Purificazione di Trascrizioni e metaboliti<em> Drosophila</em> Teste
Summary
Descriviamo qui le procedure di estrazione e purificazione di mRNA e metaboliti di<em> Drosophila</em> Teste. Stiamo applicando queste tecniche per capire meglio le perturbazioni cellulari alla base degenerazione neuronale. Queste metodologie possono essere facilmente scalato e adattato per altri progetti "omiche".
Abstract
Negli ultimi dieci anni, abbiamo cercato di comprendere i meccanismi molecolari e cellulari di degenerazione neuronale utilizzando Drosophila come organismo modello. Anche se i moscerini della frutta offrono evidenti vantaggi sperimentali, la ricerca sulle malattie neurodegenerative è per lo più basata su tecniche tradizionali, compresa l'interazione genetica, istologia, immunofluorescenza, e biochimica delle proteine. Queste tecniche sono efficaci per meccanicistico, ipotesi-driven studi, che portano ad una comprensione dettagliata del ruolo dei singoli geni a problemi biologici ben definiti. Tuttavia, le malattie neurodegenerative sono estremamente complessi e incidere più organelli cellulari e processi nel tempo. L'avvento delle nuove tecnologie e l'età omiche offre un'opportunità unica per comprendere le perturbazioni globali di cellulari alla base delle malattie complesse. Organismi modello come Drosophila flessibili sono ideali per adattare queste nuove tecnologie a causa della loro forte Annotzione e trattabilità alta. Una sfida con questi piccoli animali, però, è la purificazione di molecole abbastanza informativi (DNA, mRNA, proteine, metaboliti) dai tessuti di grande rilevanza come i cervelli mosca. Altre sfide consistono di raccogliere un gran numero di mosche per le repliche sperimentali (fondamentale per la robustezza statistica) e lo sviluppo di procedure coerenti per la purificazione di materiale di alta qualità biologica. Qui, descriviamo le modalità di riscossione migliaia di teste di mosca e l'estrazione di trascrizioni e metaboliti di capire come i cambiamenti globali di espressione genica e il metabolismo contribuire a malattie neurodegenerative. Queste procedure sono facilmente scalabile e può essere applicata allo studio dei contributi proteomica e epigenomic alla malattia.
Introduction
Nel secolo scorso, Drosophila ha dimostrato di essere uno strumento prezioso laboratorio per studiare profonde questioni biologiche, in particolare nello sviluppo, biologia cellulare, genetica, neurobiologia e 1. Le ragioni di questo successo sono moscerini che sono facili da manipolare, avere una continua espansione degli strumenti 18, 21, 31, e possiedono un genoma relativamente semplice con elevata qualità annotazione 26. Questi vantaggi tecnici, in combinazione con l'ingegno e la costante innovazione all'interno della comunità volo, hanno portato a grandi contributi scientifici, come dimostra l'assegnazione di tre premi Nobel (1933, 1995, 2011). Più di recente, è emerso Drosophila come modello per lo studio di malattie rilevanti umani, disturbi dello sviluppo in primo luogo, l'immunità innata, il cancro, e neurodegenerazione 2. Siamo particolarmente interessati a scoprire le basi cellulari e molecolari delle malattie neurodegenerative. Questi co complessa e diversificatanditions sono collegati a gruppi, oligomeri solubili eventualmente, di proteine anormalmente piegato e sono, quindi, facilmente modellato in mosche. Tutte le principali malattie neurodegenerative, tra cui l'Alzheimer, il Parkinson e la malattia di Huntington, la sclerosi laterale amiotrofica, atassie diverse, taupatie, malattie da prioni, e altri disturbi rari, sono stati modellati in linea negli ultimi quindici anni 23. Laboratori Fly hanno contribuito alla comprensione di queste malattie soprattutto sfruttando l'abilità genetica della Drosophila per identificare nuovi geni implicati nella neurotossicità delle proteine patogene. Una volta nuovi geni rilevanti per la cascata neurotossici sono identificati, i loro effetti sono tipicamente analizzati mediante approcci tradizionali, tra istologia per accertare modelli di degenerazione, immunofluorescenza per determinare la distribuzione delle proteine e patologia cellulare, e le analisi biochimiche per valutare la quantità e il tipo di conformazioni proteiche anormali . Infine, Behavanalisi ioral serve come una lettura funzionale di esiti della malattia. Queste consolidate tecniche sono state sfruttate per esaminare il contributo di uno o un paio di geni candidati per il processo della malattia, tra cui lo stress ossidativo e la disfunzione mitocondriale 13, disregolazione trascrizionale 9, 27, 30, aberrante trasporto assonale e l'attività sinaptica 14, RNA anomalo biologia 9, disregolazione di segnalazione cellulare 29, dyshomeostasis ER 6, ostacolato proteostasis cellulare 33, 23 e molti altri. Tuttavia, non è chiaro come queste proteine tossiche possono interferire contemporaneamente con più percorsi interconnessi, qual è la sequenza temporale di queste alterazioni, e qual è il contributo relativo di ciascun percorso di patogenesi. Decenni di ricerca si è concentrata su singolo gene, ipotesi basate approcci sia gli esseri umani e su modelli animali hanno portato ad un incompleto, quadro sconcertante dei meccanismi cellulari che causanoneurodegenerazione. La comprensione attuale scarsa l'esatto meccanismo attraverso il quale queste assemblee proteine tossiche causano neuropatologia è una limitazione fondamentale per lo sviluppo di terapie modificanti la malattia.
Siamo ora interessati alla applicazione di nuovi approcci per la comprensione di come queste proteine patogene indurre perturbazioni globali cellulari. L'avvento dell'era omiche permette profondo sondaggio di complessi problemi biologici utilizzando sofisticate tecnologie high-throughput, che può portare a terapie efficaci contro queste malattie nel prossimo futuro. Di espressione genica (trascrittomica) studi sono stati istituiti a seguito del completamento delle sequenze del genoma di più in quanto di alta qualità in grado di prevedere la maggior parte delle annotazioni trascrizioni. La recente applicazione di sequenziamento di prossima generazione per l'analisi trascrizione (RNA-seq) ha fornito nuovi vantaggi e opportunità rispetto ai microarray, tra cui un approccio imparziale, migliorata gamma quantitativa, e costi ridotti 32.Vogliamo sfruttare i vantaggi di RNA-seq per capire meglio la forma più comune di atassia ereditaria dominante, atassia spinocerebellare di tipo 3 (SCA3) o di Machado-Joseph malattia. SCA3 è una monogenica, malattia dominante a penetranza completa, causata da una espansione trinucleotide CAG nel gene Ataxin3 (ATXN3) 16. Questa mutazione porta alla produzione di proteine ATXN3 con una lunga polyglutamine (polyQ) traccia che rende incline ad aggregarsi. Poiché mutante ATXN3 è l'agente neurotossico in responsabile di tutte le malattie legate perturbazioni SCA3, questa è una malattia ideale per l'applicazione di questi nuovi approcci omiche. Inoltre, SCA3 era una delle prime malattie neurodegenerative modellati nelle mosche 34.
Mentre mettendo in atto le procedure per la raccolta di un gran numero di teste di mosca per RNA-seq, ci siamo resi conto che avremmo potuto utilizzare lo stesso materiale per l'esecuzione di studi globali di altre molecole informazionali. Tra le altre discip emergentilinee, proteomica, metabolomica epigenomica, e consentire l'esame di patologia cellulare a una profondità non precedentemente raggiunto, anche se non senza difficoltà. Al contrario di mRNA, il catalogo di proteine e metaboliti è abbastanza incompleta in questo momento a causa della maggiore difficoltà nel prevedere tutte le possibili varianti di splicing e l'origine ancora più enigmatico di tutti i metaboliti normali e patogeni. Grandi sforzi sono in corso per catalogare le proteine in molti organismi e in condizioni di malattia. Per questo, abbiamo voluto mettere a fuoco il contributo dei metaboliti alterati per SCA3 patogenesi utilizzando un organismo semplice, come Drosophila. Questo è un campo relativamente nuovo e promettente, in particolare con la recente introduzione di risonanza magnetica nucleare (NMR), che fornisce elevata riproducibilità e non distrugge i campioni 5, 24. Proponiamo che l'analisi metabolita può contribuire a identificare biomarcatori e dei meccanismi implicati nella malattia neurodegeneratisul.
Una considerazione importante con questi progetti omiche è che richiedono grandi campioni uniformi (200 capi fly), nonché le tecniche di purificazione precise per ridurre al minimo variazione sperimentale. Abbiamo iniziato a raccogliere le mosche secondo procedure che avevamo usato in precedenza per microarray e utilizzato anche di recente per RNA-seq 12. Ma ben presto incontrato una serie di problemi legati alla misexpressing SCA3 i costrutti. In primo luogo, abbiamo dovuto selezionare un driver per questi esperimenti Gal4 4, in cui il tessuto bersaglio per l'analisi è stato il cervello. La scelta più ovvia sarebbe un pan-neurale conducente dal SCA3 è una malattia del cervello. Tuttavia, dato che abbiamo intenzione di raccogliere mRNA e metaboliti da teste interi, questa opzione produrrebbe materiale miscelato dai tessuti esprimere e di non esprimere i costrutti. Per generare campioni omogenei in cui tutte le cellule esprimono i costrutti, abbiamo deciso di utilizzare una linea pilota debole ma onnipresente, daughterless (bis)-Gal4. Interesformicolio, molti dei geni implicati in malattie neurodegenerative, tra ATXN3 20, hanno una distribuzione ampia, rendendo la scelta di espressione ubiquitaria appropriata. Poi, abbiamo incontrato un secondo problema: espressione ubiquitaria di patogeni ATXN3-78Q causato mortalità durante lo sviluppo. Per bypassare questo letalità, abbiamo incorporato Gal80 ts per controllare l'attivazione temporale Gal4 19. Questo ci ha permesso di raccogliere le mosche sperimentali, l'età per un periodo sino a 20 giorni, congelarli, ed elaborare le loro teste liofilizzati sia per RNA (TRIzol) o metabolita (metanolo-cloroformio) estrazione (Figura 1). Abbiamo già usato questo protocollo per l'ottenimento di campioni per le analisi trascrittomica e metabolomica, ma ci sono altre applicazioni ovvie per questa tecnica (ad es proteomica o neuro-peptidomic analisi).
Sperimentale Panoramica: L'obiettivo generale di questi protocolli è quello di sostenere la raccolta di consicampioni stent di teste mosca per l'estrazione dei trascritti e metaboliti. L'obiettivo specifico di queste procedure è quello di acquisire le mosche che esprimono ATXN3-27Q e ATXN3-78Q (non patogeni e patogeni costrutti sperimentali), nonché LacZ (controllo costrutto), dove un singolo campione è costituito da 200 capi mosca. Anche se la tecnologia attuale consente l'analisi di campioni molto piccoli, comprese le cellule singole 28, abbiamo riunito 200 capi per eliminare la variabilità sperimentale, biologico, e tecnici, permettendo così di identificare i cambiamenti cellulari associati con il processo di malattia con alta confidenza statistica. Questo approccio è progettato per rilevare solo i cambiamenti nell'espressione genica che sono coerenti nella popolazione, ci dirigono verso le vie più critiche di guida degenerazione. Poiché ci interessa dipendenti dall'età cambiamenti nelle teste di queste mosche, ogni genotipo è stato ottenuto a 1, 10, e 20 giorni di età.
Un aspetto fondamentale di questianalisi globale è la produzione biologica di replica che supportano una analisi statistica robusta. La nostra esperienza precedente con microarrays e RNA-Seq suggerisce che l'analisi di campioni biologici in triplicato fornire un forte significatività statistica dei dati 11, 12. Noi descriviamo nella sezione 1) come generare una replica unico biologico (Rep 1) per ogni punto di genotipo e di tempo. Tali procedure possono essere ripetute per generare Reps 2 e 3, o fatto in parallelo, purché ciascun Rep sia adeguatamente identificato. Sebbene i tre Reps è l'obiettivo, l'impostazione di un quarto (o anche quinto) Rep è altamente raccomandato per trattare questioni relative alla bassa resa, perdita di mosche durante l'invecchiamento, o la perdita accidentale di materiale (mosche, teste, o RNA) in uno o più campioni.
Abbiamo scoperto che dieci croci (bottiglie contrassegnate da lettere AJ) prodotto progenie sufficiente ad ottenere 200 capi / genotipo / tempo punto. Estrema attenzione deve essere applicato per evitare confusione, dal momento che un gran numero di bottiglie are necessario per ottenere una ripetizione (10 bottiglie x 3 x 3 punti genotipi durata = 90 bottiglie). Per questo, abbiamo designato ogni bottiglia con genotipo, punto di tempo, e la lettera di bottiglia. Per esempio, SCA3-27Q 20E riferisce alla quinta bottiglia (di dieci) di mosche esprimono ATXN3-27Q invecchiato per 20 giorni. Una volta che il Eclose progenie, le mosche sono mantenuti in fiale separate etichettati con l'identificatore univoco.
Abbiamo mantenuto il numero di mosche ottenuti per ciascun campione, bottiglia, e il punto di raccolta (mattina e sera) in un foglio di calcolo Excel. Abbiamo rivisto il numero di mosche per fiala prima del congelamento di prendere in considerazione e letalità fuggitivi. Da tali conteggi finali, flaconi aggiungendo 200 mosche possono essere facilmente individuati prima di aprire il congelatore, contribuendo così alla conservazione dei campioni. Dal momento che le mosche raccolti da una bottiglia può essere utilizzato solo in una Rep, abbiamo massimizzato il loro contributo per la replica biologica, anche se tutti i Reps contenute mosche dal più bottiglie. Abbiamo prenotatole mosche da bottiglie non utilizzati per la loro reputazione in programma per rappresentanti di altri, come campioni di ricambio, o per altri esperimenti correlati (Western Blot, qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Costruire sulla nostra esperienza precedente in trascrittomica 11, 12, il metabolismo 15, e le malattie neurodegenerative 6, 8, presentiamo qui un nuovo protocollo per la raccolta di migliaia di teste di mosca con adulti-specifiche espressione di geni patogeni, e mRNA purificazione e metaboliti per RNA- seq e spettroscopia NMR, rispettivamente. La natura di questi esperimenti richiesto l'incorporazione di diverse innovazioni precedenti la raccolta mosca, compresa la selezione di una riga onnipresente Gal4 e l'uso di regolazione temporale dell'espressione genica. Riguardo Gal4, espressione ubiquitaria dei transgeni è cruciale per due motivi. Primo, un grande numero di geni coinvolti in malattie neurodegenerative, tra ATXN3, Huntingtin, precursore della proteina amiloide, e superossido dismutasi 1, tra gli altri, sono largamente espressi in cellule neuronali e gliali nonché in altri tipi cellulari di fuori del sistema nervoso. Volevamocorrettamente modellare questo aspetto della biologia di questi geni patogeni analizzando le conseguenze di espressione ubiquitaria piuttosto che concentrarsi solo su espressione neurale. In secondo luogo, non è possibile raccogliere cervelli mosca in gran numero, ma possiamo farlo con teste di mosca (oltre 200 in triplice copia per ogni condizione) 11, 12. Poiché omogeneizzazione dei capi interi mescola tessuti neurali e non-neurale, l'espressione del transgene onnipresente diventa fondamentale per l'ottenimento di RNA uniformi e metaboliti da popolazioni di cellule che esprimono i transgeni stessi. È importante notare che da-Gal4 è stato scelto per la sua distribuzione abbastanza omogenea non, a causa del suo alto livello di espressione, sebbene un recente rapporto suggerito che da-Gal4 non può essere totalmente onnipresente 25. Avevamo già considerato altri onnipresenti GAL4 linee, tra cui il braccio-, Tub-, e atto-GA4, ma tutti hanno mostrato pattern di espressione complesse del sistema nervoso centrale e dei muscoli degli adulti, che li rende meno unadequate per questo studio. Infatti, l'immunofluorescenza in cervello adulto ha mostrato che da-Gal4 induce l'espressione diffusa ma debole, che solo accumulati ad alti livelli in centri cerebrali composto da poche migliaia assoni e neuroni in un paio di grandi dimensioni (Figura 2). Anche se i livelli di espressione dei costrutti erano basse, queste condizioni drasticamente ridotta sopravvivenza in un polyQ-dipendente. Questa dinamica di espressione soddisfatto le nostre esigenze, mantenendo bassi livelli di espressione, che era importante per osservare i lenti, progressive alterazioni cellulari indotte dalle proteine neurotossiche.
Una conseguenza prevedibile di indurre espressione ubiquitaria di proteine neurotossiche che era causato mortalità prima eclosion adulti. Fortunatamente, questa complicanza è stata esclusa con l'uso di Gal80 ts. Come discusso sopra, l'espressione genica raggiunto livelli massimi di circa 48 ore dopo il cambiamento di temperatura, che si adatta bene con il tempo frami dell'esperimento. Un ulteriore vantaggio derivante dall'utilizzo Gal80 ts è che, a differenza di esperimenti in cui le proteine neurotossiche sono espressi costitutivamente pan-neurale, non c'era espressione durante lo sviluppo del sistema nervoso. Pertanto, l'uso di Gal80 ts creato uno sfondo "pulito", dove il sistema nervoso non è stato esposto alle attività tossiche di queste proteine neurotossiche durante sensibili stadi di sviluppo. A nostro avviso, l'attivazione dell'espressione genica negli adulti ha determinato un modello migliore per questa classe di patologie ad insorgenza nell'età adulta. Tuttavia, Gal80 ts introdotto anche alcune complicazioni associate con i cambiamenti di temperatura. Uno era che vola in crescita a basse temperature (18-20 ° C) ha ritardato il ciclo di vita, facendo gli esperimenti significativamente più lungo. Inoltre, è noto che le mosche crescenti a temperature elevate (29-31 ° C) accelera il loro metabolismo, come illustrato dalla vita più breve rispetto alla linea di età a 25 ° C. Since gli studi trascrizionali e metabolici saranno eseguiti in linea d'età ad alta temperatura, possiamo aspettarci di vedere importanti cambiamenti nei percorsi di stress cellulare e il metabolismo energetico. È per questo che è stato così importante per introdurre due controlli per l'esperimento, quello con il non-patogeno Atnx3-27Q e un controllo indipendente che esprime LacZ. Questi controlli forniranno una base per l'espressione genica e cambiamenti metabolici associati a temperatura elevata in modo da poter identificare tali modifiche direttamente collegate alla espressione di ATXN3 tossici. Nel complesso, abbiamo introdotto diverse modifiche alla raccolta di mosche che offrono numerosi vantaggi – e alcuni svantaggi (problemi di temperatura e del paragrafo successivo) – per lo studio ad insorgenza nell'età adulta, malattie progressive.
Anche se il regolamento temporale con Gal80 ts stata un'aggiunta utile, ma ha anche introdotto una complicazione inaspettata. Mentre la produzione di linea che trasportano sia Gal80 un tsnd Da-GAL4 costrutti in un magazzino stabile, abbiamo notato che vola doppiamente omozigote per entrambi i costrutti erano vitali ma sterili. Dal momento che omozigote Gal80 ts e Da-GAL4 ceppi erano vitali e fertili da soli, non è chiaro perché la combinazione visualizzata bassa fertilità. È noto da tempo che Gal4 è leggermente tossico per Drosophila tessuti 22. È possibile, quindi, che l'espressione eterologa della Gal80 lievito repressore trascrizionale contribuito alla tossicità di Gal4 interferendo, potenzialmente, con il macchinario trascrizionale endogena. Questa tossicità può essere esacerbata dalla distribuzione ubiquitaria del Gal4 sotto il controllo di da, un gene che svolge un ruolo chiave nello sviluppo precoce e determinazione sessuale. Indipendentemente dalle cause della sterilità, abbiamo ampliato la Gal80 ts, da-GAL4 mosche, mantenendo un cromosoma bilanciatore su da-Gal4 mantenendo la homozygosity per Gal80 t s, suggerendo che Gal4 è un contributore più critico per la sterilità. Questa soluzione è stata fondamentale perché abbiamo usato centinaia di questi maschi ogni due settimane per attraversare con ciascuno dei transgeni SUP. Tuttavia, attraversa portando un bilanciatore creato lavoro supplementare durante la selezione della progenie appropriata. Solo un quarto (25%) della progenie è stato raccolto (femmine, non di bilanciamento), che ha aggiunto il tempo di selezione, ha ridotto la resa a bottiglia, e aumentato il numero di bottiglie necessarie per ottenere almeno 200 mosche per genotipo / replicare / tempo punto. Nel complesso, anche se la raccolta di mosche è diventato tempo a causa delle grandi set necessari, siamo sicuri che lo studio di cambiamenti cellulari poche ore dopo aver attivato l'espressione dei geni patogeni ubiquitariamente identificherà processi nuovi e interessanti implicati nella progressiva perdita neuronale.
Una volta che il progetto genetico era a posto, abbiamo prestato particolare attenzione allamanipolazioni sperimentali che potrebbero introdurre variabilità biologica. Prima, abbiamo solo raccolto femmine vergini di garantire l'omogeneità dei campioni, anche se questo significa gettare via maschi e controllando progenie due volte al giorno. Durante l'invecchiamento, non più di 12 mosche erano contenuti nella stessa fiala per evitare il sovraffollamento e lo stress. Inoltre, prima del congelamento, le mosche sono state trasferite a cryovials senza anestesia e hanno permesso di recuperare dalla cessione per 30 min. Questi fattori apparentemente insignificanti possono influenzare l'espressione genica e metabolismo, una variabilità in ultima analisi, che non sarebbe rilevante per l'esperimento.
Per garantire la qualità dei materiali congelati (teste, RNA, e metaboliti), abbiamo posto particolare attenzione per ogni dettaglio che può contribuire alla degradazione dei tessuti. Dal momento che le mosche sono trasferiti cryovials in piccole quantità (fino a 12 mosche per flaconcino), abbiamo dovuto recuperare molte fiale per la raccolta di 200 teste. Queste manipolazioni sono duno con estrema cura in una camera fredda con ghiaccio secco e azoto liquido. La raccolta di mosche, separazione delle teste, e la purificazione di molecole informativo è troppo tempo per scoprire che il materiale è stato degradato alla fine di questo lungo processo. Oltre a garantire che il materiale mantiene la sua qualità, questo protocollo descrive diverse fasi in grado di massimizzare la resa di RNA e metaboliti, tra cui liofilizzazione e battere tallone. Questi passaggi non sono necessari per estrazioni normale per RT-PCR quantitativa o PCR da mosche interi, ma sono fondamentali per la purificazione costante da campioni di piccole dimensioni come teste di mosca. Abbiamo determinato che altri passi influenzano la resa di RNA. Per esempio, i vecchi mosche prodotto RNA significativamente meno giovani mosche, indipendentemente dal genotipo. Questa osservazione suggerisce che l'invecchiamento ad alta temperatura induce cambiamenti drammatici. Inoltre, l'estrazione di RNA da 100 capi era in realtà più efficiente da 200 teste, quindi si è proceduto a purificare in due batches di 100 per esempio, solo per combinarli dopo la verifica della qualità con il bioanalizzatore. Inoltre, colonne per la purificazione di mRNA sembrava saturare facilmente, quindi la quantità di RNA totale per colonna utilizzato deve essere ottimizzato.
Metaboliti sono un mix di molecole piccole, per cui il controllo di qualità è più difficile che con DNA, RNA, o proteine. Purtroppo, non vi è alcun catalogo completo dei metaboliti per qualsiasi modello animale in questo momento, cosa che potrebbe cambiare entro pochi anni, grazie all'applicazione di diverse innovazioni tecnologiche, tra spettroscopia NMR e l'uso esteso di cromatografia liquida – spettrometria di massa ( LC-MS). Anche se l'NMR è meno sensibile di MS, mostra molti vantaggi promettenti, tra cui non la distruzione dei campioni, senza procedure di analisi che presentano bias (LC), e alta riproducibilità che permette di confronto statistico di Reps e diverse condizioni sperimentali 24. Così, il campione può essereriesaminati per verificare osservazioni o ri-analizzati mediante LC-MS per convalidare i dati NMR. Qui, abbiamo dimostrato dati NMR preliminari di mosche che stiamo usando per compilare un catalogo di metaboliti in Drosophila. Queste informazioni saranno fondamentali per determinare come espressione di geni patogeni altera il metabolismo normale, aprire una nuova finestra per promuovere la comprensione dei meccanismi cellulari alla base di malattie neurodegenerative.
Emergenti tecnologie omiche offrono la migliore opportunità di studiare le patologie neurodegenerative ad un livello di dettaglio non precedentemente raggiunto. Forse il più grande ostacolo da superare in questi high-throughput studi è la raccolta fedele di campioni riproducibili che possono essere analizzati con metodi altamente sensibili. Le procedure introdotte qui forniscono un modo per realizzare tale coerenza, e porterà a risultati che possono essere facilmente comparabili tra set di dati. Anche se i nostri principali interessi di ricerca comportato cambiamenti esame del gene espressoioni e metaboliti, le mosche generati possono essere sottoposti anche ad analisi proteomica o epigenomic. Cambiamenti proteomica e epigenomic che si verificano durante la neurodegenerazione sono anche suscettibili di essere di fondamentale importanza per il processo di malattia. Quando la comunità scientifica identifica in ultima analisi, l'intero spettro di cambiamenti molecolari che influenzano il processo della malattia, una vera e propria comprensione a livello di sistema della malattia sarà possibile. A questo livello, le terapie modificanti la malattia finalmente emergere come una realtà.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Janice Santiago, Gabriel Figueroa, e Jose 'Herrera per l'assistenza tecnica e la Bloomington Drosophila Stock Image Center presso l'Università dell'Indiana per gli stock mosca. DH e CW sono stati sostenuti da fondi NSF-IOS-1051890. PF-F e LMM erano sostenute da uno Opportunity Fund Seed presso la University of Florida.
Materials
| Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |
Riferimenti
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
- Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
- Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
- Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507 (2009).
- Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
- Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
- Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetica. 183, 547-561 (2009).
- Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
- Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
- Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
- Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
- Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
- Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
- Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
- Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetica. , 186-735 (2010).
- Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
- Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
- Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
- Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetica. 181, 525-541 (2009).
- Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
- Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
- Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361 (2011).
- Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
- Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
- Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).
