Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספק מאוד להדמית חלבון מסוימת, אמינה ואטרקטיבית. אחוזי הצלחה ופרשנות של תיוג ססגוני מבוסס IHC הוא מאתגר, במיוחד כאשר נעשו שימוש להערכת גומלין בין חלבוני היעד בתוך הרקמה עם תכולת שומן גבוהה, כגון מערכת העצבים המרכזית (CNS).
הפרוטוקול שלנו מייצג עידון של טכניקת immunolabeling תקן המותאמת במיוחד עבור זיהוי של שני חלבונים המבניים מסיסים בחולדה CNS ובלוטות לימפה היקפיות (LN) מושפעות neuroinflammation. עם זאת, עם או בלי שינויים נוספים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש סבירה לגילוי מטרות חלבון נלווים אחרות, אפילו באיברים ומינים אחרים מאשר כאן מוצגים.
Introduction
למרות ניצול של תפוקה גבוהה מתקדמת וניתוחים שבוצעו על methylome, transcriptome או אפילו ברמה proteome, immunostaining נותר תקן הזהב לגילוי חלבון ישירות במדגם רקמות, תרבית תאים או למרוח התא. מדגים את דפוס לוקליזציה / הפצה, אימונוהיסטוכימיה (IHC) עשויה להעריך יחסי יחסי גומלין הטופוגרפי של חלבוני היעד, ואף מצביעה פעילויות הביולוגיות שלהם. לכן, IHC מנוצל נרחב למטרות קליניות ומחקר, למשל, לאבחון, טיפול הערכות, חקר מנגנוני מחלה, שינויים פונקציונליים phenotypical במודלים של בעלי חיים, וכו '
שעיקרן היסטולוגיה, פתולוגיה, ביוכימיה ואימונולוגיה, IHC התקדמה באופן משמעותי מאז שנת 1941, כאשר fluorescently שכותרתו נוגדנים שימשו בפעם הראשונה לזהות אנטיגנים דלקת ריאות בתוך הרקמה הנגוע 1. Visualization של מוצרים ורכיבים הסלולר על ידי IHC מבוסס על הכריכה של נוגדנים (ABS) כדי אנטיגן הספציפי שלהם (Ag). חוץ מזה באמצעות נוגדנים מתויג fluorophore, תגובות חיסוניות יכול גם להיות דמיינו באמצעות אנזימים כמו phosphatase peroxidase 2,3 או אלקליין 4. יתר על כן, נוגדנים זהב-tagged קולואידים 5 משמשים לאיתור אינטראקציה אנטיגן-נוגדן ספציפי על ידי שני אור במיקרוסקופ אלקטרונים, בעוד תוויות רדיואקטיביים הם דמיינו ידי autoradiography.
Immunoreaction Ag-Ab ניתן לאתר באמצעות שיטות ישירות ועקיפות. השיטה הישירה היא למעשה לקל ולפשוט יותר, כפי שהיא עושה שימוש שכותרתו ישירות העיקרי Abs 6. עם זאת, בשל חוסר משמעותי של רגישות, שיטות עקיפות הם העדיפו את אלה הישירים. שני שלבי נהלי זיהוי עקיפים דורשים ללא תווית Abs העיקרי, כמו הראשון, ומסומן Abs משני המכוון נגד Abs העיקרי, כמו השכבה השנייה 7.הגברה האות יכולה להיות מושגת על ידי מעורבים נוספים, Ab שלישוני מצמידים אנזים (השיטה העקיפה שלושה שלבים) הנקשרת Ab משנית. בדרך כלל שיטות זיהוי עקיף בהם נעשה שימוש הם ביוטין avidin ו peroxidase-antiperoxidase (PAP). לחלופין, phosphatase phosphatase-antialkaline אלקליין (APAAP) מורכב יכול לשמש במקום שיטת PAP. יש לציין, phosphatase אלקליין (AP) שיטות להיראות אפילו יותר רגיש מאשר שיטות אימונו-4. שיטת avidin ביוטין המורכבת (ABC) משתמשת Ab משני biotinylated בשילוב עם-avidin ביוטין המסווג המורכב (LAB), או שכותרתו ביוטין-streptavidin מורכב (לוח). רגישות זיהוי ניתן להגדיל עוד יותר על ידי מעורבים avidin שכותרתו עם phosphatase peroxidase או אלקליין 8. שיטות זיהוי אחרות לשימוש הן תיוג פולימריים, הגברת טירמין ו חיסוני מתגלגל מעגל 9. יש לציין, שיטות זיהוי שונות ניתן לשלב לגילוי Ag מרובה באותו הרקמותמדגם, אשר דווח לראשונה בשנת 1978 4. immunostaining הכפול סימולטני המוצג כאן בוצע קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין CNS ו LN סעיפי רקמות באמצעות נוגדנים משני peroxidase הנכנס ו AP מצומדות, בהתאמה. האותות היו דמיינו באמצעות 3,3'-diaminobencidine (DAB) אַב צֶבַע ואת הכחול המהיר (FB) APAAP מורכבת, בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
נהלי IHC רגילים לעתים קרובות דורשים התאמות ספציפיות כדי להשיג תוצאה אופטימלית, מה שמרמז ניסיון רב נפוץ אבל גם "ניסוי וטעייה" גישה. מ הכנת רקמה עד להדמית היעד, כמעט כל צעד בפרוטוקול עלול להיות כפוף להם כדי המעוצבים באופן אינדיבידואלי שינויים על מנת לשפר את התוצא…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
Riferimenti
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. . Introduction to immunocytochemistry. , (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. . Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
- Van der Loos, C. . Immunoenzyme multiple staining methods. , (1999).
- Elias, J. . Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
