Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H Magnetic Resonance Imaging
Summary
Verfolgung von Zellen mittels MRT hat bemerkenswerte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung von dendritischen Zellen mit Fluor (<sup> 19</sup> F)-reiche Teilchen, die in vivo Anwendung dieser Zellen, und Überwachen des Ausmaßes der Migration in die Lymphknoten mit<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H MRI und<sup> 19</sup> F MRS.
Abstract
Kontinuierliche Fortschritte in der nicht-invasiven bildgebenden Verfahren wie Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) haben stark unsere Fähigkeit, physiologische oder pathologische Prozesse in lebenden Organismen zu studieren verbessert. MRT erweist sich auch ein wertvolles Werkzeug für die Erfassung transplantierten Zellen in vivo sein. Initial Zellmarkierung Strategien für MRI gemacht Verwendung von Kontrastmitteln, die die MR-Relaxationszeiten beeinflussen (T1, T2, T2 *) und führen zu einer Erhöhung (T1) bzw. Abreicherung (T2 *) des Signals in dem markierten Zellen vorhanden sind. T2 * Verstärkungswirkstoffe wie ultrakleine Eisenoxid Agenten (USPIO) wurden eingesetzt, um die Zellwanderung und einige haben auch von der FDA für die klinische Anwendung zugelassen zu studieren. Ein Nachteil von T2 * Mittel ist die Schwierigkeit, das Signal Löschung durch den markierten Zellen von anderen Artefakten wie Blutgerinnsel, Mikro Blutungen oder Luftblasen erzeugt unterscheiden. In diesem Artikel beschreiben wir eine aufstrebende Technik für die Tracking-Zellen in vivo, dasswird zur Kennzeichnung der Zellen mit Fluor (19 F)-reiche Partikel. Diese Partikel werden durch Emulgieren Perfluorcarbon (PFC)-Verbindungen und dann auf Label-Zellen, die anschließend durch 19 F MRI abgebildet werden können, erstellt. Wichtige Vorteile von PFC für Handy-Tracking in vivo include (i) das Fehlen von Kohlenstoff-gebundenen F 19 in vivo, die dann liefert Hintergrund-Bilder und komplette Zelle selectivityand (ii) die Möglichkeit, die Zelle, das durch 19 F MR-Spektroskopie quantifiziert .
Introduction
Das Tracking von Zellen in vivo ist ein entscheidender Aspekt in mehreren Bereichen der Biomedizin. Hierzu sind invasive bildgebende Verfahren, die selektiv lokalisiert Zellen über einen längeren Zeitraum kann extrem wertvoll. Vor der Entwicklung von dreidimensionalen Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), wurde die Verfolgung der Immun-Zellmigration mikroskopische Analysen oder Gewebeproben beschränkt. Handy-Tracking mit Hilfe von MRI hat immense Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, nicht nur für das Studium Immunologen Immunzellen Verhalten in vivo, sondern auch für die klinische und die Stammzell-Forscher. Während Mitte der 90er Jahre, Nanopartikel die ersten Studien auf Eisenoxid 1 initiiert eine Kaskade von Entwicklungen für die Verfolgung von Zellen mit MRT. Eisenoxid-Partikel verkürzen die MR-Relaxationszeit (T2 *) der markierten Zellen und damit Signal Erschöpfung in MR-Bildern. Eisenoxidteilchen zur Markierung Makrophagen 2, Oligodendrozyten p eingesetztrogenitors 3 und viele andere Zelltypen. Einige dieser Partikel wurden ebenfalls klinisch von der FDA für die Kennzeichnung zelluläre Impfstoffe in Melanom-Patienten 4 genehmigt. Da in vivo oder ex vivo-Markierung von Zellen mit Eisenoxidteilchen stützt sich auf eine Verkürzung der T2 *-Signal, wobei letzteres auch etwa durch in vivo gebracht Anfälligkeit Zusammenhang T2 * Effekte wie Mikro Blutungen Eisenlagerstätten oder Luftblasen es könnte schwierig sein, markierten Zellen in vivo zu identifizieren aus anderen Hintergrund T2 *-Signal Aussterben 5.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Technik für die Verfolgung von dendritischen Zellen (DC) in vivo durch den Einsatz von 19 F / 1 H Magnetresonanz-Tomographie (MRT). Diese Zelle Tracking-Technologie wurde erst im Jahr 2005 eingeführt, 6, mehrere Jahre nach der ersten erkannte Anwendungen für 19 F in MRI worden war 7 gemeldet. Ein wichtiger ADVAntage von 19 F auf Eisenoxidpartikels Zellmarkierung ist die geringe biologische Auftreten von 19 F in Gewebe, das macht es möglich, Zellen sehr selektiv zu verfolgen im Grunde mit Hintergrund-Bilder. Weiterhin ist es möglich, die 19 F MR-Signal von den transplantierten markierten Zellen überlagern mit anatomischen Bilder von herkömmlichen 1H MRI erhalten. 19 F / 1 H MRI ist daher wesentlich, die für Studien, Zellmigration in vivo. Zellen, die mit dieser Methode untersucht werden mit 19 F-reiche Partikel bezeichnet. Synthetisch abgeleitet perfluorierte Kohlenwasserstoffe (FKW), die hauptsächlich aus Kohlenstoff und Fluor-Atome werden häufig verwendet, um die Teilchen herzustellen. Diese Verbindungen sind nicht wasserlöslich und müssen vor der Applikation in vitro oder in vivo emulgiert werden. Die übliche Größe der Teilchen, die PFC von anderen Gruppen wurden für Arbeitnehmer in vivo 19 F-MRT Tracking Experimenteim Bereich zwischen 100 nm und 245 nm 6,8-10. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Effizienz bei der Markierung von dendritischen Zellen mit Perfluor-15-Krone-5-Ether (PFCE) Teilchen mit zunehmender Teilchengröße (> 560 nm). 11
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode der Verwendung von 19 F / 1 H MRI, um die Bewegung von DC in den Lymphknoten folgen die Möglichkeit gibt, die Wanderungsbewegungen von Immunzellen in vivo zu untersuchen. Dendritische Zellen sind hervorragende Beispiele für die Migration schnell Immunzellen, die in der Lage, durch dreidimensionale Strukturen dicht ohne Einhaltung spezifische Substrate 17 zu manövrieren sind. Obwohl die geringe räumliche Auflösung (um-Bereich) der beschriebenen Technik ist nich…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft zu SW (DFG WA 2804) und ein Stipendium der Universität zu SW vom Experimental and Clinical Research Center, eine Kooperation des Max-Delbrück-finanzierte Centrum für Molekulare Medizin und Medizinische Fakultät Charité in Berlin. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Erstellung des Manuskripts. Wir danken Herrn Robert Westphal für technischen Support während seines Praktikums in unserem Labor.
Materials
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA |
Riferimenti
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