イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

1。ゼブラフィッシュ畜産、胚発生、治療制度的動物管理使用委員会（IACUC）の指導の下で、NIHまたはその他の規制機関/ガイドラインの動物保護ガイドラインの範囲内で、以下のゼブラフィッシュのプロトコルを実施しています。 特定の組織、細胞、または器官内の蛍光タンパク質を発現するゼブラフィッシュの株は、ゼブラフィッシュ国際リソースセンター（ZIRC）から入手できます。例えば、Tgは（KDR：EGPF）は、このプロトコルに示されるように完全な3D血管構造を製造するために使用することができる血管内皮細胞6にEGFPを発現するS843。トランスジェニックゼブラフィッシュの他の行はZIRCから入手できます。 pHは、塩分濃度、温度、溶存酸素、光、および他の環境要因7を監視し、適切な養殖システムの住宅の大人のゼブラフィッシュ。ここに示したゼブラフィッシュは、14時間営業のLIGと28.5℃でAquaneering株式会社システム（カリフォルニア州サンディエゴ）で飼育したht/10時間暗のサイクル。フィード大人のゼブラフィッシュブラインシュリンプとNRD 4月6日魚食（ブラインシュリンプ直接、オグデン、ユタ州）のバランスの取れた食事。 成人男性と繁殖可能年齢の女性のゼブラフィッシュは、交尾成功高めるために別々に収容する必要があります。 ゼブラフィッシュ大人に合格するためには卵がフォールスルーするのは十分な大きさが、あまりにも小さな穴を持つメッシュボトムを持っている相手側の容器で一緒に（2-4）、女性を配置することにより、産卵と受精を刺激し、男性（4-6） 。前夜交配を設定;卵は昼間の光周期が徐々に強度（夜明け）に増加し、通常ながら、夜明け近くにレイアウトされている。すべての15〜30分、相手コンテナの底に卵を確認してください。 E3バッファー（5のNaCl、0.17のKCl、0.33のCaCl 2、0.33 mMのMgSO 4）したメッシュストレーナーとクリーンを使って卵を収集します。 28℃のインキュベーター内のE3バッファとストアで満たされた100mm培養プレートに卵を移す。 CERを変える化学物質を研究するために、所望の化学濃度を追加分岐ebrovascular。例えばneovasular分岐がγ-セクレターゼ阻害剤（GSI IX/DAPT/N- [N-（3,5 – Difluorophenacetyl-L-アラニル）]-S-phenylglycinet-ブチルエステル）で誘導することができる24を、初めにDMSO中で可溶化4時間後に受精（HPF）。その時点での胚は、絨毛膜の中に残っているし、多くの化学物質がその8を通過することができる。処理条件は、絨毛膜の自由になる胚の能力を損なうことがあり、神経や運動の効果がある場合、胚はプロナーゼ2のいずれかの鉗子を用いて行うことができる24〜48 HPF、の間で解除chorionatedする必要があります。提供された画像に示された胚を静かに2本の尖ったピンセットで絨毛をつかみ、それを開いた引き裂くことによって絨毛膜を除去した。 所望/必要に応じて、顔料の形成は24ゼブラにおけるE3緩衝液に0.003％N-フェニルチオ尿素（PTU）を添加することによって阻害することができる。 脳血管構造体の2。共焦点イメージング固定ゼブラフィッシュ胚におけるURES 250 mg / Lのトリカインメタンで胚を犠牲にしてから、2に浸漬することにより、それらを修正 – 4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド蛍光胚を持つコンテナは、箔に包まれなければならない。画像化されるまで一度固定、胚は、4℃でPBS中に保存されるべきである – EGFP蛍光強度は約一週間後にあまり解決になりますが、形態は（明視野で見て）はるかに長く保持されます。 最初の尖ったタングステン針を用いて1の目を削除することによって胚をマウントするために準備します。筋肉を切断し、最終的には目を置換する視神経をカットまず目を結ぶ組織の周りにカット。 （注：両サイドを画像化することは、両眼を削除希望する場合。） 目が除去されると、3％のメチルセルロースのドロップを使ってカバーガラス上で胚をマウントします。オリエント胚削除された目のある側がカバーガラスに直面して、できるだけガラスに近くなるとなるよう。メチル全体胚をカバー撮像中に乾燥を防ぐためにlcellulose。 画像すぐに高品質20Xプランアポ目標（開口数= 0.75以上）を備えた倒立型共焦点顕微鏡を使用してマウント胚。この構成は、二つのガラス面間の胚を挟んで、上部ガラスに対して胚を押す必要とする非倒立顕微鏡に好適である。 中·大口径の設定を使用して1μm刻み光学スライスを収集します。 2.5μmの大きい工程を使用することもできるが、それは小さなオブジェクトの空間的順序を決定することはより困難であり得る。小さな開口部は、シャープなディテールを生産するが、必要な長いスキャンは、EGFPを漂白しても達成することができる胚にイメージングの深さを制限することがあります。共焦点顕微鏡は、胚を通じて半分程度イメージングを可能にします。 全体魚の撮影が必要な場合は、最初に両眼を削除する（ステップ3.2に注を参照）、イマジン後の胚を回転させる反対側のための2.5 – G 1側とを繰り返して、2.3を繰り返します。 胚ゼブラフィッシュ脳血管系の3。3次元再構成 3Dレンダリング、無料で、パソコン、MacおよびLinuxコンピュータとの互換性のために最適化されたオープンソースのImageJ（http://fiji.sc）、フィジー分布3を使用してください。 プラグイン> LOCI> BioFormatsインポーター9その後 、ニコンスタック（ 図2A）用など name.idsを共焦点のファイルを選択するために行くことによって、フィジーへのインポート共焦点スタック。スプリットチャンネルをチェックして、オートスケールを確認して、グレースケール：Hyperstack、カラーモードを見るこのスタックを選択します。 これらの選択は、4つの別々のチャンネルパネルを開きます。 EGFP 1つだけが、通常、第三のいずれかの下に必要とされるであろう。 C = 1（ 図2A）に続く長い名前の16ビット画像を残して、他の3パネル（赤、青、アルファ）を閉じます。 画像がスクロールTAを使用しますが、スキャンでスレッショルドを調整B目的の領域または構造を持つスライスを見つけるため底部に沿って、その後（ 図2C）>しきい値を調整>画像に移動します。 登場パネルで、構造が背景に非常によく見ることができるように、左側にある最上部のバー（黒レベル）をスライドさせ、それが（ 図2D）である下段（白レベル）のまま。白黒を選択して、暗い背景を選択します。別の調整は各スライスのために必要とされる場合を除き、各画像についての計算しきい値を選択し、黒の背景を選択しないでください。このプロセスは、新たな8ビットの画像を作成する。 警告：しきい値を元に戻すか、保存されたImageJの中なので、共焦点スタックは変更が必要になるたびに再読み込みする必要がありますすることができません。番号を書き留めて、望ましい結果が達成されるまで、別の設定を試してみてください。 緑の3D出力を作るために赤と青のカラーボックスの選択を解除し、因子1（最高の）または2（良い）をリサンプリング、プラグイン> 3Dビューア>しきい値0に行く – それ以外の場合は、WILL白レンダリングを生成- （非オート）（ 図2E）適用]を選択します。 回転スピンし、マウスとキーボードのコントロール（ 図2F）を使用して3D画像をズームします。 メニューのキャプチャ]オプションを使用して、任意のポイントで、静止画を保存します。スクリーン上の画像ボックスのサイズは、高解像度の画像が右下隅をドラッグして、ボックスを大きくすることが望まれる場合のように生成される画像のピクセル寸法を決定する。 [表示]> [録音360度回転します（ 図2G）を選択することにより、スピニング3Dムービーを作成します。回転ステップごとに2度のデフォルトは、それははるかに小さいファイルサイズが作成されている、例えば5度に変更することができますが、アニメーションにぎくしゃくを追加することがあります。 後、メディアプレーヤーを表示して、インターネットへのアップロード、またはPowerPointプレゼンテーションで使用するためのいくつかの利用可能な形式のいずれかでファイルを保存します。オープンソースのメディアプレーヤー、VLC（ HTTP :/ / www.videolan.org / VLC / index.htmlを）無料で、非常によく、これらのビデオを処理します。