve ardından bir damla su ile onu antenler iki dokunularak test edilmiştir. Su veya sakaroz bir damlacık her antene dokunulduğunda bir arı tamamen onun hortum uzatırsa bir olumlu yanıt olduğunu kaydetti. Çözümler olumlu yanıtların sayısına göre, her bireyin tat algı seviyesi 16 belirlenebilir. Bununla birlikte, uygulama başına g ölçüm ile sınırlı değildirustatory algı. BAŞINA ayrıca doyma vs açlık gibi arıların metabolik durumunu test etmek için etkili bir yöntemdir. Sakaroz daha fazla yanıtları ile arılar genel olarak daha aç (Wang ve Amdam, yayınlanmamış veri) bulunmaktadır. Ayrıca, PER paradigma bal arıları ilişkisel öğrenme ve hafıza da kullanılabilir. Bu durumda arılar bir koku ile sakaroz su varlığı ilişkilendirmek için eğitilecektir. Arılar dernek öğrenmek, koku sadece varlığı sakaroz 22,23 ile ödüllendirmek olmadan olumlu bir hortum tepki uyandırmak olabilir. Bu videoda, bir önceki çalışmada 9 vg ve USP çift demonte ile bağlantılı olan tat algısı değerlendirmek için PER gerçekleştirmek için nasıl gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çalışmamız aynı anda yetişkin böcekler iki gen yıkmak için ilk çabadır. Sonuçlarımız dsRNA enjeksiyon (tek enjeksiyon ve iki günlük enjeksiyon) iki strateji çift gen baskılanması ve vg ve USP aynı anda gen susturulması için geçerli olan 6 gün arıların 8,9 içine dsRNA enjeksiyon sonra test edilebilir olduğunu göstermektedir. Ancak, gen demonte etkinlik hücreleri veya organları tarafından hedef gen, protein devir oranları ve dsRNA alımı verimlilik transkript …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar deney yardım için Erin Fennern teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Norveç araştırma Konseyi (180504, 185.306 ve 191.699), PEW Charitable Trust ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA P01 AG22500) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
Riferimenti
- Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
- Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
- Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
- Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
- Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
- Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
- Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
- Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
- Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
- Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
- Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
- Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
- Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
- Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
- Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
- Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
- Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
- Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
- Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
- Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
- Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
- Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E., Pfaff, D., et al. . Hormones, Brain and Behavio. , (2009).
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
- Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
- Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
- Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
- Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
- Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
- Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
- Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).
