이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

1. Zebrafish의 축산, 배아의 생성 및 처리 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의지도하에 및 NIH 또는 기타 규제 기관 / 지침의 동물 관리 가이드 라인에 다음과 같은 제브라 피쉬 프로토콜을 실시한다. 특정 조직, 세포 또는 장기에 형광 단백질을 표현 제브라 피쉬 균주 Zebrafish의 국제 자원 센터 (ZIRC)에서 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Tg는 (KDR : EGPF)는이 프로토콜에서와 같이 완전한 3D 혈관 구조를 제조하는데 사용될 수 혈관 내피 세포를 06 일에서 EGFP를 표현 S843. 형질 전환 제브라 피쉬의 다른 라인은 ZIRC에서 사용할 수 있습니다. 산도, 염도, 온도, 용존 산소, 빛, 및 기타 환경 요인에 7을 모니터링 적절한 양식 시스템에서의 주택 성인 제브라 피쉬. 여기에 표시된 제브라 피쉬는 14 시간 LIG와 28.5 ° C에서 Aquaneering 주식 시스템 (샌디에고, CA)에 보관 하였다ht/10 시간 어두운주기. 성인 제브라 피쉬에게 소금물 새우와 NRD 4 / 6 물고기 음식 (소금물 새우 직접 오그 던, 유타)의 균형 잡힌 식단을 공급. 성인 남성과 번식 연령의 여성 제브라 피쉬는 짝짓기에 성공 높이기 위해 별도로 보관해야합니다. 함께 계란을 통해 가을에 충분히 큰 구멍이 메쉬 바닥이 결합 용기에 여성 (2-4)과 남성 (4-6)를 배치하여 달걀 누워 및 수정을 자극하지만, 너무 작은 제브라 피쉬 성인이 합격을위한 . 전에 저녁이 교배를 설정; 계란은 낮의 빛을주기 천천히 강도 (새벽)에 증가 일반적으로있는 동안, 새벽 근처에 배치됩니다. 결합 용기의 바닥 모든 15 ~ 30 분 계란을 확인합니다. E3 버퍼 (5 ​​mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘, 0.33 mM의 망초)과 메쉬 스트레이너 청소를 사용하여 계란을 수집합니다. 28 ° C 배양기에서 E3 버퍼와 상점으로 가득 100mm 배양 접시에 계란을 전송합니다. CER을 변경 화학 물질을 연구하는ebrovascular 원하는 화학 물질의 농도를 추가 분파. 예를 들어 neovasular 분기는 24를 시작 γ-세 크레타 제 억제제를 DMSO 4 가용화 (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5 – Difluorophenacetyl-L-알라 닐)]-S-phenylglycinet-부틸 에스테르)로 유도 될 수있다 시간 포스트 수정 (HPF). 그 때 점 배아에서 융모막에서 여전히 많은 화학 물질은 8 통과 할 수있다. 처리 조건은 융모막의 무료 휴식 배아의 능력을 손상시킬 신경 모터 효과를 가지고 있다면, 배아는 프로 나제 (2)의 어느 겸자로 수행 될 수있다 (24) 및 HPF (48) 사이에서 디 chorionated한다. 제공되는 이미지에 표시된 태아 부드럽게 두 날카롭게 집게로 융모막을 잡아 열어 찢어 dechorionated했다. 필요하다면 / 소망, 색소 형성은 HPF (24)에서 E3 버퍼에 0.003 % N-Phenylthiourea (PTU)를 첨가함으로써 억제 할 수있다. 뇌 혈관 구조체 2. 공 촛점 이미징고정 제브라 피쉬 배아에 URES 250 ㎎ / L의 Tricaine 메탄의 배아를 희생하고 2 침지하여이를 수정 – 4 ℃에서 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드 형광 태아가 들어있는 용기는 호일에 싸여되어야한다. 이미지가 될 때까지 한 번 고정, 배아는 4 ° C에서 PBS에 보관해야합니다 – EGFP 형광 강도는 약 일주일 후 작은 해결이됩니다 만, 형태는 (시야에서 볼 때) 훨씬 오래 유지됩니다. 먼저 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 하나의 눈을 제거하여 배아를 탑재 할 준비를합니다. 눈을 연결 조직 주위에 잘라 먼저 근육을 절단하고, 마지막으로 눈을 치환하는 시신경을 절단. (참고 : 양쪽 결상 원하는 경우 제거 두 눈을.) 눈을 제거한 후에, 3 % 메틸 셀룰로오스의 방울을 사용 커버 글라스에 배아 마운트. 제거 된 눈을 가진면이 커버 글라스에 직면하고 가능한 한 유리에 가깝게되도록 배아의 방향. 메틸로 전체 배아를 커버이미징 동안 건조를 방지하기 위해 lcellulose. 이미지 즉시 고품질 20X 플랜 아포 목적 (개구 = 0.75 이상)을 탑재 반전 공 촛점 현미경을 사용하여 장착 배아. 이 구성은 두 개의 유리 평면 사이 배아를 협지하고, 전면 글라스에 대해 배아를 가압 필요 비 반전 현미경 것이 바람직하다. 중간 또는 큰 조리개 설정을 사용하여 1 μm의 단위로 광 조각을 수집합니다. 2.5 μM의 확대 단계가 또한 사용될 수 있지만, 그것은 작은 물체의 공간적 순서를 결정하는 것이 더 어려울 수있다. 작은 구멍이 선명한 디테일을 생산하지만, 필요 이상 검사는 EGFP 표백도 얻을 수있는 배아로 영상의 깊이를 제한 할 수 있습니다. 공 초점 현미경은 배아를 통해 절반 방법에 대한 영상을 허용합니다. 전체 물고기의 영상을 원하는 경우, (단계 3.2의 주 참조) 처음에 두 눈을 제거, 걸 보면 후 배아를 회전반대편 2.5 – G 한쪽 반복 2.3 단계를 반복합니다. 배아 Zebrafish의 Cerebrovasculature 3. 3D 재건 무료, 3D 렌더링에 최적화 및 PC, Mac 및 Linux 컴퓨터와 호환되는 오픈 소스 ImageJ에의 피지 분포 3 (http://fiji.sc)를 사용합니다. 플러그인> 궤적> BioFormats 가져 오기 (9)는 다음, 니콘 스택 (그림 2A)에 대한 예를 들어 name.ids를 공 초점 파일을 선택 이동하여 피지로 가져 오기 공 초점 스택. 분할 채널을 확인, 자동 설정을 확인, 그레이 스케일 : Hyperstack, 컬러 모드와보기 스택을 선택합니다. 이러한 선택은 네 개의 개별 채널 패널을 엽니 다; EGFP에 대해 하나는 일반적으로 세 번째 다운을 필요합니다. C = 1 (그림 2A) 다음에 긴 이름을 가진 16 비트 이미지를 떠나 다른 세 개의 패널 (빨강, 파랑 및 알파)를 닫습니다. 이미지가 스크롤을 따 사용하지만 스캔하여 임계 값을 조정B 관심 영역 또는 구조를 가지고 조각을 찾기 위해 하단에 다음 (그림 2C)> 임계 값을 조정합니다> 이미지로 이동합니다. 등장 패널의 구조는 배경에 아주 잘 볼 수 있도록 왼쪽 상단 바 (블랙 레벨)를 밀어하고 (그림 2D)입니다 하단 슬라이드 (화이트 레벨)을 둡니다. B & W를 선택, 어두운 배경을 선택합니다. 다른 조정이 각 조각에, 검정색 배경을 선택해야하지 않는 한 각 이미지에 대한 계산 임계 값을 선택하지 마십시오. 이 과정은 새로운 8 비트 이미지를 생성합니다. 경고 임계 값은 취소 또는 저장 ImageJ에있는, 그래서 공 초점 스택은 변경이 필요할 때마다 다시로드해야합니다 수 없습니다. 숫자를 기록하고 원하는 결과를 얻을 때까지 다른 설정을 시도해보십시오. 요인 1 (최상) 또는 2 (좋은)을 재 샘플링, 플러그인> 3D 뷰어> 임계 값을 0으로 이동, 녹색 3D 출력을 할 수있는 빨간색과 파란색 색상 상자의 선택을 취소합니다 – 그렇지 않으면 위스콘신LL 흰색 렌더링을 생성 – (자동) (그림 2E) 적용을 선택합니다. 회전, 스핀과 마우스와 키보드 컨트롤 (그림 2F)를 사용하여 3D 이미지를 확대. 메뉴에서 캡처 옵션을 사용하여 어느 지점에서 정지 영상을 저장합니다. 화면에 이미지 상자의 크기는 생성 된 이미지의 픽셀 사이즈를 지시하므로 고해상도 화상 메이크 오른쪽 하단 모서리를 끌어 상자가 확대를 원하는 경우. 보기> 기록 360 ℃의 회전 (그림 2G)를 선택하여 회전하는 3D 영화를 만들 수 있습니다. 단계 당 2도까지 회전 기본적으로,하지만 훨씬 작은 파일 크기를 생성합니다 예를 들어 5도에 변경 될 수 있지만, 애니메이션에 경련을 추가 할 수 있습니다. 나중에, 미디어 플레이어로 볼 수 인터넷에 업로드하거나, 파워 포인트 프레 젠 테이션에 사용하기위한 몇 가지 가능한 형식 중 하나에 파일을 저장합니다. 오픈 소스 미디어 플레이어, VLC ( HT) :/ / www.videolan.org / VLC / index.html을 TP, 무료로 아주 잘 이러한 동영상을 처리합니다.