成像和胚胎斑马鱼脑血管结构的三维重建

1，斑马鱼饲养，胚胎发生和治疗进行机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导下，并在美国国立卫生研究院或其他监管机构/指引的动物护理指引下斑马鱼的协议。 可从国际斑马鱼资源中心（ZIRC）表达的荧光蛋白在特定组织，细胞或器官的斑马鱼品系。例如，玻璃转化温度（KDR：EGPF）S843中血管内皮细胞6，它可以被用来产生完整的三维血管结构如本协议表达EGFP。可从ZIRC其它转基因斑马鱼。 房子成年斑马鱼在一个合适的养殖系统，可以监测pH值，盐度，温度，溶解氧，光照等环境因素7。这里显示的斑马鱼被安置在一个Aquaneering公司系统（圣地亚哥，加利福尼亚州）在28.5℃下用14小时LIGht/10小时黑暗循环。喂成年斑马鱼丰年虾和NRD 4/6鱼饲料（丰年虾直接，奥格登，犹他州）的均衡饮食。 成年男性和女性的斑马鱼繁殖的年龄应分别容纳增加交配成功。 刺激产卵和受精放置女性（2-4）和男性（4-6）一起在具有网状底部有孔足够大的鸡蛋落在通过交配容器，但太小的斑马鱼成人传递。设置在交配前一天晚上;产卵后不久的黎明，而平时白天光照周期缓慢增加强度（黎明）。检查鸡蛋在嵌合容器的底部每隔15-30分钟。 使用网状过滤器和干净的E3缓冲液（5 mM氯化钠，0.17毫米氯化钾，0.33毫米氯化钙 ，0.33毫米硫酸镁4）收集鸡蛋。转蛋到100mm培养皿在28℃培养箱中充满了E3的缓冲和存储。 研究认为改变CER化学品ebrovascular分支添加所需的化学浓度。例如neovasular分支可诱发与γ-分泌酶抑制剂（GSI IX/DAPT/N- [N-（3,5 – Difluorophenacetyl-L-丙氨酰基）]-S-phenylglycinet丁基酯）溶解在DMSO 4，开始24小时后受精（HPF）。在那个时间点的胚胎仍然是绒毛膜内，许多化学物质可以通过它8。如果一个处理条件有神经或马达效应可能损害胚胎挣脱绒毛膜的能力，那么胚胎应取消chorionated 24和​​48个高倍视野，可以用链霉蛋白酶2的一方钳子来完成的。在所提供的图像显示胚胎轻轻抓住了两个削尖钳绒毛膜和撕裂它打开dechorionated。 如果需要/想要的，色素形成，可以通过添加0.003％的N-苯基硫脲嘧啶（PTU）的E3缓冲区24 HPF抑制。 2。共焦脑结构的成像在固定的斑马鱼胚胎URES 牺牲在250 mg / L的三卡因甲磺酸盐的胚胎，然后修复它们通过浸没在2 – 4％多聚甲醛固定过夜，在4℃下容器荧光的胚胎应该用铝箔包裹。一旦固定，胚胎应贮存在PBS中于4℃直至成像 – EGFP的荧光强度变小解决后一个星期左右，但形态（如在亮视野观察）被更长的保留。 准备通过先用锋利的钨针取出一只眼睛来装载胚胎。围绕连接眼部组织切割第一再切肌肉，并最终切断视神经置换的眼睛。 （注：如果成像双方需要删除这两个眼睛。） 一旦眼睛被删除，安装胚上用降3％甲基纤维素的玻璃罩。定向的胚胎，使与被删除的眼睛的侧面向盖玻片，并尽可能靠近玻璃越好。盖上甲基整个胚胎lcellulose以防止成像过程中干燥。 图像立即使用倒置共聚焦显微镜配备有高品质的20倍计划的Apo物镜（数值孔径为0.75或更高）的安装胚胎。这种配置是优选的非倒置显微镜，将需要夹着两个玻璃面之间的胚胎，并按下胚胎靠在顶玻璃。 收集光切片1微米使用中等或大光圈设定单位。也可以使用较大的步长为2.5微米，但它可能会更加困难，以确定较小的对象的空间的顺序。小孔可产生更清晰的细节，但需要较长的扫描可漂白EGFP和也限制成像的深度成可达到的胚胎。共聚焦显微镜，可以对成像大约一半的方式，通过一个胚胎。 如果整个鱼的成像需要，在一开始就取出两只眼睛（见注在步骤3.2），IMAGIN后旋转胚胎克1侧，并重复步骤2.3 – 2.5的相对侧上。 3。3D胚胎斑马鱼Cerebrovasculature重建使用开源的ImageJ的斐济分布3（http://fiji.sc），这是用于3D渲染的优化，完全免费，并与PC，Mac和Linux计算机兼容。 进口焦堆到斐济前往插件> LOCI> BioFormats进口商9然后选择共焦文件， 例如 name.ids尼康栈（ 图2A）。选择与Hyperstack，彩色模式查看堆栈：灰度，自动定标检查，检查分裂渠道。 这些选项会打开四个独立的通道板;对于EGFP只有一个会是必要的，通常是第三个了。关闭其他三个面板（红色，蓝色和alpha）留下16位图像具有长名称后跟C = 1（ 图2A）。 虽然图像使用滚动TA通过扫描调整门槛B随着底部找到一个切片，有感兴趣的区域或结构，然后去图像>调整>阈值（ 图2C）。 在出现的面板，滑动顶部栏（黑电平）到左边，这样的结构可以看出，相当不错了背景，并留下底部的幻灯片（白电平），它在哪里（ 图2D）。选择B＆W的，选择深色背景。不要选择阈值计算为每个图像，除非需要不同的调整为每个切片，选择黑色的背景。此过程将创建一个新的8位图像。 警告：阈值不能撤销或保存在ImageJ的，所以共焦堆栈将有一个改变是必要每次都重新加载。写下数字，并尝试不同的设置，直到想要的效果。 转到插件> 3D查看器>阈值0，重采样因子1（最好）或2（好），取消选择红色和蓝色方块，以绿色3D输出 – 否则无线LL产生白色渲染-选择Apply（不自动）（ 图2E）。 旋转，旋转，并使用鼠标和键盘控制（ 图2F）放大的三维图像。 通过使用捕捉选项菜单中保存静止图像的任何一点。屏幕上的图像框的大小决定了图像的生成像素尺寸，所以如果一个高分辨率图像需要使框拖动右下角较大。 通过选择View>录制360度旋转（ 图2G）创建一个旋转的3D电影。旋转默认为每步2度，但是它可以改变为例如5度，这将造成更小的文件大小，但也可以添加到急动的动画。 将文件保存在几个可用的格式之一后用媒体播放器观看，上传到互联网，或使用PowerPoint演示文稿。开源媒体播放器，VLC（ HTTP :/ / www.videolan.org / VLC / index.html）上，是免费的，并处理这些视频非常好。