Peptide-gebaseerde identificatie van functionele Motieven en hun bindingspartners

Met de komst van de anti-retrovirale therapie, is de aids-epidemie in de westerse wereld is vertraagd, maar niet beperkt, en de verspreiding van HIV blijft een belangrijk gezondheidsprobleem last over de hele wereld. Met uitzondering van de weinig effectieve RV144 Thai onderzoek kregen HIV vaccins tot dusver geen bescherming tegen infectie. Zo is het onderzoek naar aanvullende, potentiële therapeutische doelen nog steeds gerechtvaardigd.

Naast CD4 T-cel depletie, persistente gegeneraliseerde immune activering is een kenmerk van HIV-infectie. Dit Chronische Immune Activering (CIA) leidt tot een verhoogde celvernieuwing, geactiveerd en gedifferentieerd lymfatische subpopulaties, cellulaire uitputting en veroudering, en het doden van T-cellen en B-cellen via Activering-geïnduceerde celdood (AICD) ^1,2,3, en het is goed gevestigd als een van de sterkste voorspellers van progressie van de ziekte ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12.} Echter, de onderliggende mechanismen CIA en CD4T-celdepletie in HIV-infecties niet volledig opgehelderd.

Bewijs uit ons lab en anderen leidde ons naar een model voor de progressie van de ziekte (figuur 1) waarin de HIV-eiwit Nef (Negative Regulatory Factor) induceert de afscheiding in exosomes van HIV-1 geïnfecteerde cellen ^13,14. Deze Nef-bevattende exosomes (exNef) induceren apoptose in een aantal cellijnen waaronder geïnfecteerde CD4 T-cellen ^15,16. Als alternatief, in monocyten / macrofagen exNef verandert genexpressie patronen, bijv. cytokine-expressie, en lijkt een toestand van ongepland activering van het immuunsysteem veroorzaken. Deze hoeveelheid bewijs suggereert een belangrijke rol voor exNef in CIA en CD4 T-cel depletie.

Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan het vermogen van Nef's te manipuleren de exosomaal mensenhandel route zal nuttig zijn in engineering nieuwe remmers van exNef secretie. Remming van exNef secretie de CD4 T-cel depletie verminderenen de CIA dat station HIV / AIDS pathogenese.

Om het bewijs dat leidde tot ons model voor HIV / AIDS progressie van de ziekte en de daaropvolgende data die bouwde op dit model te verzamelen, hebben we een aantal nieuwe reagentia en methoden die liet ons toe om de genetica van exNef secretie analyseren ontwikkeld, en beginnen aan het bepalen cellulaire proteïnen betrokken. In het eerste werk, we vonden dat Nef proteïne induceert apoptose in cellen omstanders en extracellulair vrij van Nef-getransfecteerde en HIV-geïnfecteerde cellen ^15. Peptiden afgeleid van SDF-1α (stromale cel afgeleide factor-1, met alternatieve splicing alpha) was eerder aangetoond dat veel van de binding en signalerende activiteit van het volledige-lengte molecule ¹⁷ behouden. We speculeerden dat peptiden Nef enkele van de apoptotische activiteit van het volledige eiwit en dat deze peptiden zouden nood Nef apoptotische domein (en) bevatten kunnen behouden. Om deze peptiden te identificeren en dus de Nefapoptotische domein (en), verkregen we een set van 20 HIV-1 Nef scannen peptiden van de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Deze 20-aa peptiden, elk overlappend 10 aminozuren van zijn buur, worden genoemd door het aantal van hun laatste aminozuur, dwz N20 overspanningen Nef aminozuren 1-20, N30 overspanningen Nef aminozuren 11-30, etc ^16. We vonden dat het blootstellen van T-cellen extracellulair specifieke peptiden overlappen twee afzonderlijke 10-aa domeinen in de full-length Nef proteïne geïnduceerde apoptose in deze cellen. Daaropvolgende analyse van deze Nef-apoptotische afgeleide peptiden bleek hun vermogen om fysiek interactie met de chemokine receptor CXCR4 op het oppervlak van T-cellen, met bindingskinetiek die mogen deze peptiden om competitief binding te remmen tussen CXCR4 en natuurlijke ligand SDF-1α. Tenslotte, de Nef-afgeleide apoptotische peptiden interactie CXCR4 bleek een stressrespons in deze T-cellen leidt tot apoptose. Dit bewijsmateriaal liet ons toe om quicfunctionele domeinen kly kaart Nef's, een proces dat veel langer zou hebben genomen met behulp van standaard DNA-mutagene technieken zoals alaninescanningsmutagenese. Het toonde ook aan dat deze korte Nef-peptiden behouden de biologische functie van de apoptotische domeinen in het eiwit van volledige lengte.

Na een rol voor extracellulair Nef geïdentificeerd, dwz apoptose van T-cellen, zochten we een beter begrip van hoe Nef werd afgescheiden uit cellen. Met een reeks gemuteerde Nef constructen toonden we zeer geconserveerde motieven Nef eiwit in de N-terminale gebieden van zowel HIV Nef en de Rhesus macaque equivalente _mac SIV (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, die essentieel zijn voor exNef afscheiding ^13. Een van deze motieven, de Afscheiding Modification Gewest (SMR; 66VGFPV70), was bijzonder kritisch, zoals alanine vervanging van een van haar vijf aminozuren ofwel sterk verminderd of afgeschaft exNef secretie. Bij aflevering aan cellen via Active Motif's CHariot Protein Delivery Reagent, een peptide dat de SMR aan een FLAG-peptide sequentie (SMRwt) bleek exNef secretie remmen van zowel Nef-getransfecteerde en HIV-geïnfecteerde cellen ^18. Op basis van onze eerdere ervaringen met peptiden, hebben we besloten om dit peptide te gebruiken om de moleculen en mechanismen die ten grondslag liggen aan de rol van de Nef SMR's in exNef secretie verhelderen.

Met behulp van de SMRwt peptide als onze "lokaas eiwit", we co-immunogeprecipiteerd cellulaire binding partners van de SMR uit niet-geïnfecteerde T-cellysaten ^18. De FLAG-peptide sequentie voorzien van een handig handvat voor het vastleggen van de SMRwt peptide met behulp van anti-FLAG affiniteitshars. Onze eerdere bevinding dat een enkele valine naar alanine mutatie in het SMRwt peptide was voldoende voor de afschaffing van de remming van exNef secretie identificeerde een handige, zeer specifieke controle peptide (SMRmut) die we gebruikten om uit te sluiten co-geïmmunoprecipiteerde eiwitten niet specifiek voor de SMR. Gebruik van een peptide met de specifiek domein plaats dan de full-length eiwit konden we de screening van tientallen cellulaire factoren die binden aan andere domeinen Nef ¹⁹ omzeilen.

Eens we de SMR-bindende partners, een logische stap was aan te tonen dat de geïdentificeerde cellulaire bindende partners zijn belangrijk voor de biologische functie ^18. De standaardprocedure om dit te bereiken is het knockdown eiwitniveaus met doeleiwit-specifieke miRNA en siRNA en vervolgens assay het effect op de biologische functie. We voerden miRNA knockdown, die translatie van het doelwit-mRNA remt waardoor productie van dit doel, in dit geval een SMR-bindend eiwit. Deze vermindering van het doeleiwit is een indirect effect, en heeft eventueel een vertraagd effect op de biologische functie het doelgericht eiwit speelt een rol in Daarom hebben we ook de minder voorkomende antilichaam remming techniek gebruikt om te bepalen of direct verstoren van de activiteit vanhet doeleiwit beperkte of geen biologische functie. In deze werkwijze worden antilichamen opgewekt tegen het doelwit eiwit getransfecteerd in de cel met behulp Chariot Reagent en rechtstreeks met het doeleiwit of afzonderen uit de plaats van de functie, of de relevante bindende domein blokkeren. Remming van het doelwit eiwit via deze procedure rechtstreeks verstoort zijn functie, en kan RNA knockdown procedures aan te vullen met verdere bevestiging van het belang van het doelwit eiwit naar de biologische functie.

Terwijl Chariot Reagens effectief in het leveren van peptiden en eiwitten in cellen, een proces is tijdrovend en beperkt de aard van de dierproeven, bijvoorbeeld langdurige of herhaalde blootstelling en in vivo dierstudies die kunnen worden uitgevoerd. Daarom hebben we een cel-penetrerende peptide (CPP) die toegevoegd is aan de SMRwt peptide (SMRwt-CPP) ¹⁸ een peptide die kunnen worden overgenomen door cellen passief producerenuit het kweekmedium. Deze versie was even werkzaam als de eerste bij het remmen exNef secretie.

Het bewijs uit de gepubliceerde experimenten toont het vermogen van kleine peptiden die specifieke functionele motieven voor de functie van het eiwit van volledige lengte antagoniseren door competitieve remming, en de eiwitten die deze motieven binden te isoleren. Men zou verwachten dat deze technieken moet nuttig in vele experimentele protocollen. Zij moeten ook effectief in engineering nieuwe peptide remmers van vele cellulaire processen, een functie die kan verder worden verbeterd door binding aan CPP sequenties.