RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em> Apis mellifera</em>)

RNA interference (RNAi) è RNA a base di post-trascrizionale silenziamento genico, che si verifica in una grande varietà di organismi eucarioti. Il processo di RNAi è attivato da RNA a doppio filamento (dsRNA) precursori endogeni o esogeni. Il dsRNA attiva la proteina Dicer ribonucleasi che lega e scinde il dsRNA di piccoli frammenti (20-25 bp). Poi i piccoli frammenti della guida dsRNA un riconoscimento e di clivaggio mRNA complementari da proteine ​​argonaute, un componente catalitico di indotto da RNA silencing complex (RISC) ^1. Nei mammiferi, dsRNAs più di 30 nt, attivano una risposta antivirale (risposta all'interferone, IFN), che porta alla degradazione aspecifica di RNA trascritti ^2. Tuttavia, lunghi dsRNAs hanno dimostrato di essere efficaci e specifici negli insetti poiché non vi è una mancanza di questo IFN ^3.

DsRNAs lunghi sono stati utilizzati per sottoregolazione di geni bersaglio in diverse specie di insetti. Le api da miele sono uno del pioneorganismi di insetti eer in cui le funzioni di molti geni importanti per lo sviluppo e il comportamento sono stati rivelati mediante dsRNA ^4,5. Diversi metodi di consegna dsRNA sono stati eseguiti in api: dsRNA alimentazione downregulates efficiente espressione del gene bersaglio nel miele delle api larve ^6, mentre l'iniezione dsRNA è un approccio efficace per il knockdown gene in embrioni di miele d'api ⁴ e api adulte ^7,8.

Gene effetti knockdown esposti applicando dsRNA di insetti sono transitori e localizzati. Studi hanno dimostrato che entrambe le iniezioni dsRNA addominali e iniezioni dsRNA toraciche sopprimere efficacemente l'espressione del gene bersaglio in cellule addominale di grasso corporeo di insetti ^9,10. DsRNA viene iniettato nella cavità addominale e toracica e le cellule di grasso corporeo sono in grado di riprendere il dsRNA dal emolinfa in cui le cellule sono immerse ^10. Tuttavia, i geni in altri organi, come ovaie ei cervelli, non possono essere bersaglio di unoiniezioni addominali o toracici. Al fine di mirare geni nel cervello miele ape, iniezione di dsRNA cervello è stato anche eseguito, che influenza in modo efficace espressione del gene bersaglio in aree cerebrali locali ^11. Qui, noi documentiamo solo dsRNA iniezione addominale che è più comunemente usato in api adulte.

RNAi è stato principalmente utilizzato per mirare ad un singolo gene ed è stato un potente strumento per rivelare la funzione del gene. Tuttavia, qualsiasi gene non è isolato dagli altri, ma è in reti complesse di regolazione. Una chiave per comprendere un processo biologico è di sezionare come i geni interagiscono tra loro, che richiede manipolazioni simultanee di geni multipli, piuttosto che un singolo gene knockdown. In linee cellulari di mammiferi, gli scienziati sono riusciti a inibire simultaneamente due o tre geni utilizzando sistemi di consegna ¹² o più microRNA (miRNA) disegni tornante ^13. Ma negli insetti, più atterramenti geni sono ancora collaudati. Qui, Present strategie di iniezione differenti in modo da raggiungere un duplice knockdown gene. Ci rivolgiamo due geni: vitellogenina (vg), che codifica per una proteina precursore tuorlo, e ultraspiracle (USP), che codifica per un recettore putativo di ormone giovanile (JH) e può servire come un fattore di trascrizione mediare le risposte a JH ¹⁴ di api mellifere. Vg e JH regolano a vicenda in un ciclo di feedback ¹⁵ e sono coinvolti nel miele delle api comportamentale regola ^9. Usando il doppio knockdown gene, abbiamo turbare entrambi Vg e percorsi JH, e scopriamo come influenzano congiuntamente comportamento delle api il miele e la fisiologia e come vg, USP e JH interagiscono ^9.

Percezione gustativa è un predittore comportamentale per il miele delle api comportamento sociale ^16. In termini di sviluppo del comportamento, le api nido con alta percezione gustativa comportamentale veloci maturo, e di solito foraggio primi anni di vita e preferiscono raccogliere il polline ^16,17. Sebbene m normativoechanisms sottostanti percezione gustativa sono ancora poco chiari, gli studi hanno dimostrato che la percezione gustativa è legata a metabolismi energetici interni ^9, la secrezione ormonale ^18,19 e biogenetica ammina percorsi ^20. Sia Vg e JH sono importanti regolatori ormonali modulando la percezione gustativa ^7,21. In laboratorio, una variazione di percezione gustativa in api può essere valutata analizzando la risposta estensione proboscide (PER) a soluzioni di saccarosio diversi. Ogni ape è testato toccando entrambe le antenne con una gocciolina di acqua seguita da una serie crescente concentrazione di 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% di saccarosio. Una risposta positiva si osserva se un ape estende completamente la proboscide quando una goccia d'acqua o di saccarosio è toccata a ciascuna antenna. In base al numero di risposte positive alle soluzioni, il livello di percezione gustativa di ogni individuo può essere determinato ^16. Tuttavia, l'applicazione del PER non è limitato alla misura gpercezione ustatory. Il PER è anche un metodo efficace per testare lo stato metabolico delle api quali sazietà vs fame. Le api con maggiori risposte al saccarosio sono più affamato in generale (Wang e Amdam, dati non pubblicati). Inoltre, il paradigma PER può essere utilizzato anche in apprendimento associativo e la memoria di api mellifere. In questo caso le api saranno addestrati per associare la presenza dell'acqua saccarosio con un odore. Quando le api imparano l'associazione, solo la presenza di odore può evocare una risposta positiva proboscide senza premiare con il saccarosio ^22,23. In questo video vi mostriamo come effettuare PER per valutare la percezione gustativa che è stato collegato con vg e USP doppio atterramento in uno studio precedente ^9.