転写産物および代謝物からの精製<em>ショウジョウバエ</em>ヘッド

1。複製を生成し、ハエをフリーズ（注意、液体窒素） 目的：遺伝子型/時間ポイントして、急速冷凍されるごとに、少なくとも200人の女性を集めて下さい。 遺伝子型：Gal80 TS; daughterless調節領域および温度感受性Gal80の制御下にあるGAL4のユビキタスな発現のためにDA-GAL4、株。制御ラインとして、我々は以前に有害な影響を誘発しないことが示されているUAS-LacZを使用していました。 UAS-Atxn3-27QとUAS-Atxn3-78Q、非病原性と病原性の実験的な構造物であった。 （Y、HS-HID建設は処女雌のより効率的な収集のために前に使用されますが、我々は、理由Gal80 TSとY、HS-HIDを導入するために必要な余分の時間がそれに対して決定されている; DA-Gal4の染色体上のIIとⅢ。） 瓶に女性10名と男性5名を組み合わせることにより、全株式を展開混雑防ぐためだ。全ての実験は、準備が簡単で、ダニと速いショウジョウバエの成長と低蔓延を助長ジャズミックスフライメディアで行った。 各時点のDA-GAL4男性、100 UAS-Atxn3-78Q処女（唯一の1 UASのラインが例として使用されます）; 50 Gal80 tsを収集します。 遺伝子型/時間ポイントあたり10十字架を作る。二酸化炭素（CO 2）寝台/パッドの上に雄と雌を麻酔。場所は10処女UAS-Atxn3-78Qハエ（5日よりも古くない）と5人の男性Gal80 TS; DA-Gal4の各大型ボトルには、酵母ペースト（再水和乾燥酵母）でスパイク。遺伝子型は、時点、ボトル識別子（文字AJ）とボトルのラベルを付けて、25℃でそれらを配置する 2日後、ボトルから大人を消去乾燥酵母のふりかけと最適な幼虫の成長を促進するための水の噴出を追加し、18℃（Gal80、アクティブにボトルを置く抑圧されたGal4）。これが処女雌対受精卵に由来する子孫の実験的変動性を導入するかもしれないとして、十字架をコピーしないでください。また、各ボトルから子孫が独立した生物を表す（各ボトルがユニーク子孫を生成）を複製しますが、転送された十字架（のコピー）が技術的になります（同じ遺伝子構成を持つ追加の子孫）を複製します。 子孫は18℃でeclosesと、CO 2寝台/パッドの上に麻酔は、目的遺伝子の処女を収集し、（バイアル当たり二から一二ハエ）と小さなバイアルの中に置いてください。ボトルの識別子を使用してラベルのバイアル。プールは異なるボトルの便を運行する航空会社はありません。 24時間18℃に戻ってバイアルを置きます。子孫を最大化するために、連続した朝と夕方に集め続ける。 各バイアルは、18℃で24時間を完了すると、29℃（Gal80非アクティブ、GAL4アクティブ）にそれらを移す。これは、0日目に、実験の出発点は、tである彼はそれらの発現を開始する導入遺伝子。 彼らは日10と20に到達するまで2日ごとバイアルをきれいにするハエを転送します。 ハエが希望する年齢（1、10、20日）に到達すると、小さな漏斗を用いて予め標識クライオバイアルに食品バイアルからそれらをカウントし、転送します。ハエを麻酔しないでください。ベンチでバイ​​アルを反転します。 ハエが転送（ストレス）から回復できるように、30分待ってから、中に液体窒素や店舗内に浸漬することによりバイアルをフラッシュフリーズ予め標識、予冷フリーザーボックスのことを忘れないでください 。同じ順序でハエをフリーズそれらはサンプル間クライオバイアル制服に費やされる時間を作って、クライオバイアルに移した。 2。フライヘッズの収集と凍結（コールドルーム、プレチルすべての機器、注意、液体窒素やドライアイスで実施） 目的：高速分離、回収、組織の凍結乾燥。 ASSEMふるい（遺体を収集するために、上部チャンバー内の最大メッシュ、ヘッド、超小型部品を収集するために底部の蓋収集する下部チャンバーで二番目に大きい）-80およびプレ寒さを℃で少なくとも30分間CをBLE。 同じボトル由来ハエの貢献を最大化することにより、クライオバイアルから200ハエを集める。朝や夕方に収集するハエの違いを補正するために、すべてのサンプルが同一朝/夕の比率を（我々は47％の朝/ 53パーセント夕方使用）を使用していることを確認注：2つの100頭のサンプルから得られたRNAを組み合わせることができます後一回で200ハエと同等のものを生成します。 5分間ドライアイス上にパラフィルム（〜9×14 cm）の部分を冷やします。 パラフィルム、一度に少数の上に完全なハエを持つ空のクライオバイアル、カウントは100ハエに達するまで絵筆、ドライアイス上で別のクライオバイアル内のストアを使用して飛ぶ。 液体窒素でふるいを浸し、上位CHAMBに100ハエを追加えー。 1分間激しくふるいを振る。再び液体窒素に浸し、1分間振とうする。 -80℃でふるい、マイクロチューブの下側チャンバーから頭を収集し、場所を開き℃にマイクロチューブを開き、パラフィルムでトップをラップし、小さな穴を作る。 2日以上のための凍結乾燥機でサンプルを置きます。 3。トータルRNA抽出とmRNA精製（RNaseZapとすべての面扱い、頻繁に変更されるの手袋） 目的：収量を最大にするために、組織をホモジナイズし、全RNAを抽出し、mRNAを精製。 凍結乾燥機からサンプルを取り出して、各マイクロチューブに3小、滅菌、スチール研削ボールを追加します。ジェノ/グラインダーに入れ、1分間1500ストローク/分で動作します。 、チューブを開き、1mlのTrizolを追加し、パラフィルムでチューブをシールします。 1分を挽く、必要に応じて鋼球を取り除くために、逆さまチューブをタップします。 1分を挽く。 しないでくださいこの時点でチューブを遠心（チューブが脆くなります。）新しいRNaseフリーのマイクロチューブに混合物（鋼球を除く）に転送します。ペレット4で卓上遠心で細胞破片°12,000 x gで10分間インキュベートする。 新しいマイクロチューブに上清を移してください。 1 – ブロモ-3 – クロロプロパン（BCP）の0.1ボリュームを追加し、15秒間激しく振り。 3分間室温でインキュベートする。 4℃で遠心機でスピン°12,000×gでノートで15分間、C：多くのRNA抽出プロトコルは、この段階でクロロホルムを使用し、BCPは相分離の効率を高めることによって、RNA収量を最大にするために意図されている。遠心分離工程の間に4℃でサンプルを保存しておくことはまた、相分離の効率を高め、水相にタンパク質とゲノムDNAの混入を低減します。 新しいマイクロチューブに上部の水層を転送します。氷冷イソプロパノール0.5容量を追加することにより、RNAを沈殿させ、マイル〜6倍の反転xである。室温で10分間インキュベートする。 4℃で遠心機でスピン℃で10分間、12,000×で グラム。 注：RNAを回収することに加えて、タンパク質はまた、トリゾールの有機層と中間相から抽出することができるので、両方のプロテオミクス、トランスクリプトーム解析は、同じサンプルに対して実施することができます。我々は我々の分析では、この手順を実行しませんでしたが、トリゾール抽出は、可溶性タンパク質の優れた表現と、ほとんどのバッファ/洗剤抽出より膜および核蛋白質の高い表現をもたらします。リーとLo 17は 2-DゲルおよびLC-MS/MS含むプロテオミクス解析に適しトリゾール用いてタンパク質を抽出する手順を説明します。 上清を取り除きます。 1mlの氷冷70％エタノール（DEPC処理水を使用）、ショート渦とのミックスを追加することにより、RNAを洗浄します。 4℃で遠心機でスピン℃で12,000×gで5分間。 上清を取り除きます。空気乾燥のためのペレットトン以上15分。 RNAペレットへのDEPC水80μlを加え、10分間55℃に置きます。 4℃で一晩にしておきます。 光度計、分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。 260 nm/280 nmの吸光度の比は、2.1が最適であることと、1.8と2.1の間でなければなりません。 30μgのバルクRNAを取り、100μlに合計ボリュームを上げ4 UのDNase I、60 U RNasin、10μlの10×反応バッファー、及びDEPC処理水を追加します。 20分間37℃でインキュベートする。 RNeasy Mini Kitを用いてRNAを精製する。 30秒間すべての遠心分離を行い、すべての "任意"の手順を含める場合を除き、製造者の指示に従ってください。 光度計を用いてRNA濃度を測定し、バイオアナライザで "トータルRNAピコ"アッセイを用いて、RNAの品質を評価する。 mRNAの精製のために、RNaseフリーのマイクロチューブに30μlのDynabeadsを転送します。 1〜2分間磁石にチューブを置き、上清を除去します。にビーズを再懸濁しBinding Bufferを15μlの。繰り返します。 トータルRNA5μgのを皮切りに、DEPC処理水を用いて15μlに音量を調整します。 65℃の熱で2分間、氷の上での場所のためのC。 15μlのプレ洗浄したビーズにトータルRNAを15μlを追加します。ビーズにRNAをアニールするように30分間、5分毎にピペッティングして混和します。 1〜2分間磁石の上に置き、上清をすべて削除します。 注意深くピペッティングによる洗浄バッファーBミックス35μlを添加する。磁石の上に置き、慎重に上清を除去する。二回洗浄を繰り返します。 2分間80℃に15μlの冷10mMトリス-HCl（pH7.5）及び加熱を加えることによりmRNAを溶出します。直ちに-80℃で、磁石上にチューブを置くRNaseフリーのチューブに上清を移し、凍結）3.8のように定量化する。収率は、トータルRNAの〜1-5％であるべきである。 メタボローム解析のために、プロトコル1と2）を実行し、下）4に進んでください： 4。メタノール – クロロホルムエクストラ代謝物のction 目的：個別極性及び非極性代謝物。 抽出中に脂質の自動酸化を防止するために0.1 mg / mlの濃度でクロロホルムにヒドロキシトルエン（BHT）をブチル化防止剤を追加します。後続のすべてのステップについては、このBHT-クロロホルムを使用しています。 チルド、予め秤量した円錐形のスクリューキャップポリプロピレンチューブへの転送200頭、-80℃で凍結℃、凍結乾燥。乾燥重量を決定します。 チューブで5月7日のジルコニアビーズを入れて、800 Hzで20秒ずつの2つのサイクルのビードビーターでホモジナイズする。 重い試料の乾燥重量に基づいて、以下の比率で水、メタノール、クロロホルムを追加：11.74 Xメタノール; 10.59 X水; xはグラムで最も重い試料の重量であり、製品である11.74 Xクロロホルム、 mlのボリューム。凍結乾燥されたヘッドを含むビーズビーターチューブにすべて計算されたメタノールと水の総量の45％を追加します。 Homogeni20秒ずつ2回以上のサイクルのためにビードビーターでzeを。 クロロホルム（100％）と氷の上で円錐形のガラスバイアル中の水の残りの部分（55％）のボリュームを兼ね備​​えています。その後、ガラスバイアルに（ビーズ付き）組織混合物を転送します。 10分間振とうする。氷上で10分間インキュベートする。 4℃で遠心機でスピン°Cを2,000×gで5分間。パスツールピペット（プラスチックを避ける）と第二マイクロ遠心チューブ内の場所と極性（上部）相を除去。 -80小さなガラスバイアルと凍結で非極性（下）位相℃に保存窒素ガス気流下で乾燥し、窒素タンクから実行されているチューブは抽出物中の可塑剤を避けるために、高純度のタイゴンであることを確認してください。 620μlの重水素化クロロホルムを持つ非極性相を再水和する。ラベル付きのNMRチューブに600μlを移す。防爆-80℃の冷凍庫で保管してください。 Centrivapで極性相を置き、チューブを30℃で完全に乾くまで実行℃（約7時間）。 REH[ – （トリメチルシリル）プロピオン酸-2,2,3,3-D4酸3]内部標準として1mMのTMSPと重水で620μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.3）で極性相をydrate。 30秒間ボルテックスする。 4℃で遠心機でスピン℃をNMRスペクトルを妨げる沈殿顔料および他の大きな分子〜10,000 rpmで5分間。ラベル付きのNMRチューブに上清の600μlを移す。