Visualizzazione e l'analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em> In Situ</em> Ibridazione in<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Le figure 1 e 2 sono schemi delle procedure sperimentali pesce e gasdotti analisi dell'immagine utilizzata per quantificare le immagini FISH. 1. Soluzioni per preparare * Le seguenti soluzioni sono per l'uso di sonde Singer. Se si utilizza sonde Stellaris, sostituire "40% formammide" con "10% formammide" sia in tampone di ibridazione e di tampone di lavaggio. Ulteriori modifiche alla Tampone di Ibridazione quando utilizzano sonde Stellaris sono (1) Aggiungere 1 g di solfato di destrano e (2) non includono 10 mg ssDNA. Buffer B 8 ml di 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g di sorbitolo Buffer Spheroplasting 890 microlitri di buffer B VRC 100 microlitri 10 microlitri di 25.000 U / ml liticasi 2 microlitri β-mercaptoetanolo <strong> Tampone di ibridazione (10 ml, volume finale) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 microlitri 200 mM VRC magazzino 40 pl di 50 mg / ml di BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% formammide * Nucleasi Free Water (a 10 ml di volume finale) 1 g di solfato di destrano * * Tampone di ibridazione può essere conservato in aliquote da 0,5 ml a -20 ° C per convenienza. Tampone di lavaggio (50 ml, volume finale) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% formammide * Nucleasi Free Water (a 50 ml di volume finale) Etichettatura Buffer 1,06 g di carbonato di sodio 100 ml di acqua DEPC pH 9 2. Probe-etichettatura (Probes Singer soltanto) Otteniamo queste sonde per sintesi in-house usando un apparato di sintesi oligonucleotidi ABI. Typically, 4-5 ~ 50 bp oligonucleotidi sono sintetizzati che sono omologhi al gene di interesse, sostituendo timidina ammino-allil per diversi thymidines distanziati di almeno 8, preferibilmente + 10 bp a parte. A causa della loro sensibilità all'ozono, lavoriamo in un impianto produce ozono durante l'uso CY coloranti. Ottenere ~ 5 sonde e risospendere in 100 microlitri di acqua – le concentrazioni di controllo su Nanodrop. Seconda del numero di sonde / gene, unire totale di 10 mcg / oligonucleotidi gene (ad esempio, se sono 5 sonde / gene, poi vogliono 2 mcg / sonda). Utilizzare le colonne QIAquick per purificare le sonde secondo QIAquick Nucleotide Kit Rimozione protocollo. Aggiungere 10 volumi di tampone di PN al volume di sonde combinate e mix totale. Applicare il campione di colonna QIAquick – se il volume totale è superiore a 750 ml, centrifugare due volte utilizzando la metà del volume in ogni giro Lasciate riposare per 1 min. Centrifugare 1 min a 6.000 giri. Lavare con 750 microlitri di buffer PE. Centrifugare1 min a 6.000 giri. Smaltire flusso attraverso colonna e re-spin per 1 min a 13.000 rpm per asciugare. Luogo colonna QIAquick in nuova provetta e DNA eluire con 50 ml H 2 O – Assicurarsi H 2 O pH è all'interno di 7.0 e 8.5 ed è posto direttamente sulla membrana. Lasciate riposare per 1 min. Centrifugare per 1 min a 13.000 rpm per eluire il DNA. Lyophilize DNA a 45 ° C. Risospendere il pellet in 10 microlitri di buffer di etichettatura e aggiungere al tubo di tintura senza toccare il colorante. Ripetere con un altro tampone di 10 microlitri di etichettatura. Vortex e spin down tubo di tintura e di DNA. Coprire le provette con un foglio di alluminio e conservare al buio a RT O / N di etichettare. Ripetere QIAquick Nucleotide Kit Rimozione protocollo. Eseguire con due differenze: – Aggiungere 200 microlitri di buffer PN alle sonde e mettere sonde marcate attraverso le colonne 2x. – Effettuare 3 lavaggi con tampone PE al fine di lavare via il colorante senza legami prima eluizione. After eluizione ottenere la concentrazione tramite NanoDrop. L'efficienza di etichettatura è tipicamente ~ 0.25 pmol / ng di DNA a singolo filamento. 3. Coverslip Preparazione Luogo coprioggetto su diapositive in plasma-preen camera a vuoto ( http://www.plasmapreen.com/ ) (il più vicino al centro è il migliore). Mettere in forno a camera a vuoto e assicurarsi che sia sigillato. Accendere pompa prima quindi accendere vuoto solo una volta pompa viene avviata. Accendere il forno a microonde, e smettere di 5 sec dopo plasma è visibile. Spegnere vuoto poi pompare. Estrarre camera a vuoto e rimuovere coprioggetto con una pinza (quelli che sono caduti devono essere puliti di nuovo). Luogo Coprivetrini lato ripulito in piastre da 12 pozzetti. 4. Procedura di fissazione Crescere lievito per un OD 600 di circa 0,1-0,2 in terreno minimo. 10 ml di cellule produce abbastanza for ~ 10 ibridazioni separati. Aggiungere 1/10 di volume 37% di formaldeide direttamente ai mezzi di crescita (10 ml di coltura + 1 ml di 37% di formaldeide) e lasciate riposare per 45 min. Lavare 2 volte con 1 ml di ghiaccio freddo tampone B in una provetta (può girare a 13.000 rpm per 1 min). Aggiungere 1 ml di tampone spheroplasting. Incubare a 37 ° C per 15 min. Controllare le celle ogni pochi minuti sotto il microscopio fino maggior parte delle cellule sono di colore nero (cioè non di fase luminosa). Lavare 2 volte con ghiaccio freddo tampone B, la filatura a bassa velocità (~ 3.500 giri). Aggiungere 1 ml di EtOH 70%, risospendere delicatamente e lasciare per una notte a 4 ° C (può immagazzinare indefinitamente a -20 ° C). 5. Procedura di ibridazione Preparare la soluzione di ibridazione: a 100 l di tampone di ibridazione, aggiungere 1-3 ml di sonda, poi vortice e centrifuga. Sonde Singer usano 8-10 ng totale per set sonda (cioè per ogni gene). Abbiamo ripreso fino a 3 geni simultaneamente con 3 difrenti sonda marcata imposta. Assicurati di riscaldare la soluzione di ibridazione a temperatura ambiente prima di aprirlo. Per le sonde Stellaris, si consiglia di iniziare a 4 reazioni di ibridazione separati con l'aggiunta di 1 ml ciascuna di 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100 diluizioni di lavoro di sonde per vedere quale è ottimale. Diluizioni di lavoro di sonde Stellaris sono preparate in tampone di ibridazione. Centrifuga (per tutti i passi successivi; 3.500 giri; 5 min) le cellule fisse (ad esempio 200 ml) e aspirare via l'etanolo. Risospendere delicatamente in 1 ml di tampone di lavaggio che contiene la stessa percentuale di formammide come tampone di ibridazione. Lasciate riposare per 2-5 min. Centrifugare campione e tampone di lavaggio aspirato, quindi aggiungere la soluzione di ibridazione. Incubare al buio con un leggero scuotimento, O / N a 37 ° C. Nota: la seguente procedura è valida per l'applicazione di cellule / di imaging su vetrini. Per wincenerimento / cellule di imaging in piastre a 96 pozzetti, tra cui soluzione alternativa al tesoro specie reattive dell'ossigeno vedere http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols. Il giorno dopo, o in anticipo, pulito (vedi procedura) e il trattamento di vetrini con 150 ml 0.01% Poli-L-lisina per 5 min. Aspirare, lasciate asciugare, lavare 3 volte con dH 2 O e lasciare asciugare. In mattinata, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio per il campione, risospendere delicatamente, centrifuga e aspirare, poi risospendere in un altro 1 ml di tampone di lavaggio e incubare a 37 ° C per 30 min. Lavare con SSC 2X + 0,1% Triton X-100 a RT 15 minuti su agitatore. Prendete mezzo di montaggio dal freezer per permettergli di venire a RT prima del montaggio. Lavare con 1X SSC a temperatura ambiente 15 minuti su agitatore. Diluire DAPI in PBS (0,1 mcg / ml finale) e risospendere le cellule in 150 microlitri. Luogo soluzione sulla pulizia / poli-lys-treated vetrini a 12-pozzetti; almeno 30 min indisturbati. Rimuovere la soluzione (si può metterlo su un vetrino di ricambio come backup) e lavare 3 volte con 1 ml di PBS 1X. Mettere 3 ml di prolungare oro mezzo di montaggio su un vetrino (Invitrogen P36934). Fate questo uno alla volta se si dispone di più vetrini per evitare l'essiccamento del mezzo di montaggio. Aggiungi ~ 0,5 ml di etanolo al coprioggetto a 12-pozzetti, rimuovere il vetrino e l'aria secca mentre si tiene con una pinzetta. Posizionare coprire cellula-side scivolare giù sul mezzo di montaggio e lasciare indurire diverse ore o O / N nel buio. Sigillare i bordi con smalto e procedere con l'imaging. 6. Imaging di cellule con Olympus IX-81 invertito Microscopio Panoramica Per l'acquisizione delle immagini che utilizziamo Slidebook (intelligente-imaging.com) software e una, 1,45 NA, obiettivo olio TIRFM 100X. Per GFP seriale, DAPI, Cy3, Cy3.5 e Cy5 di imaging: set di filtri Chroma (vedi reagenti). Usa filtro DAPIdi trovare e mettere a fuoco le cellule. Impostare questo come punto di riferimento. Prendete un z-pila di immagini di tutto il punto di riferimento in cui la distanza totale è di 5 micron di dimensione 0,2 micron (25 aerei). Ripetere l'operazione per ogni canale colorante (cioè insieme ogni sonda). Esportare come TIFF a 16 bit per l'analisi delle immagini. 7. Image Analysis Panoramica (Probes Singer) Di seguito forniamo una descrizione dei metodi di calcolo che usiamo per analizzare le immagini FISH in MATLAB. Le funzioni MATLAB rilevanti utilizzati sono bracketing sulla destra. Gli algoritmi e le soglie sono attualmente messi a punto per i dati provenienti da sonde di stile Singer. Utilizzando sonde stile Stellaris richiederà qualche aggiustamento, in particolare alla fase di filtraggio finale (7.8). Cella di identificazione 15 Celle separate da sfondo utilizzando una soglia globale su DAPI immagini 16 [graythresh]. Identificare nuclei utilizzando la funzione maxima esteso [imextendedmax]. Cellule del segmento con il nucleo come i semi per un algoritmo spartiacque [spartiacque]. Trova località in ogni canale di fluorescenza Eseguire la trasformazione tophat per normalizzare sfondo e migliorare il rapporto segnale-rumore [bwmorph]. Trovare maxima per identificare lo strato a fuoco (nel piano z) per ciascuna macchia [imregionalmax]. Filtra i potenziali punti utilizzando un modello di regressione lineare di una sfumatura radiale. Intensità macchia Misurare e filtrare i segnali singoli vs multipla della sonda Montare un profilo gaussiano 2D al posto nello strato a fuoco precedentemente identificate e l'intensità stima 17. Filtrare i punti deboli che utilizzano una soglia (basata su istogramma). Per le sonde di tipo Singer questo è importante, ma lo è meno per sonde Stellaris. Contare i punti in ogni cella.