Purificação de Transcrições e metabolitos de<em> Drosophila</em> Cabeças
Summary
Descrevemos a seguir os processos de extracção e purificação de ARNm e metabolitos de<em> Drosophila</em> Cabeças. Estamos aplicando essas técnicas para entender melhor as perturbações celulares subjacentes degeneração neuronal. Estas metodologias podem ser facilmente dimensionados e adaptados para outras "mico" projetos.
Abstract
Durante a última década, temos tentado compreender os mecanismos moleculares e celulares da degeneração neuronal utilizando Drosophila como um organismo modelo. Apesar de moscas da fruta fornecem óbvias vantagens experimentais, a pesquisa sobre doenças neurodegenerativas mais tem se baseou em técnicas tradicionais, incluindo interação genética, histologia, imunofluorescência e bioquímica de proteínas. Estas técnicas são eficazes para mecanicista, a hipótese-driven estudos, que levam a uma compreensão detalhada do papel dos genes individuais em problemas bem definidos biológicos. No entanto, as doenças neurodegenerativas são muito complexas e afecta múltiplos organelos celulares e processos ao longo do tempo. O advento de novas tecnologias e da idade omics oferece uma oportunidade única para entender as perturbações globais celulares subjacentes doenças complexas. Organismos modelo flexíveis, tais como Drosophila são ideais para adaptar essas novas tecnologias por causa de sua forte annotção e docilidade alta. Um desafio com estes pequenos animais, no entanto, é a purificação de um número suficiente de moléculas informativas (DNA, mRNA, proteínas, metabolitos) a partir de tecidos altamente relevantes, tais como o cérebro da mosca. Outros desafios consistem em coletar um grande número de moscas para experimental repetições (crítico de robustez estatística) e desenvolvimento de procedimentos consistentes para a purificação de material de alta qualidade biológica. Aqui, descrevemos os procedimentos para a recolha de milhares de cabeças de mosca e da extração de transcritos e metabólitos para entender como as mudanças globais na expressão gênica e metabolismo contribuir para doenças neurodegenerativas. Estes procedimentos são facilmente escaláveis e podem ser aplicadas ao estudo de contribuições proteômicas e epigenômico a doença.
Introduction
No último século, a Drosophila tem provado ser uma ferramenta de valor inestimável para a investigação laboratorial profundas questões biológicas, principalmente no desenvolvimento, biologia celular, genética, neurobiologia e 1. As razões para este sucesso são que as moscas de fruta são fáceis de manipular, têm uma caixa de ferramentas em constante expansão 18, 21, 31, e possuem um genoma relativamente simples, com elevada qualidade de anotação 26. Essas vantagens técnicas, combinadas com engenho e inovação constante dentro da comunidade mosca, levaram a grandes contribuições científicas, como ilustrado pela atribuição de três prémios Nobel (1933, 1995, 2011). Mais recentemente, a Drosophila tem emergido como um modelo relevante para o estudo de doenças humanas, distúrbios principalmente no desenvolvimento, de imunidade inata, cancro, e neurodegeneração 2. Nós são particularmente interessado em descobrindo a base celular e molecular de doenças neurodegenerativas. Estes co complexo de e diversificadanditions estão ligados a assembléias, possivelmente oligômeros solúveis, de proteínas anormalmente dobradas e são, portanto, facilmente modelados em moscas. Todas as principais doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, de Parkinson e doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, ataxias vários, tauopatias, doenças priónicas, e outras desordens raras, foram modelados em moscas nos últimos quinze anos 23. Laboratórios mosca têm contribuído para a compreensão destas doenças, principalmente explorando a proeza de Drosophila genética para identificar novos genes implicados na neurotoxicidade das proteínas patogênicas. Uma vez que novos genes relevantes para a cascata neurotóxico são identificados, os seus efeitos são tipicamente analisados por métodos tradicionais, incluindo a histologia para averiguar os padrões de degeneração, imunofluorescência para determinar a distribuição de proteínas e patologia celular, e análises bioquímicas para avaliar a quantidade e tipo de conformações de proteínas anormais . Finalmente, comportaanálise comportamental serve como uma leitura funcional da evolução das doenças. Estas técnicas bem estabelecidas têm sido explorados para examinar a contribuição de um ou mais genes candidatos poucos para o processo da doença, incluindo o stress oxidativo e disfunção mitocondrial 13 de desregulação transcricional 9, 27, 30, o transporte axonal aberrante e actividade sináptica 14, anormal RNA biologia 9, dysregulated célula de de sinalização 29, ER dyshomeostasis 6, dificultado proteostasis celular de 33 anos, e muitos outros 23. No entanto, não está claro como essas proteínas tóxicas pode interferir simultaneamente com múltiplas vias interligadas, o que é a seqüência temporal dessas alterações, e qual é a contribuição relativa de cada caminho para a patogênese. Décadas de pesquisa focada em um único gene, a hipótese de abordagens baseadas em humanos e em modelos animais têm levado a uma imagem incompleta, confusa dos mecanismos celulares que causamneurodegeneração. A compreensão actual dos mecanismos imunológicos exactos pelos quais estes conjuntos de proteínas tóxicas causam neuropatologia é uma limitação fundamental para o desenvolvimento de terapias modificadoras da doença.
Nós são agora interessados em a aplicação de novas abordagens para a a compreensão de como estas proteínas patogênicos induzir a globais perturbações celulares. O advento da era omics permite a profunda sondagem de complexos problemas biológicos utilizando sofisticadas tecnologias de alta capacidade, que pode levar a tratamentos de doenças eficazes no futuro próximo. De genes de expressão (transcritômica) estudos foram estabelecido na sequência a conclusão de seqüências do genoma múltiplos desde que de alta-qualidade anotação pode predizer a maioria dos transcrições. A recente aplicação de sequenciamento de última geração para a análise transcrição (RNA-seq) forneceu novas vantagens e oportunidades em comparação com microarrays, incluindo uma abordagem imparcial, melhorou faixa quantitativa, e custo reduzido 32.Queremos explorar as vantagens de RNA-seq para entender melhor a forma mais comum de ataxia de herança dominante, tipo de ataxia espinocerebelar 3 (SCA3) ou de Machado-Joseph doença. SCA3 é uma doença monogênica dominante com penetrância completa, causado por uma expansão CAG trinucleótido no gene Ataxin3 (ATXN3) 16. Esta mutação resulta na produção de Atxn3 proteína com um comprimento de poliglutamina faixa (poliQ) que o torna propenso a agregar. Desde mutante Atxn3 é o agente neurotóxico em SCA3 responsável por todas as perturbações relacionadas com a doença, isto é uma doença ideal para a aplicação dessas novas abordagens mico. Além disso, SCA3 foi uma das primeiras doenças neurodegenerativas modelados em moscas 34.
Enquanto a pôr em prática os procedimentos para a coleta de um grande número de cabeças de voar por RNA-seq, percebemos que poderíamos usar o mesmo material para a realização de estudos globais de outras moléculas de informação. Entre discip de outros países emergenteslinhas, proteômica, Epigenomics, e metabolómica permitir que o exame da patologia celular a uma profundidade não previamente alcançados, embora a não sem desafios. Ao contrário de mRNA, o catálogo de proteínas e metabolitos é bastante incompleta neste momento devido à dificuldade acrescida na previsão de todas as variantes de splicing possíveis ea origem ainda mais enigmático de todos os metabolitos normais e patogénicos. Grandes esforços estão sendo feitos para catalogar proteínas em muitos organismos e em condições de doença. Para isso, queria se concentrar sobre a contribuição dos metabólitos alterados para SCA3 patogênese usando um organismo simples, como a Drosophila. Trata-se de um campo relativamente novo e promissor, particularmente, com a introdução recente de ressonância magnética nuclear (RMN), que proporciona uma elevada reprodutibilidade e não destruir as amostras de 5, 24. Nós propomos que profiling metabólito pode contribuir para a biomarcadores de identificativas e as mecanismos da doença implicados em neurodegeneration.
Uma consideração importante com estes projectos OMIC é que eles exigem amostras grandes e uniformes (200 cabeças mosca), bem como técnicas de purificação para minimizar a variação precisos experimental. Começamos a coletar moscas seguindo procedimentos que tinha usado anteriormente para microarrays e também usado recentemente para RNA-seq 12. Mas nós em breve encontrou um número de problemas relacionados com a misexpressing os SCA3 constructos. Primeiro, tivemos que selecionar um driver Gal4 para estes quatro experimentos, onde o tecido alvo para a análise foi o cérebro. A escolha óbvia seria ser um motorista de pan-neural desde SCA3 é uma doença cérebro. No entanto, uma vez que a intenção de coletar mRNA e metabolitos de cabeças inteiras, esta opção produz material misturado a partir de tecidos expressar e não expressar as construções. Para gerar amostras homogêneas, onde todas as células expressam as construções, decidimos usar uma linha de motorista fraco, mas onipresente, daughterless (da)-Gal4. Interestingly, muitos dos genes implicados em doenças neurodegenerativas, incluindo ATXN3 20, tem uma larga distribuição, tornando a escolha da expressão ubíqua apropriado. Em seguida,, nós encontrou um problema segundo: expressão onipresente de patogênico Atxn3-78Q causado letalidade durante o desenvolvimento. Para ignorar essa letalidade, incorporamos Gal80 ts para controlar a activação temporal de Gal4 19. Isto permitiu-nos a recolher as moscas experimentais, a idade deles por até 20 dias, congelá-los, e processar as suas cabeças liofilizadas para qualquer RNA (TRIzol) ou de extracção (metanol-clorofórmio) metabolito (Figura 1). Nós já utilizaram este protocolo de para obtenção de amostras para análises transcriptomic e metabolômica, mas há são outros aplicações óbvias para esta técnica (por exemplo, proteômica ou neuro-peptidomic análises).
Visão geral experimental: O objetivo geral destes protocolos é o de apoiar a coleta de consiamostras de stent de cabeças de mosca para a extracção de transcrições e metabolitos. A meta específica da estes procedimentos de é o de adquirir moscas de que expressam Atxn3-27Q e Atxn3-78Q (-patogênicas non e patogênico construtos experimentais), bem como de LacZ (controle de de construto), onde uma única amostra consiste em 200 cabeças de de mosca. Embora a tecnologia actual permite a análise de amostras muito pequenas, incluindo as células individuais 28, temos reunidas 200 cabeças para eliminar a variação experimental, biológicas e técnicas, permitindo-nos identificar as alterações celulares associadas com o processo da doença, com confiança estatística elevada. Esta abordagem é projetado para detectar apenas as mudanças na expressão gênica que são consistentes na população, orientando-nos para as vias mais críticas de condução degeneração. Como estamos interessados em idade-dependentes mudanças nas cabeças destes moscas, cada genótipo foi obtido com 1, 10, e 20 dias de idade.
Um aspecto fundamental da estesanálises globais é a produção de réplicas biológicas que o apoio de uma análise estatística robusta. A nossa experiência anterior com microarrays e RNA-seq sugere que a análise de amostras biológicas, em triplicado fornecer significância estatística forte dos dados 11, 12. Nós descrever na seção 1) como gerar apenas uma repetição, biológica (Rep 1) para cada ponto de genótipo e do tempo. Estes procedimentos podem ser repetidos para gerar Reps 2 e 3, ou feitas em paralelo, o tempo que cada Rep está correctamente identificado. Embora três repetições é o objetivo, estabelecendo um representante (ou mesmo quinto) quarto é altamente recomendado para cobrir questões relacionadas com a baixa produtividade, perda de moscas durante o envelhecimento ou perda acidental de material (moscas, cabeças, ou RNA), em uma ou mais amostras.
Descobrimos que 10 cruzes (frascos identificados por letras AJ) produzido descendência suficiente para obter 200 cabeças / genótipo / hora ponto. Extremo cuidado deve ser aplicada a fim de evitar confusão, uma vez que um grande número de garrafas de umre necessários para obter um Rep (10 garrafas x 3 genótipos x 3 pontos tempo = 90 garrafas). Para isso, designado cada garrafa utilizando genótipo, ponto de tempo, e carta de garrafa. Por exemplo, SCA3-27Q 20E refere-se ao frasco de quinta (de 10) das moscas que expressam Atxn3-27Q envelhecida durante 20 dias. Uma vez que o eclose descendência, as moscas são mantidas em frascos separados marcadas com o identificador exclusivo.
Mantivemos os números de moscas obtidos para cada amostra, garrafa, e ponto de coleta (de manhã e à noite) em uma planilha do Excel. Nós revisamos o número de moscas por frasco antes de congelar a ter em letalidade conta e fugitivos. A partir dessas contagens finais, frascos adicionando 200 moscas podem ser facilmente localizados, antes de abrir o congelador, contribuindo assim para a preservação das amostras. Desde moscas coletadas em uma garrafa só pode ser usado em um Rep, que maximizou a sua contribuição de cada repetição biológica, apesar de todos os representantes continha moscas de várias garrafas. Nós reservadosas moscas dos frascos não usados na sua Rep prevista para Reps outros, como amostras de substituição, ou para outras experiências relacionadas (western blot, qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Com base na nossa experiência anterior em transcriptômica 11, 12, 15 metabolismo e doenças neurodegenerativas 6, 8, apresentamos aqui um novo protocolo para a recolha de milhares de cabeças de voar com adulto expressão específica de genes patogênicos, e mRNA purificação e metabólitos para o RNA- seq e espectroscopia de RMN, respectivamente. A natureza destas experiências necessário a incorporação de diversas inovações antes da recolha de mosca, incluindo a selecção de uma linha de Gal4 ubíqua e a utilização de regulação temporal da expressão do gene. Em relação a expressão, Gal4 ubíqua dos transgenes foi crucial por duas razões. Primeiro, um grande número de genes envolvidos em doenças neurodegenerativas, incluindo a ATXN3, Huntingtin, proteína precursora de amilóide, e superóxido dismutase 1, entre outros, são amplamente expressos em células neuronais e gliais, bem como em outros tipos de células fora do sistema nervoso. Queríamoscorretamente modelar este aspecto da biologia destes genes patogénicos, analisando as consequências da expressão ubíqua, em vez de se concentrar somente na expressão neural. Segundo, não é viável para coletar cérebros da mosca em grande número, mas podemos fazê-lo com a cabeça mosca (mais de 200 em triplicado por condição) 11, 12. Uma vez que a homogeneização de misturas de cabeças inteiras tecidos neurais e não neurais, a expressão do transgene ubíqua torna-se crítica para a obtenção de RNA uniformes e metabolitos a partir de populações de células que expressam os transgenes mesmos. É importante notar que, da-Gal4 foi escolhido pela sua distribuição bastante uniforme, não por causa do seu nível de expressão elevado, embora um recente relatório sugeriu que da-Gal4 pode não ser totalmente ubíqua 25. Nós já anteriormente consideradas outras ubíquos, incluindo linhas Gal4-braço, Tub-e Act-GA4, mas todos eles exibiram padrões de expressão de complexos no sistema nervoso central e músculos adultos, tornando-os menos umdequate para este estudo. Na verdade, a imunofluorescência em cérebros adultos mostraram que da-Gal4 induz a expressão disseminada, mas fraca, o que só acumulado em níveis elevados no cérebro centros constituídos por uns poucos milhares de axónios e em alguns neurônios grandes (Figura 2). Embora os níveis de expressão das construções eram baixas, essas condições dramaticamente reduzida a sobrevivência de uma forma dependente da poliQ. Esta dinâmica de expressão cumprido nossas necessidades, mantendo baixos níveis de expressão, o que foi importante para observar as lentas, progressivas alterações celulares induzidas por proteínas neurotóxicas.
A consequência previsível de induzir expressão ubíqua de proteínas neurotóxicas foi que causou letalidade antes de emergência de adultos. Felizmente, esta complicação foi ultrapassado com a utilização de Gal80 ts. Como discutido acima, a expressão do gene atingiram níveis máximos de aproximadamente 48 horas depois da mudança de temperatura, o que se ajusta bem com o tempo frame da experiência. Uma vantagem adicional do uso de Gal80 ts foi que, em contraste com as experiências em que as proteínas neurotóxicas são constitutivamente expressos pan-neuralmente, não houve expressão durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Assim, o uso de Gal80 ts criado um fundo de "limpo", onde o sistema nervoso não foi exposta às actividades tóxicas dessas proteínas neurotóxicas durante sensíveis estágios de desenvolvimento. Em nossa opinião, a ativação da expressão do gene em adultos resultou em um modelo melhor para esta classe de adulto-início patologias. No entanto, Gal80 ts também introduziu algumas complicações associadas às mudanças de temperatura. Uma era que as moscas que crescem a temperaturas baixas (18-20 ° C) após o atraso do ciclo de vida, tornando as experiências significativamente mais longo. Além disso, é sabido que as moscas que crescem a temperaturas elevadas (29-31 ° C) acelera o seu metabolismo, tal como demonstrado pelo tempo de vida reduzido em comparação com as moscas envelhecidos a 25 ° C. Since os estudos de transcrição e metabólica será realizado em moscas com idade a alta temperatura, podemos esperar mudanças importantes em vias de estresse celular e metabolismo energético. É por isso que foi tão importante para a introdução de dois controles para o experimento, um com o não-patogênico Atnx3-27Q e um controle relacionado expressar LacZ. Estes controlos irá proporcionar uma base para a expressão de genes e as alterações metabólicas associadas com a temperatura elevada, de modo que podemos identificar essas alterações directamente relacionadas com a expressão de Atxn3 tóxicos. No geral, nós introduzimos várias modificações para a coleta de moscas que oferecem inúmeras vantagens – e algumas desvantagens (problemas de temperatura e no parágrafo seguinte) – para estudar na idade adulta, doenças progressivas.
Embora o regulamento temporal com Gal80 ts foi uma adição útil, ele também introduziu uma complicação inesperada. Enquanto que a produção das moscas que transportam tanto um ts Gal80ND DA-Gal4 construções em um estoque estável, percebemos que voa duplamente homozigotos para ambos os construtos eram viáveis, mas estéreis. Desde homozigoto Gal80 ts e Da-Gal4 cepas eram viáveis e fértil por si só, não é claro por que a combinação exibida baixa fertilidade. Tem sido conhecido durante algum tempo que Gal4 é ligeiramente tóxico para os tecidos de Drosophila 22. É possível, então, que a expressão heteróloga da levedura Gal80 repressor transcricional contribuiu para a toxicidade de Gal4, interferindo, possivelmente, com a maquinaria transcricional endógeno. Esta toxicidade pode ser exacerbada pela distribuição ubíqua de Gal4 sob o controlo de da, um gene que desempenha um papel fundamental no desenvolvimento precoce e determinação sexual. Independentemente das causas subjacentes da esterilidade, ampliamos o ts Gal80; Gal4 da-moscas, mantendo um cromossomo balanceador mais da-Gal4 mantendo o homozygosity para Gal80 t s, o que sugere que Gal4 é um contribuinte mais crítico para a esterilidade. Esta solução foi a chave porque utilizado centenas destes machos a cada duas semanas para cruzar com cada um dos transgenes UAS. No entanto, cruza carregando um balanceador criado trabalho adicional durante a seleção da progênie apropriado. Apenas um quarto (25%) da progenitura foram recolhidos (fêmeas, balanceador não), o que aumentava o tempo de selecção, reduziu o rendimento por garrafa, e aumentou o número de frascos necessários para a obtenção de pelo menos 200 moscas por genótipo / replicar / hora ponto. Em geral, embora o conjunto de moscas tornou demorado devido às grandes conjuntos necessários, temos certeza de que estudar alterações celulares de apenas algumas horas depois de ligar a expressão de genes patogénicos ubiquamente irá identificar novos processos e interessante implicados na perda neuronal progressiva.
Uma vez que o projeto genético estava no lugar, demos especial atenção aomanipulações experimentais que podem introduzir variabilidade biológica. Em primeiro lugar, nós apenas recolhidos fêmeas virgens para assegurar a homogeneidade das amostras, embora isto significa desperdiçar machos e verificação de descendência duas vezes por dia. Durante o envelhecimento, não mais de 12 moscas foram mantidas no mesmo frasco a fim de evitar aglomeração e stress. Além disso, antes da congelação, as moscas foram transferidas para criotubos sem anestesia e foram deixados a recuperar da transferência durante 30 minutos. Estes factores aparentemente triviais podem influenciar a expressão genética e metabolismo, introduzindo variabilidade na análise final, que não é relevante para a experiência.
Para assegurar a qualidade dos materiais congelados (cabeças, RNA, e metabólitos), demos especial atenção a cada detalhe que possa contribuir para a degradação do tecido. Desde moscas são transferidos para criotubos em pequenas quantidades (até 12 moscas por frasco), tivemos que recuperar muitos frascos para a coleta de 200 cabeças. Estas manipulações foram duma com extremo cuidado em uma sala fria com gelo seco e nitrogênio líquido. A recolha de moscas, a separação das cabeças, e de purificação de moléculas de informação é muito demorado para descobrir que o material foi degradado no final deste processo longo. Para além de assegurar que o material mantém a sua qualidade, este protocolo descreve vários passos que maximizam o rendimento de ARN e metabolitos, incluindo a secagem por congelação e batimento do grânulo. Essas etapas não são de preenchimento obrigatório para extracções de normal para a RT-PCR ou PCR quantitativo a partir de moscas de inteiras, mas eles são crítico para a de purificação de consistente a partir de amostras de pequenos, tais como cabeças de de mosca. Nós determinamos que os outros passos afectar o rendimento de ARN. Para obter de instância, as moscas de mais velhos produzido RNA de forma significativa menos do que moscas de mais jovens, independentemente do genótipo de. Esta observação sugeriu que o envelhecimento a uma temperatura elevada induz mudanças dramáticas. Além disso, a extração de RNA a partir de 100 cabeças foi realmente mais eficiente do que de 200 cabeças, por isso, começou a purificar em dois batches de 100 por amostra de, somente para combiná-las, após verificação da de qualidade com a Bioanalyzer. Além disso, as colunas de purificação de ARNm parecia saturar facilmente, assim que a quantidade de RNA total usado por coluna tem de ser optimizado.
Metabolitos são uma mistura de diversas moléculas pequenas, para o controlo de qualidade é muito mais difícil do que com o ADN, ARN ou proteínas. Infelizmente, não há catálogo completo de metabolitos de qualquer modelo animal, neste momento, o que pode estar a mudar nos próximos anos graças à aplicação de diversas inovações tecnológicas, incluindo espectroscopia de RMN e de uma maior utilização da cromatografia líquida – Espectrometria de Massa ( LC-MS). Embora a RMN é menos sensível do que a MS, mostra muitas vantagens promissoras, incluindo nenhuma destruição de amostras, sem procedimentos analíticos que introduzem polarização (LC), e reprodutibilidade elevada que permite a comparação estatística das Repetições e várias condições experimentais 24. Assim, a amostra pode serretestados para verificar observações ou re-analisados por LC-MS para validar os dados de RMN. Aqui, nós mostrou dados de RMN preliminares de moscas que nós estamos usando para compilar um catálogo de de metabolitos em Drosophila. Esta informação será fundamental para determinar como a expressão de genes patogênicos altera o metabolismo normal, abrindo uma nova janela para aprofundar a compreensão dos mecanismos celulares subjacentes doenças neurodegenerativas.
Emergentes tecnologias OMIC oferecer a melhor oportunidade para estudar doenças neurodegenerativas em um nível de detalhe não alcançado anteriormente. Talvez o maior obstáculo a ser superado nestes estudos de alto rendimento é a coleta de amostras de fiéis reproduzíveis que podem ser analisados por métodos altamente sensíveis. Os procedimentos apresentados aqui fornecem uma maneira de conseguir essa consistência, e vai levar a resultados que podem ser facilmente comparados entre conjuntos de dados. Embora nossos principais interesses envolvidos mudanças exame dos genes expressaion e metabolitos, as moscas gerados podem também ser submetidos a análise proteómica ou epigenômico. Alterações proteômicas e epigenômico que ocorrem durante a neurodegeneração também são susceptíveis de ser de suma importância para o processo da doença. Quando a comunidade científica, em última análise identifica todo o espectro de alterações moleculares que afetam o processo da doença, um entendimento verdadeiro nível sistemas da doença será possível. A este nível, terapias modificadoras da doença, finalmente, emergir como uma realidade.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Janice Santiago, Figueroa Gabriel, e Herrera José para assistência técnica e Bloomington Drosophila Banco Central da Universidade de Indiana para as ações da mosca. DH e CW foram apoiados por fundos do NSF-IOS-1051890. PF-F e LMM foram apoiados por um fundo de Sementes Opportunity, da Universidade da Flórida.
Materials
| Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |
Riferimenti
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