Работа с изображениями и 3D Реконструкция Цереброваскулярные структур в эмбриональных данио рерио
Summary
Визуализация цереброваскулярной развития в личиночной данио описывается. Методы по содействию 3D визуализации и изменять цереброваскулярные развитие с помощью химической обработки также предоставляются.
Abstract
Данио рерио являются мощным инструментом для изучения биологии развития и патологии в естественных условиях. Небольшой размер и относительной прозрачности эмбрионов данио рерио делают их особенно полезными для визуального изучения процессов, таких как сердце и развития сосудов. В ряде недавних исследований трансгенных данио, которые выражают EGFP в эндотелиальных клетках сосудов были использованы для изображения и анализа сложных сосудистых сетей в мозге и сетчатке, с помощью конфокальной микроскопии. Описания предусмотрены для подготовки, лечения и изображение эмбрионов данио рерио, которые экспрессируют усиленный зеленый флуоресцирующий белок (EGFP), а затем генерировать подробные 3D визуализации на цереброваскулярных системы. Протоколы включают лечение эмбрионов, работы с изображениями конфокальной и фиксации протоколы, которые сохраняют флуоресценции EGFP. Кроме того, полезные советы по получению высококачественных изображений цереброваскулярных структур, таких как удаление глаза, не повреждая самой близкой нервной ткани предоставляются. Потенциальные ловушкис конфокальной микроскопии обсуждаются вместе с шагов, необходимых для создания 3D-реконструкций из конфокальной стеков изображение, используя свободно доступное программное обеспечение с открытым исходным кодом.
Introduction
Данио рерио обеспечить мощную систему для изучения биологии развития, а относительная прозрачность их эмбрионов поддается визуализации на основе исследований 1. Данио теперь используется в качестве модели для развития позвоночных на протяжении десятилетий. Костистых рыб, в том числе у рыбок данио, имеют упрощенную позвоночных сосудистую систему, которая не имеет разумного гомолог в беспозвоночных. Кровь проходит от передней камере двухкамерного сердца через жабры, где она кислородом. Кровь из жабр сходится в спинной аорты и проходит через артерии, которые разветвляются на все меньшие и меньшие суда, в конечном итоге капилляров в тканях органов. В капилляров кислорода высвобождается и диоксид углерода поглощается. На венозной стороне капилляров кровь поступает в больших и больших венах и, наконец, обращается в заднюю камеру сердца, где цикл повторяется.
Взрослый данио могут заложить 200 или больше яиц за один раз, и ОНКэ оплодотворена, они развиваются быстро 2. В течение одного дня ось тела хорошо развита, в том числе мышц, что контракт и двигаться эмбрион вокруг внутри хорионического мембраны. От 2-7 дней после оплодотворения (DPF) большинство систем организма развивать, в том числе глаз и центральной нервной системы, которые могут координат плавание к еде или от яркого света. До 7 эмбрионы DPF достаточно малы, чтобы позволить для визуализации с микроскопии. Трансгенные линии, которые выражают флуоресцентные белки могут быть отображены с конфокальной или флуоресцентной микроскопии. Конфокальной визуализации может работать в паре с открытым исходным кодом программного обеспечения 3 для создания 3D визуализации комплектных сосудистых структур у эмбрионов данио рерио, которые обеспечивают биологии систем перспективу развития сосудов. Исследования связанные с изменениями в сосудистой и цереброваскулярной сложности получат выгоду от этого протокола, так как позволяет для анализа уровня системы сосудистых сетей 4,5. Обобщения методов и ресурсов обеспечитьг, что обеспечивает удобство принятия и из этих методов для исследований, требующих визуализации сосудистых структур в эмбриональном рыбок данио. Экономическая эффективность рыбок данио в качестве животной модели является объединение с новыми технологиями обработки изображений, чтобы обеспечить новые платформы с помощью которых можно оценить развитие кровеносных сосудов эффекты молекулярных путей в развитии позвоночных и гомеостаза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, описанные здесь обеспечить основу для визуальных исследований сосудистой системы в развивающихся данио. Живые экземпляры могут быть использованы для оценки физиологических параметров, таких как частота сердечных сокращений и ударного объема сердца, в то время как фиксированные образцы можно использовать для конфокальной микроскопии высокого разрешения. Дрозофилы и С. Элеганс позволяют визуализаацию, но данио являются позвоночные и обеспечивают полезную модель для позвоночных тканей, в том числе эндотелиальных системы клеток сосудов подкладке. Эти исследования могут включать значительные трансгенных линий и геномные ресурсы от данио-исследовательского сообщества. 3D-реконструкция и предоставление конфокальной изображений из эмбрионального рыбок данио, как описано здесь, позволяют для биологии систем подхода к сосудистой разветвления и плотности кровеносных сосудов, что невозможно в больших животных моделях, таких как крысы и мыши. Кроме того, как амниоты данио развиваться в изменяемой среды (E3 буфер), где можно легко добавить грhemicals которые ингибируют определенные ферменты или другие процессы, которые влияют на развитие сосудов. Концентрация и сроки химической поставки может быть изменен, что позволяет исследователю условия для тонкой настройки обработки.
1. Изменения и устранение неисправностей
Модификации этой системы может включать трансгенных линий, которые экспрессируют данио EGFP или другие флуоресцентные белки в различных ткань, орган или области определенных шаблонов 10. Кроме того, анализ неоваскулярных изменений в сетчатке данио был недавно опубликован 5. Проблемы с пигментацией у пожилых эмбрионов и взрослых данио могут быть компенсированы путем скрещивания с трансгенных линий, которые не производят масштабные пигменты или сетчатки пигмента. Проблемы с уменьшенной флуоресценции обычно в результате ненадлежащих условий фиксации. Параформальдегид (4%) в течение 1 дня является оптимальным, но сильные фиксаторы, такие как глютаральдегидом, осмия или алкоголя, можетуничтожить флуоресценцию EGFP. После фиксации эмбрионы должны храниться в PBS при 4 ° С и всегда защищен от прямого солнечного света.
2. Ограничения этого метода
Качество и разрешение 3D визуализации, произведенных с этим протоколом зависит от качества изображений, генерируемых. Проникновение света через этих эмбрионов ограничена середине сагиттальной плоскости с помощью стандартного конфокальной микроскопии. Этот аспект визуализации ограничивает глубину изображения в старых эмбрионов и взрослых, но более продвинутые системы многофотонное микроскопия позволяет для работы с изображениями на больших глубинах.
3. Значение по отношению к существующим методам
Этот протокол обеспечивает подход к анализу сетей кровеносных сосудов на уровне систем, которые могут включать целую животное. Ранее представления таких данных часто полагались на серии изображений, изложенных вместе, но 3D-рендеринга обеспечивает лучшее разрешение пространственного отнонекоторых соотношениях участие.
4. Будущие приложения
Новые разработки в области визуализации и обработки тканей обеспечит много новых приложений для этих методов, которые могут включать делая старые эмбрионов или взрослых прозрачный 11-14. Повышение транспарентности значительно увеличит проникновения в ткани с помощью конфокальной и многофотонных лазеров. Кроме того, как скорость камеры и фотоэлектронных умножителей увеличить вскоре можно будет производить 3D визуализации рыбы в режиме реального времени, обеспечивая 4-е измерение анализа.
5. Критические шаги
Важным шагом в этом протоколе является подготовка для работы с изображениями, которая включает надлежащую фиксацию. Изображений должно быть сделано как можно скорее после фиксации с высоким качеством целей, которые имеют лучшие цифровые отверстия имеющиеся. Разрешение зависит от системы формирования изображения используется, поэтому высокое качество системы в целом лучше. Создание 3D визуализации является большой объем памятитак новые, высокого класса компьютеров с большим объемом оперативной памяти и хороших графических процессоров рекомендуется.
Система визуального биологии описано здесь была оптимизирована для трансгенных данио, которые выражают EGFP в эндотелиальных клетках сосудов, хотя эти методы могут быть адаптированы к трансгенных эмбрионов, которые выражают GFP, или другие флуоресцентные белки, в популяциях нейронов, мышц, желез или любое количество другие клетки. Главное преимущество в работе с этой системы является возможность изучать то, что происходит во всем эмбриона в любое время в течение этого периода развития, в фиксированных и / или живых животных.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят прошлые и нынешние члены наших лабораториях, которые помогли разработать эти методы. Частичное финансирование предоставляется DE грантом Калифорнийского института регенеративной медицины / CIRM (RN1-00538).
Materials
| N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
| E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
| Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
| GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
| 24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
| Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
| Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
| NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
| Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
| Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
| Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |
Riferimenti
- Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer’s-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis. PLoS ONE. 7, (2012).
- Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo. Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Opitz, R., et al. Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development. Dev Biol. 372, 203-216 (2012).
- Gleave, J. A., et al. Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging. Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy. Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. 68, e4272 (2012).
