מציאה RNAi בתיווך זוגית ג'ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (<em> אפיס mellifera</em>)
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שתי אסטרטגיות שבו זמנית לדכא שני גנים (מציאה גן כפולה) בדבורי דבש. לאחר מכן אנו מציגים כיצד להשתמש בסיומת תגובת חוטם (PER) assay כדי לחקור את ההשפעה של מציאה גן כפולה על תפיסה התעוררה אצל דבורת דבש.
Abstract
וידאו זה מדגים טכניקות חדשניות של התערבות RNA (RNAi) אשר downregulate שני גנים בו זמנית בשימוש בדבורי דבש פעמיים התקועות RNA (dsRNA) זריקות. הוא גם מציג פרוטוקול של הארכת תגובת חוטם (PER) assay למדידת בחוש טעם.
מציאה גן RNAi בתיווך היא טכניקה יעילה downregulating ביטוי יעד גן. טכניקה זו משמשת בדרך כלל למניפולצית גן יחידה, אך יש לו מגבלות לזהות אינטראקציות והשפעות משותפות בין גנים. בחלקו הראשון של הסרטון הזה, אנו מציגים שתי אסטרטגיות כדי להפיל בו זמנית שני גנים (הנקרא מציאה גן כפולה). אנחנו מראים את שתי האסטרטגיות מסוגלים לדכא ביעילות שני גנים, vitellogenin (טוב מאוד) וultraspiracle (USP), הנמצאים בלולאת משוב רגולטורים. גישת מציאה הגן הכפולה הזה יכול לשמש כדי לנתח יחסי גומלין בין הגנים ויכולה להיות מיושמת בקלות במיני חרקים שונים.
בחלקו השני של הסרטון הזה הוא הפגנה של תגובת assay הארכת חוטם (PER) בדבורי דבש לאחר הטיפול במציאת גן כפול. Assay PER הוא מבחן סטנדרטי למדידת בחוש טעם בדבורי דבש, אשר הוא מנבא מפתח עבור כמה מהר התבגרות ההתנהגות של דבורת דבש היא. בחוש טעם גדול יותר של דבורי קינון מצביע על התפתחות התנהגותית שעלתה קשורה לעתים קרובות עם גיל מוקדם יותר בתחילתו של חיפוש אחר מזון וליקוט התמחות באבקת פרחים. בנוסף, יכול להיות מיושם לכל assay לזהות מדינות המטבולית של שובע או רעב בדבורי דבש. לבסוף, לכל assay בשילוב עם זיווג גירויי ריח שונים למיזוג הדבורים גם בשימוש נרחב ללמידה ולזכרון מחקרים בדבורי דבש.
Introduction
התערבות RNA (RNAi) היא השתקת RNA המבוסס לאחר תעתיק גן, אשר מתרחשת במגוון רחב של אורגניזמים אוקריוטים. התהליך של RNAi מופעל על ידי אנדוגני או אקסוגני RNA (dsRNA) מבשרי פעמיים תקועים. DsRNA מפעילה דייסר חלבון ribonuclease אשר נקשר ודבק dsRNA לרסיסים קטנים (20-25 נקודות בסיס). ואז את שברים הקטנים של מדריך dsRNA הכרה ומחשוף של mRNAs משלימה על ידי חלבוני argonaute, מרכיב הקטליטי של RNA-Induced השתקה מורכב (RISC) 1. ביונקים, dsRNAs ארוכה יותר מ -30 NT, להפעיל תגובה אנטי (תגובת אינטרפרון, IFN) שמובילה להשפלה ספציפיות של RNA תעתיקים 2. עם זאת, dsRNAs הארוך הוכיח להיות יעיל וספציפי בחרקים שכן יש חוסר של IFN זה 3.
dsRNAs ארוך היה בשימוש במשך downregulation של גני המטרה במינים חרקים שונים. דבורי דבש הם אחד Pionאורגניזמים חרקים EER שבו פונקציות של גנים רבים וחשובים בהתפתחות וההתנהגות נחשפו באמצעות dsRNA 4,5. שיטות משלוח dsRNA כמה בוצעו בדבורי דבש: האכלת dsRNA יעילות downregulates ביטוי גן המטרה בדבש זחלי דבורה 6, ואילו הזרקת dsRNA היא גישה יעילה למציאת גן בעוברי דבורת דבש ודבורים 4 מבוגרים 7,8.
השפעות מציאה הגן הוצגו על ידי יישום dsRNA לחרקים הן זמניות ומקומיות. מחקרים הראו כי שתי זריקות dsRNA בטן וזריקות dsRNA בית חזה בצורה יעילה לדכא את ביטוי גן המטרה בתאי גוף שומן בבטן של חרקים 9,10. DsRNA מוזרק לתוך חללי בטן ובית החזה ותאי שומן בגוף הם מסוגל לקחת את dsRNA מhemolymph שבו התאים הם רחצו 10. עם זאת, לא יכולים להיות ממוקדים הגנים באיברים אחרים, כגון השחלות ומוח, או על ידיזריקות בטן או בית החזה. על מנת למקד את גנים במוח דבורת דבש, הזרקת המוח של dsRNA יש גם ביצע, אשר למעשה משפיע על ביטוי גני היעד באזורים במוח מקומי 11. כאן, אנו לתעד הזרקת dsRNA בטן שהיא נפוצה יותר בדבורי דבש למבוגרים בלבד.
RNAi כבר משמש בעיקר כדי למקד את גן יחיד וכבר כלי רב עוצמה כדי לחשוף את תפקוד הגן. עם זאת, כל גן אינו מבודד מאחרים, הוא ברשתות רגולציה מורכבות. מפתח להבנת תהליך ביולוגי הוא לנתח כיצד גנים לתקשר אחד עם השני, שדורש מניפולציות בו זמניות של מספר רב של גנים ולא במציאת גן יחידה. בשורות תאי יונקים, מדענים הצליחו בגנים של שניים או שלושה בו זמנית על ידי שימוש בעיכוב אספקת מערכות 12 או עיצובים חדים רב microRNA (מירנה) 13. אבל בחרקים, knockdowns גנים מרובים עדיין לא נבדק. כאן, אנו presenאסטרטגיות שונות להזרקת t אשר יכול להשיג מציאה גן כפולה. אנחנו למקד שני גנים: vitellogenin (טוב מאוד) אשר מקודד חלבון מקדים חלמון, וultraspiracle (USP) אשר מקודד קולט משוער להורמון נעורים (JH) ועשויה לשמש כגורם שעתוק מתווך תגובות לJH 14 בדבורי דבש. VG וJH לווסת את זה בלולאת משוב 15 ומעורבים בדבש דבורים התנהגותי בתקנה 9. באמצעות מציאה הגן הכפולה, אנחנו להפריע גם מסלולי JH VG ו, ולגלות כיצד הם משפיעים על התנהגות במשותף דבש דבורים ופיזיולוגיה ואיך VG, USP וJH אינטראקציה 9.
בחוש הטעם הוא מנבא התנהגות לדבורת דבש התנהגות חברתית 16. במונחים של פיתוח, דבורים התנהגותיות קן עם בחוש טעם גבוה התנהגותית מהירה הבוגר, ובדרך כלל מספוא השלב מוקדם בחיים ומעדיפים לאסוף אבקה 16,17. למרות מ 'לתקנותechanisms העומד בבסיס תפיסה התעוררה אצלם עדיין אינו ברור, מחקרים הראו כי תפיסה התעוררה אצלם קשורה לחילוף החומרים פנימיים אנרגיה 9, פרשה הורמונלית 18,19 וbiogenetic אמין מסלולי 20. שניהם VG וJH הם רגולטורים הורמונליים חשובים תפיסה 7,21 ויסות התעוררה אצלם. במעבדה, וריאציה של תפיסה התעוררה אצלם בדבורי דבש יכולה להיות מוערכת על ידי בדיקת תגובת הארכה חוטם (PER) לסוכרוז פתרונות שונים. כל דבורה היא נבדק על ידי נגיעה גם האנטנות שלה עם טיפה של מים ואחריו סדרה עולה ריכוז של 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30% סוכרוז. תגובה חיובית יצוין אם דבורה משתרעת במלוא חוטמה, כאשר טיפה של מים או סוכרוז היא נגעה לכל אנטנה. בהתבסס על המספר של תגובות חיוביות לפתרונים, ניתן לקבוע את רמת בחוש טעמו של כל אדם 16. עם זאת, היישום של PER אינו מוגבל למדידה גרםתפיסת ustatory. PER הוא גם שיטה יעילה כדי לבחון את המצב מטבולי של דבורים כגון שובע לעומת רעב. את הדבורים בתגובה חזק יותר לסוכרוז הם רעבים יותר באופן כללי (וואנג וAmdam, נתונים שלא פורסמו). יתר על כן, הפרדיגמה לכל יכולה לשמש גם בלמידה ובזיכרון אסוציאטיביים בדבורי דבש. במקרה זה דבורים יוכשרו לשייך את הנוכחות של המים סוכרוז עם ריח. כאשר הדבורים ללמוד עמותה, רק הנוכחות של הריח יכולה לעורר תגובה חיובית חוטם בלי לתגמל אותם עם סוכרוז 22,23. בסרטון הזה, אנו מראים כיצד לבצע PER להעריך בחוש טעם אשר כבר מחובר עם מציאה כפולה VG וUSP במחקר קודם 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר שלנו הוא המאמץ הראשון לדפוק בו זמנית במורד שני גנים בחרקים בוגרים. התוצאות שלנו מראות כי שתי האסטרטגיות של dsRNA זריקות (זריקה אחת וזריקה של יומיים) הן יעילות לדיכוי הגן הכפול, והשתקת גנים בו זמנית של VG וUSP ניתן לבדוק 6 ימים לאחר הזריקות לתוך dsRNA דבורים 8,9. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לארין Fennern לסיוע לניסוי. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר של נורבגיה (180,504, 185,306 ו191,699), קרן הצדקה PEW, ומכון הלאומי להזדקנות (NIA P01 AG22500).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
Riferimenti
- Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
- Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
- Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
- Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
- Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
- Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
- Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
- Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
- Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
- Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
- Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
- Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
- Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
- Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
- Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
- Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
- Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
- Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
- Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
- Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
- Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
- Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E., Pfaff, D., et al. . Hormones, Brain and Behavio. , (2009).
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
- Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
- Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
- Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
- Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
- Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
- Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
- Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).
