Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em> In Situ</em> La hibridación en<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Las figuras 1 y 2 son diagramas esquemáticos de los procedimientos experimentales FISH y análisis de imagen de tuberías utilizada para la cuantificación FISH imágenes. 1. Soluciones de prepararse * Las soluciones a continuación son para uso con sondas Singer. Si el uso de sondas de Stellaris, sustitúyase "40% de formamida" por "10% de formamida" tanto en tampón de hibridación y la solución de lavado. Cambios adicionales en tampón de hibridación al utilizar sondas Stellaris son (1) añadir 1 g de sulfato de dextrano y (2) no incluyen 10 mg ssDNA. Tampón B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1 M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Buffer spheroplasting 890 l Tampón B 100 l VRC 10 l 25000 U / ml de liticasa 2 l β-mercaptoetanol <fuerte> tampón de hibridación (10 ml, volumen final) 10 mg E. coli tRNA 10 mg de DNA de cadena simple * 100 l 200 mM de stock VRC 40 l de 50 mg / ml de BSA 1 ml de SSC 20X 4 ml de formamida al 40% * Nucleasa libre de agua (hasta 10 ml de volumen final) 1 g de sulfato de dextrano * * Tampón de Hibridación puede mantenerse en alícuotas de 0,5 ml a -20 ° C para la conveniencia. Tampón de lavado (50 ml, volumen final) 5 ml de SSC 20X 20 ml de formamida al 40% * Nucleasa libre de agua (50 ml de volumen final) Etiquetado Buffer 1,06 g de carbonato sódico 100 ml de agua DEPC pH 9 2. Probe-etiquetado (sondas Singer solamente) Obtenemos estas sondas mediante síntesis en la casa usando un aparato de síntesis de oligonucleótidos ABI. Typicaliado, 4-5 ~ 50 bp oligonucleótidos son sintetizados que son homólogas al gen de interés, sustituyendo timidina amino-alilo durante varios thymidines espaciadas al menos 8, preferiblemente 10 + pb aparte. Debido a su sensibilidad al ozono, se trabaja en una instalación libre de ozono cuando se utilizan colorantes CY. Obtener ~ 5 sondas y resuspender en 100 l de agua – las concentraciones de verificación en Nanodrop. Dependiendo del número de sondas / genes, combine total de 10 oligonucleótidos mg / gen (por ejemplo, si se 5 / sondas de genes, entonces quiero 2 mg / sonda). Utilice columnas QIAquick para purificar sondas según QIAquick nucleótidos Protocolo kit de retiro. Añadir 10 volúmenes de tampón de PN con el total de volumen de sondas combinadas y mezclar. Aplicar la muestra a la columna QIAquick – si el volumen total es mayor que 750 l, girar hacia abajo dos veces utilizando la mitad del volumen en cada giro Deje reposar durante 1 min. Centrifugar 1 min a 6000 rpm. Lavar con 750 l PE Buffer. Centrifugar1 min a 6000 rpm. Eliminar el flujo a través de la columna y re-giro durante 1 min a 13000 rpm para secar. Columna QIAquick Place en tubo nuevo de microcentrífuga y el ADN se eluye con 50 l H 2 O – Asegúrese de H 2 O pH está dentro de 7,0 y 8,5 y se coloca directamente sobre la membrana. Deje reposar durante 1 min. Centrifugar durante 1 min a 13.000 rpm para eluir el ADN. Liofilizar ADN a 45 ° C. Resuspender el precipitado en 10 l buffer de etiquetado y añadir al tubo de tinte sin tocar el tinte. Repita con el otro buffer etiquetado 10 l. Vortex y centrifugar tubos de tinte y ADN. Cubra los tubos con papel de aluminio y guardar en la oscuridad a RT O / N para etiquetar. Repita QIAquick nucleótidos Protocolo kit de retiro. Realizar con dos diferencias: – Añadir 200 l de tampón PN sondas y poner sondas marcadas a través de columnas de 2x. – Realizar 3 lavados con tampón PE con el fin de eliminar cualquier tinte no unido antes de la elución. After elución obtener la concentración a través de nanogota. El etiquetado de eficiencia es típicamente ~ 0,25 pmol / ng de ADN de una sola hebra. 3. Coverslip Preparación Coloque los cubreobjetos en los portaobjetos en plasma-acicalarse cámara de vacío ( http://www.plasmapreen.com/ ) (cuanto más cerca del centro de la mejor). Coloque la cámara de vacío en el microondas y asegúrese de que está sellado. Encienda la bomba primero y luego gire en vacío de una sola vez de la bomba se pone en marcha. Encienda el horno de microondas, y dejar 5 segundos después plasma es visible. Apague la bomba de vacío a continuación. Saque la cámara de vacío y retirar cubreobjetos con unas pinzas (aquellos que han caído necesita ser limpiado de nuevo). Lugar cubreobjetos lado limpiado en placas de 12 pocillos. 4. Procedimiento Fijación Crecer levadura a un OD 600 de aproximadamente 0,1-0,2 en medio mínimo. 10 ml de células produce suficiente FOr ~ 10 hibridaciones separadas. Añada 1/10 del volumen 37% de formaldehído directamente a los medios de cultivo (10 ml de cultivo + 1 ml de formaldehído al 37%) y dejar reposar durante 45 min. Lavar 2x con hielo 1 ml de tampón B frío en un tubo de microcentrífuga (puede girar a 13.000 rpm durante 1 min). Añadir 1 ml de tampón spheroplasting. Incubar a 37 ° C durante 15 min. Compruebe células cada pocos minutos bajo microscopio hasta la mayoría de las células son de color negro (es decir, no la eliminación brillante). Lavar 2x con tampón enfriado con hielo B, girando a baja velocidad (~ 3500 rpm). Añadir 1 ml de EtOH al 70%, resuspender suavemente y dejar toda la noche a 4 ° C (se puede almacenar indefinidamente a -20 ° C). 5. Procedimiento de hibridación Preparar la solución de hibridación: a 100 l de tampón de hibridación, agregue 1-3 l de la sonda, luego vortex y centrifugar. Cantante utilizan sondas 8-10 ng totales por sonda conjunto (es decir, por gen). Hemos fotografiado hasta 3 genes simultáneamente con 3 diferentessonda marcada rente fija. Asegúrese de calentar la solución de hibridación a temperatura ambiente antes de abrirlo. Para sondas Stellaris, se recomienda empezar 4 reacciones de hibridación independientes mediante la adición de 1 l cada uno de 1:10, 1:20, 1:50 y 1:100 diluciones de trabajo de las sondas para ver cuál es el óptimo. Diluciones de trabajo de sondas Stellaris se preparan en tampón de hibridación. Se centrifuga (para todos los pasos posteriores; 3.500 rpm, 5 min) las células fijadas (por ejemplo, 200 l) y aspirar lejos del etanol. Resuspender suavemente en 1 ml de tampón de lavado que contiene el mismo porcentaje de formamida como el tampón de hibridación. Deje reposar durante 2-5 min. Centrifugar la muestra y el tampón de lavado aspirado, a continuación, añadir solución de hibridación. Incubar en la oscuridad con agitación suave, O / N a 37 ° C. Nota: El siguiente procedimiento es para la aplicación de células / imagen en cubreobjetos. Para wincineración / células de formación de imágenes en placas de 96 pocillos, incluyendo el oxígeno solución de eliminador de especies reactivas alternativa ver http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols. Al día siguiente, o antes, limpio (ver procedimiento) y tratar cubreobjetos con 150 l 0,01% de poli-L-lisina durante 5 min. Aspirar, dejar secar, lavar 3 veces con H2O destilada y dejar secar. En la mañana, añadir 1 ml de tampón de lavado a la muestra, resuspender suavemente, centrífuga y aspirar, a continuación, volver a suspender en otro 1 ml de tampón de lavado y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Lavar con 2 x SSC + 0,1% de Triton X-100 a TA 15 min en un agitador. Tome medio de montaje fuera del congelador para permitir que suba a temperatura ambiente antes de montar. Lavar con 1X SSC a TA 15 min en un agitador. Diluir DAPI en PBS (0,1 mg / ml final) y volver a suspender las células en 150 l. Solución Place a limpiar / poli-lys-treacubre-ted en placa de 12 pocillos, al menos 30 minutos sin ser molestados. Retire la solución (es posible colocarlo en una hoja de cubierta de repuesto como copia de seguridad) y se lava 3 veces con 1 ml de 1X PBS. Coloque 3 l de prolongar medio de montaje del oro en un portaobjetos (Invitrogen P36934). Para ello, uno a la vez si tiene varias hojas de la cubierta para evitar la desecación del medio de montaje. Agregar ~ 0,5 ml de etanol al cubreobjetos en placas de 12 pocillos, retire la hoja de la cubierta y el aire seco, mientras que la celebración de unas pinzas. Coloque cubrir deslizamiento celular del lado hacia abajo en medio de montaje y dejar endurecer varias horas o O / N en la oscuridad. Selle los bordes con esmalte de uñas y proceder a la creación de imágenes. 6. Obtención de imágenes de células con Olympus IX-81 microscopio invertido general Para la adquisición de imágenes utilizamos software Slidebook (inteligente imaging.com) y un 1,45 NA, aceite objetivo TIRFM 100X. Para GFP serie, DAPI, Cy3, Cy5 y Cy3.5 imagen: conjuntos de filtros Chroma (ver reactivos). Utilice el filtro de DAPIpara encontrar y centrarse células. Establezca este como punto de referencia. Tome un z-stack de imágenes alrededor del punto de referencia donde la distancia total es de 5 m con 0,2 mM tamaño (25 aviones). Repita el procedimiento para cada canal de colorante (es decir, cada sonda conjunto). Exportar como TIFF de 16 bits para el análisis de imágenes. 7. Resumen Análisis de Imágenes (sondas Singer) A continuación ofrecemos un resumen de los métodos de cálculo que utilizamos para el análisis de imágenes de peces en MATLAB. Las funciones de MATLAB relevantes utilizadas están entre corchetes a la derecha. Los algoritmos y los umbrales están sintonizados para los datos de las sondas de estilo Singer. Uso de sondas de estilo Stellaris serán necesarios algunos ajustes, en particular a la etapa de filtración final (7,8). Identificación teléfono 15 Separar las células del fondo utilizando un umbral global sobre DAPI imágenes 16 [graythresh]. Identificar núcleos mediante la función maxima extendida [imextendedmax]. Células segmento utilizando núcleos como semillas para un algoritmo de cuenca [cuenca]. Encuentra puntos de interés en cada canal de fluorescencia Lleve a cabo la transformación tophat para normalizar fondo y mejorar la relación señal-ruido [bwmorph]. Encontrar máximos para identificar la capa de enfoque (en el plano z) para cada punto de [imregionalmax]. Filtrar lugares potenciales utilizando un modelo de ajuste lineal a un gradiente radial. Intensidad punto de medición y señales de la sonda mono contra poli filtro Ajustar un perfil gaussiano 2D al lugar en la capa de enfoque previamente identificados y la intensidad estimación 17. Filtrar los puntos débiles utilizando un umbral (basado en histograma). Para sondas tipo Singer esto es importante, pero lo es menos para las sondas de Stellaris. Contar puntos en cada celda.