높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정
Summary
마이크로 플레이트 기반 절차는 세포 외 효소 활성의 형광 또는 비색 분석을 위해 설명된다. 이러한 절차는 관리 기간 내에 환경 시료 다수 이러한 활동의 신속한 분석을 허용한다.
Abstract
자연 환경의 영양 순환과 탄소 처리의 대부분은 미생물에 의해 발표 세포 효소의 활동을 통해 발생합니다. 따라서, 이러한 세포 외 효소의 활성 측정은 유기물 분해 또는 질소와 인 광물 등의 생태계 수준의 프로세스의 속도에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 환경 시료에서 세포 외 효소 활성의 분석은 일반적으로 인공 측색 또는 형광 기질에 샘플을 노출하고, 기판의 가수 분해 속도를 추적 포함한다. 여기에서 우리는 짧은 기간 내에 다수의 샘플의 분석을 할 수있는 절차를 마이크로 기반의 방법을 설명한다. 샘플은 마이크로 블록 마이크로 플레이트 또는 디프 웰 96 – 웰 내에 인공 기질과 반응 할 수 있으며, 효소 활성이어서 전형적인 마이크로 플레이트를 사용 Reade에 얻어진 최종 생성물의 흡수 또는 형광에 의해 결정된다R 또는 형광 분석기. 이러한 높은 처리 절차는 공간적으로 분리 된 사이트 또는 생태계 간의 비교를 용이하게, 또한 실질적으로 샘플 당 필요한 시약 전체적인 부피를 감소시킴으로써 그러한 분석법의 비용을 줄일뿐만 아니라.
Introduction
박테리아 및 곰팡이 등의 미생물 세포 효소의 생산을 통해 복잡한 유기 화합물의 영양분과 탄소를 얻을 수 있습니다. 이러한 효소는 전형적 셀로 취할 수 작은 소단위로 중합체를 가수 분해한다. 따라서, 생태 학적 수준에서, 이러한 미생물의 세포 외 효소는 영양 광물 및 자연 환경에서 발생하는 유기물 분해의 대부분에 대한 책임이 있습니다. 이러한 cellobiohydrolase (CBH) 및 β-글루코시다 제 등의 효소는 미생물의 흡수와 동화에 대한 utilizable 탄소 기판을 제공 1,2 포도당 셀룰로오스의 가수 분해를 촉진하기 위해 한마음으로 셀룰로오스 분해 작업을 위해 중요하다. 효소 포스는 유기 인계에서 수용성 무기 인산염 그룹, 기본적으로 인산염 광물 화하고 대부분의 생물 3에서 사용할 수있게 만들을 출시. 이러한 N-acetylglucosaminidase (나가세)와 같은 다른 효소는 importan 아르키틴 분해에 t, 탄소 및 미생물 인수 4에 해당하는 질소의 양을 만들 수 있습니다.
자연 환경에서 미생물의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 절차 중 하나는 인공 P-니트로 페닐 (p의 NP) 연결된 기판 원래 토양 오 포스 파타 아제 활성을 검출하기 위해 개발 된 방법의 사용이다. 이 방법은 인공 기판이 해당 효소에 의해 가수 분해 될 때 방출되는 컬러 최종 제품, P-니트로 페놀의 검출에 의존한다. P-니트로 페놀은 이후 약 400 ~ 410 nm에서 흡광도를 측정하여 색도계로 정량화 할 수있다. 이 방법은 시간과 같은 나가세 6와 같은 다른 효소를 검출하도록 적용되고 있으며, 토양 및 퇴적물 7-9 미생물 세포 외 효소 활성을 찾고 다양한 연구에 사용되었다.
originall의 있었다 다른 방법Y는 10,11 4 – 메틸 움 (MUB) 연결된 기판을 이용한다 수중 환경에서 세포 글루코시다 제 활성을 평가하기 위해 개발 하였다. (4 – 메틸 움) 릴리스 최종 생성물은 높은 형광이며 460분의 360 nm의 주변의 여진 / 배출 설정으로 형광 분석기를 사용하여 검출 될 수있다. MUB 연결된 인공 기판의 다양한 P는 NP-기판 비색 절차를 사용하여 정량 할 수있는 이상으로 많은 효소 (예 : β-글루코시다 아제, cellobiohydrolase, 나가세, 인산 가수 분해 효소)의 활동의 형광 측정을 허용, 사용할 수 있습니다. 이러한 단백질 분해 로이신 아미노 펩 티다 제와 같은 기타 미생물 세포 외 효소, 7 – 아미노 -4 – 메틸 쿠마린 (COU) 연결된 기판을 사용 fluorometrically 정량 할 수있다. MUB과 커플 연결 기판은 모두 다양한 육상 및 수생 샘플 (12, 13)의 효소 활성을 결정하는 데 사용되었다.
이전의 연구는 descr가있는 반면IBED 형광 또는 비색 마이크로 플레이트는 세포 외 효소 활성 (14)을 결정하기 위하여 접근 등의 분석을 수행하는 방법에 대한 명확한 프리젠 테이션에 대한 필요성이있다. 여기서 우리는 비색 P의 NP-결합 기판 방식을 사용하여 토양과 퇴적물 및 형광 MUB 연결된 기판 기술을 사용하여 자연수의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 높은 처리량의 마이크로 기술을 수행하기위한 절차를 보여준다. 이 효소는 각각 탄소, 질소 및 인 순환에 연결 될 수있는 우리는 β-글루코시다 아제, 나가세, 및 포스 파타 아제의 활동의 측정에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, 여기에 기재된 절차는 서로 다른 인공 기질을 사용하는 다른 세포 외 효소의 측정에 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
토양과 퇴적물에있는 미생물의 세포 외 다양한 효소의 활동을 결정하는 것은 영양 광물 및 유기물 처리 17의 속도로 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 토양은 수분 수준이 다를 수 있으므로 토양 건조 중량으로 활동을 표준화하는 것이 중요합니다. 이것은 단순히 효소 활성을 측정 넘어 (전형적 이틀) 추가로 건조 공정을 필요로한다. 따라서, 즉각적인 결과를 제공하는 근처에…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품의 측면에 대한 자금 조달은 미국 농무부 구체적인 협력 계약 58-6408-1-595과 국립 과학 재단 (상 1049911)를 포함하여 다양한 소스에 의해 제공되었다.
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
Riferimenti
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