Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий
Summary
Эта статья посвящена выявлению высокого уверены взаимодействия между наборами данных хозяина и возбудителем белков с использованием комбинации двух ортогональных методов: дрожжи двугибридная последующей высокой пропускной способностью анализа взаимодействия в клетках млекопитающих называют HT-GPCA.
Abstract
Значительные усилия были собраны для создания крупномасштабных всеобъемлющего белок-белковых взаимодействий карты сети. Это играет важную роль для понимания патоген-хозяин отношения и, по существу, выполняет генетические скрининги в дрожжах двух гибридных систем. Недавнее улучшение взаимодействия белок-белок обнаружения Gaussia люциферазы анализа на основе дополнения фрагмента теперь предлагает возможность развивать интегративные подходы сравнительного interactomic необходимо строго сравнить профили взаимодействия белков из различных вариантов штамма возбудителя против общий набор клеточных факторов.
Эта статья специально фокусируется на полезность объединения двух ортогональных методов для создания белок-белковые взаимодействия наборов данных: дрожжи двугибридная (Y2H) и новый анализ с высокой пропускной Gaussia принцепса белка дополнения анализа (HT-GPCA) выполняются в клетках млекопитающих.
NT "> крупномасштабных идентификации ячейковых партнеров патогена протеина, в результате скрещивания на основе дрожжей двугибридная показы библиотек кДНК с использованием нескольких вариантов штамма возбудителя. подмножества взаимодействующих партнеров выбраны на высокой уверенности в себе статистические забил дальнейшего подтверждены в клетках млекопитающих для парных взаимодействий с целым набором белков патогенных вариантов использования HT-GPCA. Эта комбинация из двух взаимодополняющих методов повышения надежности взаимодействия набор данных, и позволяет выполнение строгих сравнительный анализ взаимодействия. Такой сравнительный interactomics представляют собой надежную и мощную стратегию, чтобы расшифровать любой патоген-хозяин взаимодействий.Introduction
Увеличение количества данных, собранных для генерации белок-белковое взаимодействие карты открывает перспективы для дальнейшего понимания возбудитель инфекции. В глобальном понимании возбудитель инфекции начинает появляться, он обеспечивает доступ к классам возмущений, вызванных микроорганизмами, белки при подключении протеома человека 1. Тем самым он предлагает способ понять, как патогенные манипулировать техники клетки-хозяина. В частности, отображение нескольких вирусных хозяина сетей взаимодействия показало, что вирусные белки преимущественно целевого хоста белки, которые тесно связанных в сотовой сети (концентраторы), или которые имеют решающее значение многих путей в сети (узкие белки) 2-4. Эти взаимодействия позволяют вирусам манипулировать важные клеточные процессы, играет важную роль в репликации и производить инфекционного потомства. Сравнительный отображение взаимодействий недавно были проведены на родственные вирусы с целью получения информации относительноПатогенез 4. Кроме того, исследования-хозяина патогенов пейзаж взаимодействий были распространены на многих патогенов 5. Клетки-мишени идентификации факторов дает представление о стратегии, используемые патогенами инфицировать клетки и позволяет выявлять потенциальных маркеров патогенной.
Дрожжей двугибридная система является наиболее популярным методом для идентификации парных взаимодействий, так как генетический скрининг является эффективным и чувствительным инструментом для высокой пропускной отображение белок-белковых взаимодействий. Предлагаемый здесь подход дополнительно улучшает отдельные показы Y2H путем оценки белка множественной штамма патогенных вариантов, тем самым обеспечивая доступ к сравнительный обзор патоген-хозяин белок-белковых взаимодействий. Более того, главное ограничение дрожжей двугибридная скрининга заключается в высокой ложноотрицательных, так как он восстанавливает около 20% от общего числа взаимодействий 6. Это означает, что взаимодействие обнаружены только подмножество паторода варианты, возможно, избежал обнаружения с другими. Таким образом, отдельные партнеры выходят из всех двухгибридного показы более осложняется для взаимодействия с полный спектр изученных штаммов, обеспечивая сравнительного взаимодействия наборов данных. Поскольку было показано, что сочетание различных методик сильно повышает надежность белок-белковых взаимодействий наборов 7, эта проверка выполняется в клетках млекопитающих заново разработанный белок-фрагмент комплементации анализа, называемого HT-GPCA 8. Эта клетка-система позволяет обнаруживать белковых взаимодействий путем комплементации Gaussia принцепса разделить люциферазы и был разработан, чтобы быть совместимым с высокой пропускной формате. Благодаря своей люминесценции на основе технологии и ее низкий фоновый шум по сравнению с другими флуоресцентного анализа на основе, HT-GPCA показывает поразительно высокой чувствительностью.
В целом, такой подход является эффективныминструмент для создания всеобъемлющего учета хозяин-патоген взаимодействий, которая представляет собой первый шаг на пути к глобальному пониманию клетки-хозяина угон.
Protocol
Representative Results
Discussion
Независимо, дрожжи-два гибридных и млекопитающих взаимодействия анализы, такие как GST выпадающие, Люмьер или MAPPIT, зарекомендовали себя как эффективный инструмент для выявления белок-белковых взаимодействий, но ограничены высокий уровень ложно-положительных и ложно-отрицательных вза?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана финансирование от Института Пастера и грантов от Ligue Nationale Contre Le Рак (гранты R05/75-129 и RS07/75-75), Ассоциация Pour La Recherche сюр-ле-Рака (гранты ARC A09 / 1/5031 и 4867) и Национальное агентство La Recherche (ANR07 MIME-009 02 и 026 ANR09 MIEN 01). ММ был получателем стипендии MENRT.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
Riferimenti
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
