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Biologia

Danio rerio उपयोग कर रुग्ण ह्यूमन जीनोम की विवो मॉडलिंग में

Published: August 24, 2013
doi:
10.3791/50338
, , , , ,
1Center for Human Disease Modeling, Department of Cell Biology,Duke University Medical Center, 2Department of Evolutionary Anthropology,Duke University, 3Department of Pediatrics,Duke University Medical Center

Summary

यहाँ, हम विकास के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण पेश physiologically प्रासंगिक, संवेदनशील और विशिष्ट<em> Vivo में</em> मानव विकृति में बदलाव की व्याख्या के लिए assays. WT और उत्परिवर्ती मानव mRNA और morpholino (एमओ) antisense oligonucleotides के microinjection के माध्यम से क्षणिक आनुवंशिक हेरफेर मानव विकासात्मक विकारों के संदर्भ में विशेष रूप से तेजी से परख रोगजनक विशेष रूप से परिवर्तन, लेकिन नहीं, करने के लिए विकासशील zebrafish भ्रूण की शिक्षणीयता दोहन.

Abstract

यहाँ, हम zebrafish में विवो पूरक में उपयोग कर संभावित चिकित्सकीय महत्वपूर्ण nonsynonymous परिवर्तन क्वेरी के लिए assays के विकास के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं. Zebrafish (Danio rerio) उनकी प्रयोगात्मक शिक्षणीयता के कारण एक उपयोगी पशु व्यवस्था कर रहे हैं, भ्रूण, सतही देखने सक्षम तेजी से विकास के पूर्व vivo गुजरना करने के लिए पारदर्शी होते हैं, और आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ कर सकते हैं इन पहलुओं embryogenesis के विश्लेषण में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए अनुमति दी है 1. आणविक प्रक्रियाओं, और morphogenetic संकेतन. साथ में ले ली, इस हड्डीवाला मॉडल के फायदे बाल रोग में विकास संबंधी दोषों मॉडलिंग के लिए zebrafish के अत्यधिक उत्तरदायी बनाने, और कुछ मामलों में, वयस्क शुरुआत विकारों. Zebrafish जीनोम अत्यधिक मनुष्य (orthologous ~ 70%) के साथ कि संरक्षित है, क्योंकि यह zebrafish में मानव रोग राज्यों पुनरावृत्ति करना संभव है. इस उत्परिवर्ती मानव मीटर के इंजेक्शन के माध्यम से या तो पूरा हो रहा हैनकारात्मक प्रमुख या समारोह alleles के लाभ, या समारोह वेरिएंट के नुकसान की नकल करने के लिए जीन को दबाने के लिए morpholino (एमओ) antisense oligonucleotides के उपयोग को प्रेरित करने के लिए शाही सेना. छाया मानव mRNA के साथ एमओ प्रेरित phenotypes के पूरक के माध्यम से, हमारे दृष्टिकोण एक औसत दर्जे का, physiologically प्रासंगिक phenotype के बचाव के लिए उत्परिवर्ती mRNA की क्षमता के आधार पर मानव प्रोटीन अनुक्रम में परिवर्तन के हानिकारक प्रभाव की व्याख्या के लिए सक्षम बनाता है. मानव रोग alleles की मॉडलिंग एमओ और / या 1-4 सेल स्तर पर मानव mRNA, और सात दिन बाद निषेचन (DPF) तक phenotyping साथ zebrafish भ्रूण की microinjection के माध्यम से होता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के रूप में यह सामान्य रणनीति, रोग phenotypes की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बढ़ाया जा सकता है. हम morphogenetic संकेतन, craniofacial, हृदय, संवहनी अखंडता, गुर्दे समारोह, और कंकाल की मांसपेशी विकार phenotypes की है, साथ ही दूसरों के लिए हमारे स्थापित मॉडल प्रस्तुत करते हैं.

Introduction

एक जीनोटाइप के लिए भविष्य कहनेवाला नैदानिक ​​मूल्य की आनुवंशिक जानकारी और असाइनमेंट के कार्यात्मक व्याख्या चिकित्सा आनुवंशिकी में एक बड़ी समस्या का प्रतिनिधित्व करता है और जीनोम चौड़ा अनुक्रमण का त्वरक तकनीकी और आर्थिक व्यवहार्यता के साथ तेजी से मार्मिक होता जा रहा है. इसलिए, यह रोगियों में पाया अज्ञात महत्व के वेरिएंट (VUS) की pathogenicity परीक्षण करने के लिए नए मानदंड विकसित करने और लागू करने के लिए आवश्यक है. ये assays तो समय और लागत प्रभावी, सटीक होना चाहिए, और बंदरगाह संभावित नैदानिक ​​उपयोगिता के लिए एक संक्रमण के लिए उत्प्रेरित.

माउस पारंपरिक रूप से मानव रोग मॉडलिंग के क्षेत्र में विकल्प के उपकरण किया गया है, zebrafish के एक वैज्ञानिक और आर्थिक दृष्टि से अनुकूल किराए के रूप में उभर रहे हैं. माउस के विपरीत, zebrafish के जीव विज्ञान के विकास विकृतियों की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देता है जो भ्रूण के ऑप्टिकल स्पष्टता से सहायता प्राप्त सभी विकास के चरणों, आसान करने के लिए और समय पर उपयोग की अनुमति देता है. <sup> 1 उत्परिवर्ती zebrafish लाइनों की अपेक्षाकृत हाल पीढ़ी कार्यात्मक अध्ययन में कई द्वारा नियोजित अतिरिक्त परीक्षण और मॉडलिंग विकल्प प्रदान की गई है, लेकिन इस तकनीक (1,38 में समीक्षा) सीमित किया जाना जारी है. इतना ही नहीं प्राप्त करने के लिए श्रमसाध्य विशिष्ट परिवर्तन की दस्तक इन के साथ आनुवंशिक म्यूटेंट, वे भी एक जीन के भीतर परिवर्तन की एक श्रृंखला के परीक्षण के लिए मध्यम या उच्च throughput विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं. महत्वपूर्ण बात है, परीक्षण के लिए एक एकल सुइट विरासत की विधा को सूचित करने के लिए महत्वपूर्ण है जो सेलुलर स्तर (समारोह बनाम समारोह के लाभ का उदाहरण हानि), पर alleles की रोगजनक क्षमता के लिए न केवल जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी प्रभाव की दिशा के लिए कर सकते हैं परिवारों में, विशेष रूप से जब छोटे मानव वंशावली आनुवंशिक संचरण के मोड पर सीमित जानकारी बंदरगाह. उपलब्ध माउस और zebrafish मॉडल का उपयोग करता है की आगे की तुलना के लिए, 1 टेबल देखें.

हम यह भी ध्यान दें किफिर zebrafish मॉडल प्रणाली के लिए अंतर्निहित सीमाएँ हैं. हालांकि डी. rerio अंग प्रणालियों के तेजी से प्रारंभिक विकास किया है, यौन परिपक्वता लगभग तीन महीनों की आवश्यकता है. इस वजह से, प्रसव पूर्व और बाल चिकित्सा शुरू होने के विकारों इस क्षणिक अभिव्यक्ति मॉडल को सबसे अधिक उत्तरदायी हैं. बड़ी रासायनिक यौगिक स्क्रीन के संचालन के लिए आदर्श है, जबकि आनुवंशिक म्यूटेंट का उपयोग करने के लिए योगदान है कि nonsynonymous वेरिएंट के हजारों की व्यवस्थित परीक्षण के लिए संभव नहीं है, और बाल चिकित्सा विकारों में पता लगाया जाना जारी है.

पूरक परीक्षण संरक्षित विकास की प्रक्रिया के लिए आवश्यक अणुओं के लिए विशेष रूप से इसलिए, इस प्रयोगात्मक शिक्षणीयता, अनुरूपता का उच्च स्तर, और मानव और zebrafish प्रोटीन के बीच समारोह के संरक्षण का लाभ लेने के लिए यहाँ वर्णित है. चित्रा 1 विभिन्न एलील प्रभाव के लिए परीक्षण और पहचान रणनीति की रूपरेखा. दोनों समारोह के नुकसान (LOF) और प्रमुख assays का प्रदर्शन किया जा सकता है. LOF के लिए, प्रयोग एक morpholino पछाड़ना साथ ब्याज की जीन का दमन, और जांच के तहत नैदानिक ​​phenotype के लिए प्रासंगिक हो सकता है कि phenotypes के लिए परख करने की क्रिया के साथ शुरू होता है. या आम तौर पर एक के दोनों शामिल किए जाने के उत्प्रेरण, एक ब्याह जंक्शन पर एक एमओ रखकर splicing के साथ हस्तक्षेप से, दमन पर या निकट zebrafish ठिकाना (tbMO अनुवाद अवरोधक morpholino) के translational शुरू साइट एक एमओ को लक्षित करके अनुवाद अवरुद्ध करके या तो हासिल किया जा सकता है intron या न्यायपालिका एक्सॉन (; sbMO ब्याह अवरुद्ध morpholino) लंघन.

बाद में, orthologous मानव प्रतिलेख से ढकी mRNA शुरू की है और phenotype की मात्रात्मक बचाव मापा जाता है. परख की स्थापना की है, मानव संदेश में उम्मीदवार म्यूटेशनों शुरू की और गुम्मट मानव mRNA के रूप में एक ही क्षमता पर एमओ प्रेरित फेनोटाइप बचाव करने की क्षमता के लिए assayed किया जा सकता है. इसके विपरीत, उम्मीदवार के लिए प्रमुख alleles, मानव mRNA (लेकिन एमओ) introduc हैएक प्रमुख प्रभाव है कि परीक्षण म्यूटेशन की शुरूआत मानव नैदानिक ​​हालत में मनाया उन के अनुरूप phenotypes को प्रेरित करेगा जबकि गुम्मट मानव mRNA के निहायत, zebrafish शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान को प्रभावित नहीं करेगा कि एक उम्मीद के साथ एड. इस प्रयोग के प्रमुख प्रभाव समारोह की बढ़त (GOF) या WT और उत्परिवर्ती मानव mRNA के सम्मिश्रण से एक प्रमुख नकारात्मक तंत्र द्वारा होता है कि क्या काटना सुक्ष्म आगे हो सकता है, GOF घटनाओं के लिए, गुम्मट मानव mRNA के अलावा होने की उम्मीद है अप्रासंगिक, WT और उत्परिवर्ती mRNA का सम्मिश्रण प्रमुख नकारात्मक alleles के लिए, जबकि उत्परिवर्ती संदेश से प्रेरित phenotype की गंभीरता को बदल देना चाहिए. सभी मामलों में, हम अनुशंसा करते हैं कि इंजेक्शन के सभी संयोजनों (एमओ उत्परिवर्ती मानव mRNA आदि के साथ morpholino बनाम गुम्मट मानव mRNA के साथ बेहतर भ्रूण की ही क्लच (चित्रा 1 देखें) के भीतर, प्रदर्शन किया जा निम्नानुसार व्याख्या है.:

LOF परीक्षण के लिए:

  • यदि पछाड़नाउत्परिवर्ती और गुम्मट mRNA के द्वारा यों को बचाया जा सकता है जो एक phenotype पैदा करता है, एलील की संभावना सौम्य है.
  • पछाड़ना phenotype के उत्परिवर्ती बचाव पछाड़ना फेनोटाइप खुद से पृथक है, तो एलील एक संभावना कार्यात्मक रिक्त है. प्रयोग सच nulls (कोई कार्यात्मक प्रोटीन) और कोई बचाव की क्षमता है कि ultralow प्रोटीन गतिविधि के स्तर के बीच भेदभाव नहीं कर सकते.
  • पछाड़ना phenotype के उत्परिवर्ती बचाव सांख्यिकीय एमओ की तुलना में बेहतर है, लेकिन गुम्मट से भी बदतर है, तो इस परिणाम समारोह का आंशिक नुकसान को दर्शाता है, के रूप में एलील की संभावना एक hypomorph है.

प्रमुख परीक्षण के लिए:

  • वहाँ कोई पछाड़ना फेनोटाइप है, लेकिन गुम्मट mRNA का इंजेक्शन एक phenotype पैदा करता है, तो प्रयोग (देखें नीचे) आगे बढ़ना है, तो एक आपात योजना का उपयोग किया जाना चाहिए.
  • गुम्मट mRNA की कोई पछाड़ना phenotype और इंजेक्शन अगर वहाँ कोई phenotype के उत्पादन, प्रयोग सामान्य रूप से आगे बढ़ती है.
  • यदि इंजेक्शनउत्परिवर्ती mRNA के जंगली प्रकार mRNA की है कि के बराबर है की, एलील सौम्य या समारोह का नुकसान तो हो सकता है, या परख विफल हो सकता है. यह आगे प्रयोग इन विकल्पों के बीच भेदभाव करने की आवश्यकता है.
  • उत्परिवर्ती mRNA की इंजेक्शन एमओ पछाड़ना से पृथक है, तो जीन उत्पाद का समारोह होने की संभावना किसी तरह से बदल दिया है. समारोह में बदलाव के लिए विचार करने के लिए, जंगली प्रकार mRNA के साथ उत्परिवर्ती mRNA की एक अनुमापन किया जाना चाहिए.
  • इस अनुमापन का नतीजा अकेले जंगली प्रकार mRNA के लिए पृथक है, तो यह उसके प्रभाव अनुमापन की राशि के साथ विविध है के रूप में उत्परिवर्ती प्रोटीन उत्पाद, एक सब्सट्रेट के रूप में जंगली प्रकार के प्रोटीन का उपयोग करता है कि दिखाया गया है. यह एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप इंगित करता है.
  • इस अनुमापन का नतीजा अकेले उत्परिवर्ती mRNA के लिए पृथक है, तो यह उत्परिवर्ती प्रोटीन उत्पाद अब जंगली प्रकार के रूप में एक ही समारोह है कि दिखाया गया है, और इस तरह जंगली प्रकार के प्रोटीन उत्पाद पूर्व की राशि से प्रभावित नहीं हैभेजा. इस एलील समारोह की संभावना लाभ है कि यह दर्शाता है.

आकस्मिकता योजना:

  • कोई फेनोटाइप एमओ पछाड़ना से प्रस्तुत करता है, लेकिन गुम्मट mRNA के साथ मौजूद है, तो हम इस स्थिति आदर्श नहीं है जोर है कि हालांकि, आगे प्रयोग, हो सकता है. गुम्मट मानव mRNA के फेनोटाइप कम करने के लिए titrated किया जाना चाहिए, और यह भी एक नया सेट बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. WT और उत्परिवर्ती मानव mRNA की आगे coinjection उत्परिवर्ती का बचाव करने की क्षमता के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है.

Protocol

1. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण ब्याज की मानव जीन एक zebrafish ortholog है तो निर्धारित करें, और यदि हां, तो कितनी प्रतियां. हम पारस्परिक ब्लास्ट (की सिफारिश http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ zebrafish जीनोम के खिलाफ मानव प्रोटीन की), और मानव जीनोम के खिलाफ मारा सबसे अच्छा zebrafish के बाद बम विस्फोट. यह सच है orthologs प्रत्येक उदाहरण में सबसे अच्छा हिट हो जाएगा. मानव जीन का खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) के आकार का निर्धारण करते हैं. 6 केबी से अधिक लंबी है, इस मॉडल क्योंकि लंबे टेम्पलेट्स के इन विट्रो प्रतिलेखन में उच्च गुणवत्ता की सीमाओं की वर्तमान में असभ्य है. PCS2 में मानव ओआरएफ + वेक्टर रीढ़ की हड्डी (या एक 5 'SP6 प्रतिलेखन साइट और 3' Pólya संकेत के साथ बराबर वेक्टर) युक्त एक निर्माण को प्राप्त या उत्पन्न करते हैं. लक्षित zebrafish के जीन के splicing या अनुवाद ब्लॉक करने के लिए एक एमओ डिजाइन. कई प्रतियां zebrafish जीनोम, वहाँ में मौजूद हैंई दो विकल्प हैं: अतिरिक्त राज्यमंत्री का एक) डिजाइन, या ख) पूरी तरह प्रतियों के बीच संरक्षित एक विवाह स्थल की पहचान एक भी एमओ प्रभावी हो सकता है, जिसके खिलाफ. कुछ प्रकाशित एमओ दृश्यों पर उपलब्ध हैं www.zfin.org . 2. विकास zebrafish भ्रूण में अभिव्यक्ति विश्लेषण Zebrafish ortholog प्ररूपी readout के लिए प्रासंगिक एक spatiotemporal संदर्भ में व्यक्त किया जाता है तो निर्धारित करें. कोई अभिव्यक्ति डेटा ब्याज की जीन के लिए उपलब्ध हैं, तो पूरे zebrafish भ्रूण से या स्वस्थानी संकरण में सीडीएनए का उपयोग कर (आरटी) पीसीआर रिवर्स प्रतिलेखन आचरण. (2,3 देखें). 3. साइट निर्देशित Mutagenesis केंद्र में वांछित परिवर्तन के साथ लंबाई में डिजाइन mutagenesis के प्राइमरों 25-45 कुर्सियां,. प्राइमर पिघलने के तापमान से अधिक या 78 डिग्री सेल्सियस के बराबर होना चाहिए विपरीत करने के लिए पानी रखना एक आगे और रिवर्स mutagenesis के प्रथम डिजाइनप्लाज्मिड की किस्में. ओआरएफ बाद mutagenesis के अनुक्रम की पुष्टि के लिए प्राइमर प्राप्त है, इन पूरे ओआरएफ कवर करने के लिए ~ 300 आधार जोड़ी वर्गों में टाइल चाहिए. 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 2: 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 3: (1 के रूप में एक उच्च निष्ठा पोलीमर्स और चक्र के साथ उत्परिवर्तजनन प्रतिक्रिया इकट्ठा 55 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 4: 68 डिग्री सेल्सियस 6 मिनट, 5: जाओ 2 18x, 6: 4 डिग्री सेल्सियस, हमेशा के लिए 7: अंत). 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, बांध methylated टेम्पलेट को दूर करने के लिए प्रतिक्रिया प्रति 1 μl DpnI प्रतिबंध endonuclease जोड़ें. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार 20 μl सक्षम कोशिकाओं में उत्परिवर्तजनन प्रतिक्रिया के 2 μl रूपांतरण. 3-4 कालोनियों उठाओ और उचित एंटीबायोटिक युक्त लेग मीडिया के 5 मिलीलीटर टीका लगाना. 225 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर हिलाएँ. Miniprep डीएनए और एकाग्रता का निर्धारण. अनुक्रम उत्परिवर्तन साइट हित के उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए. अनुक्रम अखंडता की पुष्टि करने के अनुक्रम पूरे ओआरएफ. 4. में इन विट्रो mRNA ट्रांसक्रिप्शन एक linearized pCS2 + टेम्पलेट का उपयोग करना, mMessage mMachine SP6 किट (Ambion) का उपयोग छाया mRNA उत्पन्न करते हैं. हम प्रतिक्रिया घटक मात्रा के आधे का उपयोग करना चाहिये. किट निर्देशों में वर्णित के रूप में LiCl तेज़ी या फिनोल क्लोरोफॉर्म के साथ शाही सेना नमूना शुद्ध. Absorbance के उपयोग कर mRNA की एकाग्रता का निर्धारण, जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग mRNA की अखंडता को सुनिश्चित करने, और उपयोग के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस से कम तीन या अधिक aliquots में नमूना की दुकान. हम mRNA के aliquots की कई फ्रीज पिघलना चक्र की सिफारिश नहीं है. 5. समारोह का संस्करण घटाने के vivo परख प्राकृतिक zebrafish matings से zebrafish भ्रूण प्राप्त करें, और डिग्री सेल्सियस भ्रूण पानी में 6 या 10 सेमी बर्तन में 28 में उन्हें बनाए रखना. फेनोटाइप विशिष्टता, एमओ दक्षता और एमओ विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए एक morpholino खुराक प्रतिक्रिया वक्र आचरण. पर की एक खुराक की अवस्था इंजेक्षन50-100 (1-4 सेल चरण) zebrafish भ्रूण / बैच में 1-10 एनजी एमओ के बीच कम से कम तीन अलग सांद्रता. कुशल राज्यमंत्री एक बैच में प्रभावित भ्रूण के अनुपात की खुराक पर निर्भर बढ़ जाती है को जन्म देना चाहिए. उचित विकास के चरण में phenotype भ्रूण ब्याज और एक प्रासंगिक फेनोटाइप मनाया जाएगा, जिस पर मंच के लक्षित zebrafish के जीन की अभिव्यक्ति के आधार पर. यह या तो (मानकीकृत प्ररूपी मानदंडों के आधार पर) मात्रात्मक (जैसे संरचनात्मक ढांचे के बीच एक माप के रूप में) या गुणात्मक हो सकता है. सभी इंजेक्शन> 24 रन के लिए HPF: भ्रूण मेलानोसाईट गठन की अधिकतम कमी करने के लिए 24 HPF में पी टी यू (0.003% 1-फिनाइल-2-Thiourea भ्रूण मीडिया में) के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए. पूरे भ्रूण से कुल शाही सेना निकालने से ब्याह अवरुद्ध राज्यमंत्री, परीक्षण एमओ दक्षता प्ररूपी स्कोरिंग के समय बिंदु पर lysates के लिए, सीडीएनए पैदा करते हैं और एमओ लक्ष्य साइट flanking प्राइमरों का उपयोग कर लक्ष्य जीन की RT-पीसीआर आचरण. दमन effic सत्यापित करने के लिएएक टीबी एमओ, फसल पूरी भ्रूण प्रोटीन lysates के iency और लक्षित प्रोटीन बनाम नियंत्रण के स्तर की तुलना immunoblotting आचरण. Zebrafish के प्रोटीन के लिए कई वाणिज्यिक एंटीबॉडी के पार जेट सीमित है क्योंकि वहाँ हालांकि, इस दृष्टिकोण सभी लक्ष्य जीन के लिए उत्तरदायी नहीं है. एमओ विशिष्टता दिखाने के दो अप्रत्यक्ष तरीकों, में शामिल हैं: एक) phenotype पर एक खुराक पर निर्भर प्रभाव है कि वहाँ का प्रदर्शन, और ख) टीबी एमओ के साथ wildtype mRNA की सह इंजेक्शन कुशलता फेनोटाइप बचाता है कि दिखा. जब संभव दक्षता सीधे नजर रखी जा सकती है, क्योंकि इन कारणों के लिए, हम एक ब्याह अवरोधक की सलाह देते हैं. एक phenotype 5.7 कदम आगे बढ़ना मनाया जाता है, तो कोई फेनोटाइप मनाया जाता है, 6.1 कदम आगे बढ़ना. गुणात्मक phenotypes के लिए, भ्रूण के 50-75% प्रभावित कर रहे हैं, जिसमें एक एमओ खुराक का चयन करें; मात्रात्मक phenotypes के लिए, प्ररूपी उपाय (पी <0.001) जंगली प्रकार से काफी अलग है, जिसमें एक एमओ खुराक का चयन करें. Zebrafish emb के नए बैच इंजेक्षनएमओ की "परख" खुराक और मानव गुम्मट mRNA (10-200 स्नातकोत्तर mRNA से लेकर की एक खुराक की अवस्था से युक्त एक कॉकटेल के साथ; ryos (एन = 50-100/batch 1-4 सेल चरण); इन खुराकों ऊपर पर्याप्त overexpression सुनिश्चित एक zebrafish भ्रूण में कुल Pólya mRNA की 0.25-0.5% का प्रतिनिधित्व किसी एक प्रतिलिपि की आधारभूत,). 4 इंजेक्शन बैच के नकाबपोश स्कोरिंग आचरण, एमओ अकेले की तुलना में सबसे महत्वपूर्ण बचाव के साथ गुम्मट mRNA खुराक का चयन करें, यह mRNA की "परख" खुराक है. एमओ की परख खुराक और उत्परिवर्ती मानव mRNA की परख खुराक के साथ, नए बैच (एन = 50-100/batch 1-4 सेल चरण) इंजेक्षन. Phenotype उपयुक्त मंच पर भ्रूण और एक उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण (टी परीक्षण या ची चुकता) का उपयोग गुम्मट मानव mRNA के बचाव के लिए परिणामों की तुलना. परिणामों के लिए चित्रा 1 देखें और 7 कदम आगे बढ़ना. परख गुम्मट की खुराक और mRNA विषाक्तता प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए अकेले उत्परिवर्ती mRNA के इंजेक्षन. 6. संस्करण डोम के vivo परखसमारोह प्रभाव के inant नकारात्मक या लाभ समारोह फेनोटाइप का कोई नुकसान नहीं मनाया (चरण 5.5) या उत्परिवर्ती mRNA के एमओ अकेले (चरण 5.7) से काफी अलग नहीं phenotypes को जन्म देता है, 10-200 स्नातकोत्तर गुम्मट मानव mRNA से लेकर एक खुराक वक्र इंजेक्षन है (यदि हम 25, 50 की सिफारिश , और भ्रूण बैचों में एक प्रारंभिक परीक्षण के रूप में 100 स्नातकोत्तर) (1-4 सेल चरण, 50-100 भ्रूण / बैच). उचित स्तर पर (ऊपर 5.3 देखें), प्ररूपी स्कोरिंग आचरण, और uninjected नियंत्रण की तुलना में मृत और / या प्रभावित भ्रूण की एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण संख्या नहीं है, जिस पर उच्चतम खुराक निर्धारित. यह "परख" खुराक है. उत्परिवर्ती मानव mRNA (; 50-100 भ्रूण / बैच 1-4 सेल चरण) की परख खुराक इंजेक्षन. Phenotype भ्रूण और गुम्मट मानव mRNA के इंजेक्शन या परख एमओ एकाग्रता की परख खुराक से स्कोरिंग के लिए परिणामों की तुलना. परिणामों के लिए चित्रा 1 देखें. परिणाम एमओ से पृथक कर रहे हैं, गुम्मट mRNA के साथ मानव उत्परिवर्ती mRNA के टाइट्रेटऔर मानव WT और उत्परिवर्ती mRNA के इंजेक्शन की तुलना करें. उत्परिवर्ती प्लस गुम्मट mRNA के इंजेक्शन बैचों साथ phenotypes का सुधार एक प्रमुख नकारात्मक संकेत भी है. कोई सुधार समारोह की बढ़त के संकेत करता है. 7. विवो परीक्षण परिणाम में पुन: पेश विवो assays में तीन बार की एक न्यूनतम दोहराएँ. 8. साक्ष्य के अन्य लाइनों के साथ vivo pathogenicity डाटा में Zebrafish एकीकृत इन विट्रो अध्ययन में आनुवंशिक एक वंशावली के भीतर डेटा (यदि लागू हो), नियंत्रण आबादी आवृत्ति डेटा, (सेल आधारित प्रोटीन स्थिरता assays की, सेलुलर स्थानीयकरण, संकेत उत्पादन, या enzymatic गतिविधि) के लिए zebrafish के प्रयोगों से प्राप्त pathogenicity डेटा की तुलना करें.

Representative Results

पीछे हटने और Pseudorecessive विकार सामूहिक रूप में संदर्भित प्राथमिक cilia. प्रसार, ध्रुवता, भेदभाव, और ऊतक रखरखाव सहित कई सेल भाग्य में सेलुलर संकेत भूमिका निभाते हैं कि हड्डीवाला शरीर योजना पर लगभग सर्वव्यापी संरचनाओं हैं इन organelles के 5 शिथिलता मानव आनुवंशिक विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए जाता है ciliopathies. 6,7 ऐसा ही एक नैदानिक ​​इकाई Bardet-Biedl सिंड्रोम (बीबीएस), रेटिना अध: पतन, मोटापा, अल्पजननग्रंथिता, polydactyly, और वृक्क रोग की विशेषता multisystemic बाल चिकित्सा विकार है. 7 एलील pathogenicity के vivo assays में के विकास के लिए जरूरी हो गया था बीबीएस क्योंकि एक) यह कम से कम 17 जीन 7-10 में होने वाली मुख्य रूप से निजी nonsynonymous परिवर्तन के कारण एक आनुवंशिक रूप से विषम विकार है, और बीबीएस परिवारों की> 25% में ख) oligogenic विरासत, एक दूसरे में विषमयुग्मजी परिवर्तन की उपस्थिति जिसमेंबीबीएस जीन (हटने का प्राथमिक कारण म्यूटेशन के अलावा) नैदानिक ​​अंतर्वेधन और expressivity न्यूनाधिक कर सकते हैं. आमतौर पर, इस तरह के तीसरे alleles के इस प्रकार के प्रोटीन समारोह पर उनकी जैविक प्रभाव की सटीक व्याख्या की जरूरत महसूस एक आनुवंशिक दृष्टिकोण स्पष्ट नहीं रोगजनक क्षमता से की nonsynonymous विषमयुग्मजी परिवर्तन, कर रहे हैं. 11-13 BBS14 – बीबीएस में उत्परिवर्तनीय लोड करने के लिए योगदान परिवर्तन के रोगजनक क्षमता की जांच करने के लिए, हम शुरू में BBS1 में पहचान की सभी missense परिवर्तन का परीक्षण किया. हम और दूसरों दोनों बेसल शरीर को प्रोटीन की हानि तलीय सेल polarity के अनियंत्रण (पीसीपी, गैर विहित WNT सिगनल) को जन्म देता है कि पता चला है. मध्य विखंडकीय zebrafish भ्रूण में संसृत विस्तार दोष के रूप में प्रकट 14 इस physiologically प्रासंगिक प्ररूपी readout के प्रयोग, हम बीबीएस जीन का दमन छोटा शरीर अक्ष, व्यापक और पतले somites, और व्यापक, kinked notochords में कहा कि परिणाम मिल गया है. 15 </(चित्रा> समर्थन, और इन विवो तरीकों में अलग तीन से रन के रूप में मानव mRNA के साथ सह इंजेक्शन (और reproducibly) काफी इन phenotypes बचाया. सबसे पहले, भ्रूण गुणात्मक प्ररूपी मापदंड (सामान्य, कक्षा मैं और द्वितीय श्रेणी, प्ररूपी कक्षाओं की विस्तृत परिभाषा के लिए 15 देखें) के अनुसार जीना रन बनाए थे. अगला, हम epiboly दौरान सेल प्रवास quantitated (की विशेषता एक प्रारंभिक विकास चरण thinning और जर्दी सेल 16 से अधिक सेल परतों के प्रसार) पलायन कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक fluorescein ट्रेसर को रोजगार से. अंत में, हम एक krox20 का कॉकटेल, pax2 और फ्लैट रूपात्मक विश्लेषण के लिए मुहिम शुरू की गई है जो myoD riboprobes, साथ संकरित बगल में नौ विखंड भ्रूण में विखंड ट्रंक लंबाई मापी. इस पद्धति सिलिअरी उत्परिवर्तनीय अंतरिक्ष में 500 alleles की अधिक परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक मेंअकेले अध्ययन,> 130 alleles की विवो परीक्षण में प्ररूपी स्कोर की एक श्रृंखला का उत्पादन किया, के रूप में पूरा सौम्य रूप में वर्गीकृत किया गया (चित्रा 1) हमारे प्रोटोकॉल से बचाता संकेत (गुम्मट बचाव से काफी अलग नहीं), आंशिक (काफी सुधार hypomorphs के रूप में वर्गीकृत किया गया बचाता ) गुम्मट बचाव से एमओ से, लेकिन अधिक गंभीर, बचाव के लिए विफलता कार्यात्मक बातिल (एमओ से काफी अलग नहीं), और प्रमुख नकारात्मक रूप में वर्गीकृत किया गया एमओ की तुलना में अकेले उत्परिवर्ती mRNA के द्वारा प्रेरित phenotypes के रूप में वर्गीकृत किया गया है. हम भी zebrafish में विवो पूरक परख में संवेदनशीलता और विशिष्टता का मूल्यांकन किया है. विशिष्टता द्वारा पुष्टि की गई सह इंजेक्शन लगाने आम SNPs (स्वस्थ नियंत्रण आबादी में> 5% मामूली एलील की आवृत्ति), इनमें 14/17 का परीक्षण (> 82%) में सौम्य phenotypes दे पाए गए, और संकेत के रूप में संवेदनशीलता 98% होना दिखाया गया था विवो डेटा और आनुवंशिक तर्क पर्याप्त टी में दोनों के बीच सामंजस्य सेओ एक BBS वंशावली में कारण के रूप में एक एलील विशेषता. 17 इसके अलावा, प्ररूपी प्रभाव immunoblotting और सेलुलर स्थानीयकरण अध्ययन का उपयोग इन विवो उपायों (जी स्कोरिंग, epiboly ट्रैकिंग, और ISH मौरफोमैटरिक्स) इन विट्रो में मान्य किया गया में तीन का उपयोग कर मनाया. इन परिणामों की व्याख्या रोग रोगजनन के कम से कम एक तंत्र पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है, इस उदाहरण हमारे प्रोटोकॉल की उपयोगिता और मजबूती को पुष्ट करने के लिए सबूत उपलब्ध कराता है. हम के बाद से एक निष्पक्ष उत्परिवर्तनीय स्क्रीनिंग में प्रयोगात्मक सबूत के कई अन्य लाइनों और TTC21B का कार्य विश्लेषण अध्ययन, एक प्रतिगामी intraflagellar परिवहन प्रोटीन के साथ vivo स्कोरिंग में हमारी पुष्टि की है. 18 प्रमुख विकार अंग करधनी पेशी अपविकास (LGMD) कूल्हों और कंधों में धीमी प्रगति मांसपेशियों में कमजोरी के कारण, मांसपेशियों की एक autosomal वर्ग के हैं. यह आनुवंशिक और मुझेविकारों के chanistically विषम समूह के प्रमुख और पीछे हटने sarcomeric कई sarcolemmal भर में म्यूटेशन, साइटोप्लाज्मिक, और परमाणु प्रोटीन दोनों के कारण होता है. नैदानिक ​​phenotypes और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग से मांसपेशियों में शामिल होने के सबूत की प्रस्तुति के आधार पर हमने फिनिश, अमेरिका, और इतालवी परिवारों के 19 में पाया एक प्रमुख LGMD के कारणों की जांच की. मैप ठिकाना भीतर स्थितीय उम्मीदवारों का अनुक्रमण DNAJB6 में परिवर्तन का पता चला, HSP70 परिवार के एक सह निगरानी एन्कोडिंग एक जीन मानव में कम से कम दो ब्याह isoforms (परमाणु और cytoplasmic) के रूप में व्यक्त किया. DNAJB6 समारोह और LGMD अपनी प्रासंगिकता में आगे अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, हम zebrafish में पेशी अखंडता में अपनी भूमिका की जांच की. Zebrafish ortholog (dnajb6b) की RT-पीसीआर एक ब्याह अवरुद्ध morpholino के साथ भ्रूण के इंजेक्शन द्वारा पीछा किया गया था जो पांच विखंड चरण, के रूप में जल्दी के रूप में अभिव्यक्ति का पता चला. 48 घंटा बाद निषेचन में नकाबपोश स्कोरिंग धीमी की टुकड़ी से पता चलाउनकी प्रविष्टि अंक से फाइबर. इस phenotype की विशिष्टता तो एक दूसरे गैर अतिव्यापी एमओ के साथ परीक्षण किया और गुम्मट मानव DNAJB6 mRNA के साथ बाद में बचाया गया था. DNAJB6 समारोह के नुकसान पेशी अखंडता में दोषों की ओर जाता है कैसे क्वेरी करने के लिए, हम दोनों isoforms की मानव टेप में रोगियों में पाए missense म्यूटेशनों शुरू की और zebrafish भ्रूण में उन्हें इंजेक्शन. गुम्मट मानव mRNA की इंजेक्शन कोई सराहनीय फेनोटाइप का उत्पादन किया है, जबकि इन परिवर्तनों साइटोप्लाज्मिक में इंजीनियर जब एमओ के समारोह प्रभाव का नुकसान phenocopied, लेकिन परमाणु नहीं isoform. यह एक प्रमुख प्रभाव है, सुझाव पेशी फेनोटाइप की बढ़ी गंभीरता से पता चला है जो उत्परिवर्ती और गुम्मट mRNA के equimolar मात्रा की coinjection द्वारा पीछा किया गया था. इस धारणा का परीक्षण करने के लिए, आगे इंजेक्शन उत्परिवर्ती और गुम्मट mRNA की दाढ़ अनुपात में फेरबदल के साथ किए गए थे. भविष्यवाणी के अनुरूप, उत्परिवर्ती mRNA की एक अतिरिक्त है, भ्रूण में गुम्मट प्रेरित मारक के साथ तुलना करते हुए एकगुम्मट के n अतिरिक्त एक उत्तरोत्तर वृद्धि हुई बचाव का उत्पादन किया. इस oligimerization गुण और संभव प्रोटीन बातचीत निर्धारित करने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में किया गया. ये परिवर्तन साइटोप्लाज्मिक DNAJB6 की antiaggregation गतिविधि क्षीण और उत्परिवर्ती और गुम्मट दोनों का कारोबार है, साथ ही LOF BAG3 के एक बाल के फार्म का कारण बनता है, के रूप में भी LGMD की pathomechanism से प्रासंगिक है जो एक और अणु, BAG3, के साथ बातचीत के साथ हस्तक्षेप से पता चला कि पेशी dystrophy 20. हम तो BAG3 zebrafish में उत्परिवर्ती DNAJB6b से प्रेरित फेनोटाइप मिलाना सकता है कि क्या पूछा. गुम्मट BAG3 का इंजेक्शन अकेले DNAJB6 म्यूटेंट के साथ कोई फेनोटाइप, coinjection उत्पादन किया जबकि काफी BAG3 ऐसे म्यूटेंट 19 की pathogenicity मध्यस्थता में एक भूमिका निभाता है, सुझाव है कि प्ररूपी गंभीरता वृद्धि हुई. क्षणिक zebrafish मॉडल <p> उत्परिवर्ती Zebrafish रेखा ट्रांसजेनिक माउस लाइन जांच के तहत मानव phenotype की शुरुआत की उम्र जन्म के पूर्व का नवजात बाल चिकित्सा जन्म के पूर्व का नवजात बाल चिकित्सा जन्म के पूर्व का नवजात बाल चिकित्सा वयस्क संभव phenotypes craniofacial मांसल संकेतन हृदय संबंधी गुर्दा संबंधी वाहिकीय craniofacial मांसल संकेतन हृदय संबंधी गुर्दा संबंधी वाहिकीय craniofacial मांसल संकेतन हृदय संबंधी गुर्दा संबंधी वाहिकीय संवेदी कंकाल का आंत का व्यवहार सांस प्रजनन endocrinal उपापचयी उपयोग करें जब तक समय (जन्म से) 1-7 दिनों > 3 महीने > 6 महीने Throughput मध्यम उच्च निम्न निम्न लाभ विशिष्ट परिवर्तन का परीक्षण करने की क्षमता दस्तक में मॉडल उत्पन्न करने की क्षमता Morpholino knockdowns उपयोग करने की क्षमता कम लागत रखरखाव कम प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता करीब विकासवादी संबंध अंग संरचनाओं का संरक्षण जीन करने की क्षमतादर तोड़े में मॉडल तालिका 1. Vivo मॉडल में की तुलना करें. तालिका 2. मानव dysmorphologies के vivo मॉडलिंग में के उदाहरण हैं. विभिन्न phenotypes प्रस्तुत प्रोटोकॉल के तहत परीक्षण किया गया. प्ररूपी readouts और दृश्य तकनीकों की एक श्रृंखला विकार के प्रकार के आधार पर नियोजित किया जा सकता है. बड़ा टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें. चित्रा 1. Nonsynonymous वेरिएंट के vivo कार्यात्मक परीक्षण में. सभी के कार्यात्मक परीक्षण करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोणअज्ञात या धारणा महत्व की eles. Morpholino microinjection के माध्यम से जीन पछाड़ना WT और उत्परिवर्ती मानव mRNA के दोनों में से (सह) इंजेक्शन की एक श्रृंखला के द्वारा पीछा किया जाता है. प्ररूपी परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण एलील pathogenicity और आणविक समारोह को सूचित करें. संक्षेप में, समारोह परीक्षण के नुकसान के लिए: पछाड़ना उत्परिवर्ती और गुम्मट mRNA के द्वारा यों को बचाया जा सकता है जो एक phenotype पैदा करता है, तो एलील (हरे बॉक्स) की संभावना सौम्य है. पछाड़ना phenotype के उत्परिवर्ती बचाव पछाड़ना फेनोटाइप से पृथक है, तो एलील एक संभावना कार्यात्मक बातिल (पीला बॉक्स) है. पछाड़ना phenotype के उत्परिवर्ती बचाव सांख्यिकीय एमओ की तुलना में बेहतर है, लेकिन गुम्मट से भी बदतर है, तो एलील की संभावना एक hypomorph (हरे बॉक्स) है प्रमुख परीक्षण के लिए:. उत्परिवर्ती mRNA की इंजेक्शन जंगली प्रकार mRNA की है कि के बराबर है , एलील सौम्य या समारोह का नुकसान तो हो सकता है, या परख (हरे बॉक्स) विफल हो सकता है. उत्परिवर्ती mRNA की इंजेक्शन INDIS है एमओ पछाड़ना से tinguishable, जीन उत्पाद का समारोह होने की संभावना किसी तरह से बदल दिया है. समारोह में बदलाव के लिए विचार करने के लिए, जंगली प्रकार mRNA के साथ उत्परिवर्ती mRNA के टाइट्रेट. इस अनुमापन का नतीजा अकेले जंगली प्रकार mRNA के लिए पृथक है, तो उत्परिवर्ती प्रोटीन उत्पाद जिससे एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप (नीले बॉक्स) का संकेत है, एक सब्सट्रेट के रूप में जंगली प्रकार के प्रोटीन का उपयोग करता है. इस अनुमापन का नतीजा अकेले उत्परिवर्ती mRNA के लिए पृथक है, तो उत्परिवर्ती प्रोटीन उत्पाद अब जंगली प्रकार के रूप में ही कार्य किया है, और इस तरह की संभावना समारोह (नीले बॉक्स) की बढ़त है. कोई फेनोटाइप एमओ पछाड़ना से प्रस्तुत करता है, लेकिन गुम्मट mRNA के साथ उपस्थित करता है, आगे प्रयोग हो सकता है, गुम्मट मानव mRNA के फेनोटाइप कम करने के लिए titrated किया जाना चाहिए, और यह भी एक नया सेट बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. WT और उत्परिवर्ती मानव mRNA की आगे coinjection उत्परिवर्ती से बचाव की क्षमता (गुलाबी बॉक्स) के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है.एट = "_blank"> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें. चित्रा 2. MKS1 म्यूटेशन के मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन मानव में पाया. विकासात्मक दोष mks1 morphant भ्रूण में. गंभीरता के आधार पर, phenotypes के तीन समूहों में वर्गीकृत किया गया है. प्रत्येक वर्ग के उदाहरण (एक) दिखाए जाते हैं, और उनके भ्रूण पलटन के भीतर उनके प्रसार (एन = 100-160 भ्रूण) () नहीं दिखाया सारणीबद्ध किया गया था. एमओ ही विखंडकीय उम्र में इंजेक्शन भ्रूण (8-9 somites) पर नियंत्रण की तुलना जर्दी पर अत्यधिक भ्रूण ऊतक के साथ, मैं phenotypes निहायत सामान्य आकारिकी था लेकिन छोटे थे कक्षा के साथ भ्रूण इंजेक्शन. द्वितीय श्रेणी morphants पतला थे, कम और खराब सिर और पूंछ संरचनाओं का विकास किया था, और इसके अलावा विखंडकीय परिभाषा का अभावऔर समरूपता. तीसरी कक्षा भ्रूण गंभीर रूप से खराब विकसित और कुरूप somites साथ देरी हुई, notochords लहरदार, और आम तौर पर 10 विखंड चरण अतीत जीवित नहीं था. मानव MKS1 mRNA की सह इंजेक्शन mks1 दमन करने phenotypes की विशिष्टता का प्रदर्शन, इन दोषों में से प्रत्येक को बचाया. Krox20, pax2 और myoD riboprobes साथ दाग 11 विखंड चरण (± 1 विखंड) में भ्रूण के स्वस्थानी संकरण में (ख, ग ). Phenotypes पहले से ग में मात्रा प्रत्येक भ्रूण (तीर) के अंतिम प्रशंसनीय विखंड को माप द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था. चित्रा 15 से अनुमति के साथ अनुकूलित. चित्रा 3. मानव dysmorphology के vivo मॉडलिंग में के उदाहरण. (क) Craniofacial dysmorphology. नियंत्रण mRNA के भ्रूण इंजेक्शन (बाएं) और उत्परिवर्ती इंजेक्शन भ्रूण (दाएं) 5 DPF पर Alcian नीले रंग के साथ दाग. म्यूटेंट mRNA के इंजेक्शन भ्रूण सहित नरम हड्डी craniofacial कंकाल की एक सामान्य गड़बड़ी के साथ विशेष रूप से छोटे और कुरूप सिर प्रदर्शित गिल चाप और लापता या विकृत संरचनाओं splayed. (ख) माइक्रो / macrocephaly. नियंत्रण 5 DPF पर भ्रूण (बाएं) और kctd13 एमओ इंजेक्शन भ्रूण (दाएं) uninjected. आंखों के बीच अंतरिक्ष से देखा के रूप में Morphants, सिर को चौड़ा प्रदर्शित करते हैं. 21 (ग) कम संवहनी अखंडता. नियंत्रण भ्रूण uninjected (ऊपर) और इंग्लैंड के एमओ इंजेक्शन भ्रूण (नीचे) एक fli1 में 2 DPF पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged: EGFP ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइन. Intersegmental वाहिकाओं और अन्य संवहनी संरचनाओं का अंकुरण बिगड़ा Morphants प्रदर्शित करते हैं. 41 (घ) बदल दिल पाशन. विश्वविद्यालय के स्वस्थानी संकरण मेंccdc39 morphant भ्रूण () नहीं दिखाया द्विपक्षीय पता चला है (सही) या, ज्यादातर मामलों में, अनभिज्ञेय spaw अभिव्यक्ति जबकि njected जंगली प्रकार भ्रूण (बाएं), बाएं पार्श्व प्लेट mesoderm में spaw अभिव्यक्ति दिखा. 43 (ई) गुर्दे अल्सर. Uninjected गुम्मट भ्रूण (ऊपर) और ift80 morphant (नीचे). Morphants बड़े गुर्दे अल्सर (तीर), पेरिकार्डियल शोफ (नोक) और एक पूंछ कर्ल करवाने का प्रदर्शन किया. 44 (च) कम glomerular निस्पंदन. दिल में rhodamine dextran के इंजेक्शन के बाद भ्रूण (ऊपर) और ift80 morphant (नीचे) 24 घंटा इंजेक्शन का कोई नियंत्रण फ्लोरोसेंट दृश्य. नियंत्रण में प्रतिदीप्ति के अभाव को पूरा करने के रूप में देखा प्रतिदीप्ति नाड़ी तंत्र भर disperses और लगभग पूरी तरह से गुर्दे से खाली है. morphant कम glomerular निस्पंदन, सुझाव लगातार फ्लोरोसेंट dextran प्रदर्शित करता है. 46 (छ) पेशी dystrophy. गुम्मट DNAJB6 श्रीएनए इंजेक्शन भ्रूण (ऊपर) विरोधी धीमी मायोसिन एंटीबॉडी का उपयोग immunostaining द्वारा निर्धारित रूप में आसन्न myosepta के बीच सामान्य रूप से somites फैले सामान्य धीमी myofibers दिखा. उत्परिवर्ती DNAJBb (नीचे) एक या एकाधिक somites में myosepta से myofibers के टुकड़ी को पूरा करने के लिए आंशिक पता चला. 19 (ज) विखंड कोण. नियंत्रण uninjected (ऊपर) या 30 HPF पर imaged kif7 morphants (नीचे) का जीना पार्श्व देखा गया बढ़ाया. Morphants zebrafish myotome में संकेत अस्थानिक हाथी के कारण असामान्य रूप से आकार somites, प्रदर्शित करते हैं. 47 सभी आंकड़े अनुमति के साथ अनुकूलित.

Discussion

तरीकों मानव आनुवंशिक रोग phenotypes (2 टेबल, चित्रा 3) की एक किस्म के साथ जुड़े nonsynonymous परिवर्तन की परख करने के लिए लागू एक सामान्य प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करते हैं यहाँ वर्णित है. हमारे दृष्टिकोण रोग phenotypes पर भिन्नता के संभावित प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी सिद्ध कर दिया है, और रोग तंत्र (जैसे Bardet-Biedl सिंड्रोम के लिए प्रमुख नकारात्मक परिवर्तन के योगदान, एक मुख्य रूप से ऑटोसोमल रिसेसिव विकार 17) के रूप में काटना मदद करने के लिए. तिथि करने के लिए, प्रस्तुत निर्णय वृक्ष के विकास के माध्यम से, हम 1000 alleles की एक अतिरिक्त के लिए, कारणतः आनुवंशिक विकारों के साथ जुड़े 200 जीनों से अधिक उचित कीमत और समय पर मॉडलिंग की है.

यहाँ विस्तार से चर्चा नहीं है, हम भी इन तरीकों ऐसे प्रतिलिपि संख्या वेरिएंट (CNVs) के रूप में भी और आनुवंशिक बातचीत के रूप में आनुवंशिक घावों के अन्य प्रकार, मॉडल करने के लिए उपयुक्त हैं कि पता चला है. इस तरह की घटनाओं के विश्लेषण के दायरे से बाहर हैंवर्तमान पद्धति विवरण, वे मौलिक चिकित्सकीय उपयुक्त phenotypes की प्रेरण या गहरा निर्धारित करने के लिए उम्मीदवार जीन (समवर्ती इंजेक्शन जीन की जोड़ी भी शामिल है) के व्यवस्थित परीक्षण का एक ही सिद्धांत पर भरोसा करते हैं. उदाहरण के लिए, 16p11.2 CNV में 29 जीन की जो स्पष्ट करने के लिए इंजेक्शन और सिर थे खंड के भीतर 29 जीनों में से प्रत्येक के लिए इसी मनाया एक 660 केबी जीनोमिक खंड के duplications के साथ रोगियों में मनाया microcephaly, mRNAs के लिए प्रासंगिक हो सकता है आकार माप एक एक प्रतिलिपि, KCTD13 का एक प्रमुख योगदान खुलासा, 2 DPF और 5 DPF पर आयोजित की गई. 21 इसके अतिरिक्त, हम Bardet-Biedl सिंड्रोम और Hirschsprung रोग दोनों के साथ रोगियों में जीनोमिक घावों की परख आनुवंशिक बातचीत करने के लिए इस मॉडल का इस्तेमाल किया है. 22 अलग और एक साथ दो नैदानिक ​​पहचान के कारण जीन के एमओ दमन की तुलना करके, हम बी के रूप में जिसके परिणामस्वरूप फेनोटाइप की पहचान करने में सक्षम थेएनजी एक synergistic बातचीत के बजाय केवल additive के गंभीरता.

उच्च संवेदनशीलता (98%) और ciliopathies 17 के लिए योगदान वेरिएंट के लिए विशिष्टता (> 82%) की स्थापना होने के बावजूद, हम अभी तक इन zebrafish मॉडल में सभी प्ररूपी readouts को generalizable हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए पर्याप्त डेटा नहीं है. ऐसा करने के लिए, alleles की एक बड़ी संख्या, प्रत्येक प्ररूपी श्रेणी में परीक्षण किया जाना चाहिए, आनुवंशिक रूप से सौम्य या रोगजनक या तो होने की भविष्यवाणी की. इस नैदानिक ​​सेटिंग में ऐसे assays के कार्यान्वयन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाएगा, VUSs के कार्यात्मक व्याख्या जिसमें निदान और झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी के एक मजबूत समझ चिकित्सकों और मरीजों के लिए इस तरह के परिणामों के वितरण के साथ कर सकते हैं केवल यदि प्रबंधन को सूचित कर सकते हैं. बहरहाल, इन तरीकों मानव आनुवंशिक रोग के परिदृश्य की बेहतर समझ की ओर काफी योगदान दे सकते हैं. हम इन मॉडलों केवल एक फाउंडेशन के रूप में काम नहीं करेंगे कि आशानैदानिक ​​आनुवंशिक जानकारी की बेहतर व्याख्या के लिए फाउंडेशन, लेकिन यह भी चिकित्सकीय स्क्रीन का संचालन करने के लिए उपयोगी मॉडल के रूप में नियोजित किया जाएगा. विवो डेटा में भी इस तरह के PolyPhen 23 जैसे स्रोतों से सिलिको कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों में की तुलना में हो सकता है, 24 झारना, SNPs और जाओ 25, या 26 MutPred क़बूल दिखाने के लिए. भविष्यवाणी डेटाबेस SNPs और जाओ और MutPred की पिछले एक अध्ययन में क्रमश: accuracies केवल 0.82 और 0.81 तक पहुँचने के साथ, सबसे सटीक होना पाया गया है कि ध्यान दें. 27

हम बाल संरचनात्मक दोषों (2 टेबल, चित्रा 3) के एक सबसेट के लिए इन तरीकों की मजबूती को रेखांकित किया गया है, कुछ phenotypes के इन तरीकों से कम विनयशील हैं. कुछ अपवादों के बावजूद, हमारे प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी नहीं विकारों के तीन मुख्य वर्गों रहे हैं. वयस्क शुरुआत विकारों (जैसे पार्किंसंस रोग के रूप में) एक भ्रूण प्रणाली में मॉडल के लिए एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं. ठेला धीरेression अपक्षयी phenotypes (जैसे frontotemporal पागलपन के रूप में) एक phenotype निर्माण करने के लिए एमओ गतिविधि के सात DPF खिड़की से अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है. ऐसे आरएनएआई और siRNA के रूप में अन्य जीन पछाड़ना प्रौद्योगिकियों के साथ हस्तक्षेप या जीन लक्ष्य नीचा करने के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन यह इस प्रकार भी समय सीमा सीमित है, कोई नहीं के रूप में, विशेष रूप से स्थिर, गैर विषैले, या राज्यमंत्री 28 में लंबे समय तक चलने वाले हैं दिखाया गया है कि phenotyping के लिए. तीसरा, इस तरह के स्तनधारी फेफड़ों के रूप में कुछ हड्डीवाला संरचनाओं, zebrafish भ्रूण में एक पर्याप्त orthologous संरचना नहीं है. हम यह एक असामान्य और अवांछनीय स्थिति है चेतावनी देते हैं, हालांकि हम भी, गुम्मट मानव mRNA के इंजेक्शन एक phenotype की ओर जाता है, जिसमें उन मामलों की जांच के लिए एक सुझाव दिया आपात योजना उपलब्ध कराई है.

कुछ रोग phenotypes तो अमूर्त और सरोगेट मां का एक बड़ा डिग्री की आवश्यकता हो सकती. यह जीन समारोह पर्याप्त मॉडल और tr के बीच प्ररूपी समानता को कमजोर करने के लिए भिन्न हो गया है कि संभव हैue फेनोटाइप, या कि zebrafish फिजियोलॉजी स्वाभाविक प्रेरित रोग के प्रभाव को पेचीदा हो. ऐसे मामलों में, हम बर्खास्तगी से पहले उत्पादित phenotype के आगे विच्छेदन सुझाव है. हम इस परख के लिए समस्याग्रस्त phenotypes के zebrafish भ्रूण में मॉडलिंग कर दिया गया है, जिनमें कुछ सफल उदाहरण का उत्पादन किया है. उदाहरण के लिए, TCF8 में परिवर्तन, फुच्स कॉर्निया कुपोषण (FCD) के साथ जुड़े जीन, प्रारंभिक विकास में इस प्रतिलेख के ज्ञात भूमिकाओं के आधार पर एक किराए की प्ररूपी readout के रूप में gastrulation के दोषों का उपयोग करके हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग assayed थे. अन्य मामलों में 29 ऐसे DNAJB6 में परिवर्तन की वजह से वयस्क शुरुआत पेशी dystrophy के रूप में, हम मनुष्य के जीवन के अपने पहले तीन से चार दशकों में विकृति प्रशंसनीय पेशी से महरूम हैं कि इस तथ्य के बावजूद 5dpf भ्रूण में myofiber phenotypes को उत्पन्न करने में सक्षम थे. 19

यहाँ प्रस्तुत क्षणिक उत्परिवर्ती मॉडल के अलावा, दूसरों को भी advanta ले लिया हैशरीर प्रणालियों की एक किस्म में मानव रोग मॉडल के इस क्षणिक प्रणाली के जीई. एक उदाहरण में, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा रेटिना कोशिका मृत्यु में जिसके परिणामस्वरूप, जीन RP2 की पछाड़ना द्वारा zebrafish में मॉडलिंग की है और रेटिना फाड़ना कम था. पांच उत्परिवर्ती mRNAs की चार बाहर बचाव करने में विफल रहा है, जबकि मानव जंगली प्रकार mRNA के साथ बचाव, रेटिना फाड़ना के सभी तीन परतों के विकास में हुई. 30 एक मानव संवेदी विकार का यह मॉडल एक रूपात्मक phenotype पर आधारित है, यह भी संभव है कि ऐसे ध्वनिक डराना या निषेध prepulse रूप में उत्तेजनाओं को परख प्रतिक्रिया. 47

हाल ही में, एक zebrafish मॉडल amyloid प्रोटीन अग्रदूत के माध्यम से अल्जाइमर रोग के रोगजनन जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. 31 लेखकों कि जीन पछाड़ना मानव mRNA के साथ बचाया जा सकता है, जो मोटर न्यूरॉन्स का बिगड़ा axonal परिणाम कारण दिखाया. माउस मॉडल केवल सूक्ष्म phenot प्रदर्शित रूप में यह मॉडल, विशेष रूप से ज्ञानवर्धक साबित हो गया हैypes (एकल पछाड़ना) या प्रसवोत्तर मारक (डबल पछाड़ना). विकास में vivo में zebrafish भ्रूण का मूल्यांकन करने की क्षमता कम amyloid प्रोटीन अग्रदूत, साथ ही प्रोटीन समुचित कार्य के लिए एक बाह्य और intracellular डोमेन दोनों की आवश्यकता है बशर्ते कि प्रत्यक्ष प्रमाण के रोगजनक प्रभाव विचार करने में मदद की. अन्य उल्लेखनीय मॉडल शामिल अतिरिक्त पेशी अपविकास 32, डायमंड Blackfan एनीमिया 33, Axenfeld-Reiger सिंड्रोम (नेत्र और craniofacial विकास) 34, सूजन आंत्र रोग 35 (जीवाणुरोधी गतिविधि), पार्किंसंस रोग 36 (न्यूरॉन और हरकत हानि), और जब्ती की 37 कि (जलशीर्ष और सक्रियता).

अधिक आम एक मानव रोग फेनोटाइप पुनरावृत्ति को भी दिखाया गया है कि उत्परिवर्ती zebrafish लाइनें हैं. 1,38 में समीक्षित, मॉडल ल्यूकेमिया, मेलेनोमा, फैली हुई cardiomyopathies, Duchenne पेशी dystrophy, शामिलऔर दूसरों के कई.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम एक ड्यूक विश्वविद्यालय के डीन की ग्रीष्मकालीन रिसर्च फैलोशिप (एक), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (अहा) फेलोशिप 11POST7160006 (सीजी), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) से राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (EED), R01HD04260 से अनुदान R01-EY021872 से समर्थन स्वीकार राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और विकास संस्थान (एन), मधुमेह पाचन और गुर्दा विकार के राष्ट्रीय संस्थान (एन) से R01DK072301 और R01DK075972, और यूरोपीय संघ (जीए एन.आर. तहत यूरोपीय संघ के 7 वें एफपी द्वारा वित्त पोषित, 241955, परियोजना SYSCILIA;. EED, एन.के.) एन.के. एक विशिष्ट जीन और जॉर्ज डब्ल्यू Brumley प्रोफेसर है.

Materials

Reagent
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S, M0530L
DpnI restriction endonuclease NEB R0176L, R0176S
Max Efficiency DH5α competent cells Invitrogen 18258-012
Big Dye Terminator Applied Biosystems 4337455
mMESSAGE mMACHINE Kit Invitrogen AM1340, AM1344, AM1348
Morpholino Gene-Tools n/a
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma Aldrich P7629 Prepare as 0.003% PTU in embryo media
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%
Tricaine methane sulfonate Western Chemical N/A For anesthetization and euthanasia
Equipment
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler BioRad Any equivalent thermal cycler
Nano Drop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific
SMZ 745T Stereomicroscope Nikon
AZ100 Stereomicroscope Nikon
DS Fi1 Digital Camera Nikon For color/fluorescent imaging
DS QiMC Digital Camera Nikon For black/white imaging
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software NIS- Elements
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Riferimenti

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Niederriter, A. R., Davis, E. E., Golzio, C., Oh, E. C., Tsai, I., Katsanis, N. In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio. J. Vis. Exp. (78), e50338, doi:10.3791/50338 (2013).
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