Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína
Summary
Este artículo se centra en la identificación de la interacción de datos de alta confianza entre anfitrión y proteínas de patógenos utilizando una combinación de los dos métodos ortogonales: levadura de dos híbridos seguido de un ensayo de interacción de alto rendimiento en células de mamífero llamado HT-GPCA.
Abstract
Esfuerzos importantes se reunieron para generar mapas de la red de interacción proteína-proteína a gran escala completa. Esto es fundamental para entender las relaciones patógeno-huésped y se realizó esencialmente mediante cribados genéticos en sistemas de levadura de dos híbridos. La reciente mejora de la detección de la interacción proteína-proteína mediante un ensayo de complementación de fragmento de luciferasa basado en Gaussia ahora ofrece la oportunidad de desarrollar enfoques integradores interactomic comparativos necesarios para comparar rigurosamente perfiles de interacción de proteínas a partir de diferentes variantes de cepas de patógenos contra un conjunto común de factores celulares.
Este documento se centra específicamente en la utilidad de la combinación de dos métodos ortogonales para generar proteína-proteína interacción bases de datos: la levadura de dos híbridos (Y2H) y un nuevo ensayo, de alto rendimiento ensayo de complementación proteica princeps Gaussia (HT-GPCA) realizado en células de mamífero.
nt "> Una identificación a gran escala de socios celulares de una proteína de patógeno se realiza en el apareamiento basado en proyecciones levadura de dos híbridos de bibliotecas de ADNc utilizando múltiples variantes de cepas de patógenos. Un subconjunto de socios que interactúan seleccionados en una puntuación alta confianza estadística es aún más validado en células de mamíferos para interacciones por pares con todo el conjunto de variantes de proteínas de patógenos utilizando HT-GPCA. Esta combinación de dos métodos complementarios mejora la robustez del conjunto de datos de interacción, y permite la realización de un análisis de la interacción comparativa estrictas. Tales interactómica comparativos constituye una estrategia fiable y potente para descifrar cualquier interplays patógeno-hospedador.Introduction
La creciente cantidad de datos recogidos para generar mapas de interacción proteína-proteína abre perspectivas para entender mejor las infecciones por patógenos. Como comprensión global de las infecciones de patógenos comienza a emerger, que proporciona acceso a la gama de las perturbaciones inducidas por las proteínas de patógenos cuando se conecta el proteoma humano 1. Es de este modo ofrece una manera de comprender cómo patógenos manipulan la maquinaria de la célula huésped. En particular, la asignación de varias redes de interacción virus-huésped reveló que las proteínas virales se dirigen preferentemente proteínas del huésped que son altamente conectados en la red celular (hubs), o que son fundamentales para muchos caminos en una red (proteínas cuellos de botella) 2-4. Estas interacciones permiten que los virus para manipular los procesos celulares importantes, que es fundamental para replicar y producir una progenie infecciosa. Mapeo de interacciones comparativo se llevó a cabo recientemente sobre los virus relacionados con el objetivo de extraer información relativa apatogénesis 4. Por otra parte, los estudios de la interacción huésped-patógeno paisaje se han extendido a muchos patógenos 5. La identificación de factores de células objetivo proporciona información detallada sobre las estrategias utilizadas por los patógenos de infectar las células y permite la detección de posibles marcadores patógenos.
La levadura de dos sistema híbrido es el método más popular para identificar las interacciones binarias desde la detección genética es una herramienta eficaz y sensible para la cartografía de alto rendimiento de las interacciones proteína-proteína. El enfoque que aquí se propone mejora aún más proyecciones Y2H individuales mediante la evaluación de una proteína de múltiples variantes de cepas patógenos, proporcionando así acceso a una visión comparativa de patógeno-huésped interacciones proteína-proteína. Por otra parte, una limitación importante de la levadura de dos híbridos se encuentra en una alta tasa de falsos negativos, ya que se recupera aproximadamente el 20% de las interacciones totales 6. Esto implica que las interacciones detectadas con sólo un subconjunto de patogens variantes podrían haber escapado a la detección con los otros. Por lo tanto, los socios individuales emergentes de todas las pruebas de detección de dos híbridos se enfrentan al reto aún más para la interacción con la gama completa de cepas estudiadas, proporcionando interacción de datos comparativos. Desde que se demostró que la combinación de diferentes metodologías aumenta fuertemente la solidez de la interacción proteína-proteína conjuntos de datos 7, esta validación se lleva a cabo en células de mamífero por un ensayo de complementación de proteínas-fragmento recién desarrollada llamada HT-GPCA 8. Este sistema basado en células permite la detección de interacciones de proteínas mediante la complementación de la luciferasa Gaussia princeps dividida y ha sido diseñado para ser compatible con un formato de alto rendimiento. Gracias a su tecnología de luminiscencia con sede y su bajo nivel de ruido de fondo en comparación con otro ensayo basado en la fluorescencia, HT-GPCA muestra sorprendentemente alta sensibilidad.
En general, este enfoque constituye un eficienteherramienta para generar un mapeo exhaustivo de interplays huésped-patógeno, lo que representa el primer paso hacia una comprensión global de los secuestros célula huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
Independientemente, la levadura y dos ensayos de interacción de híbridos y de mamíferos, tales como GST pull-down, o LUMIER Mappit, han demostrado ser instrumentos eficaces para la detección de interacciones proteína-proteína, pero se ven limitados por la alta tasa de falsos positivos y falsos negativos interacciones asociadas con estas técnicas 15. Por otra parte, crece la evidencia de que la combinación de métodos ortogonales aumenta la fiabilidad de la interacción obtenido conjunto de datos …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta obra fue financiada en parte con fondos del Institut Pasteur y por subvenciones de la Ligue nationale contre le Cancer (subvenciones R05/75-129 y RS07/75-75), la Association pour la Recherche sur le Cancer (becas ARC A09 / 1/5031 y 4867) y la Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 y 026 01 ANR09 MIEN). MM fue un beneficiario de una beca MENRT.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
Riferimenti
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