Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em> Drosophila</em> Köpfe
Summary
Wir beschreiben hier die Verfahren für die Extraktion und Reinigung von mRNA und Metaboliten aus<em> Drosophila</em> Köpfe. Wir wenden diese Techniken zum besseren Verständnis der zellulären Störungen zugrunde liegenden neuronalen Degeneration. Diese Methoden können einfach skaliert und angepasst werden für andere "OMIC" Projekte.
Abstract
Für den letzten zehn Jahren haben wir versucht, die molekularen und zellulären Mechanismen der neuronalen Degeneration mit Drosophila als Modellorganismus zu verstehen. Obwohl Fruchtfliegen offensichtliche experimentelle Vorteile bieten, hat die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen meist auf traditionellen Techniken, darunter genetische Interaktion, Histologie, Immunfluoreszenz und Proteinbiochemie verlassen. Diese Techniken sind effektiv für mechanistische Hypothese angetriebene Studien, die zu einem detaillierten Verständnis der Rolle einzelner Gene in genau definierten biologischen Problemen führen. Allerdings sind neurodegenerative Erkrankungen sehr komplex und betreffen mehrere Zellorganellen und Prozesse über die Zeit. Das Aufkommen der neuen Technologien und der omics Alter bietet eine einzigartige Gelegenheit, um die globalen zellulären Störungen zugrunde liegen komplexe Krankheiten zu verstehen. Flexible Modellorganismen wie Drosophila sind ideal für die Anpassung dieser neuen Technologien aufgrund ihrer starken annotation und hohe Lenkbarkeit. Eine Herausforderung mit diesen kleinen Tieren, obwohl, ist die Reinigung von genügend Informations-Moleküle (DNA, mRNA, Protein, Metaboliten) von hoher Relevanz Geweben wie fly Gehirne. Andere Herausforderungen umfassen Sammeln einer großen Anzahl von Fliegen für experimentelle repliziert (kritisch für statistische Robustheit) und Entwickeln schlüssige Verfahren zur Reinigung von hochwertigen biologischen Materials. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Erfassung Tausende von fly Köpfe und der Gewinnung von Transkripte und Metaboliten zu verstehen, wie die globalen Veränderungen in der Genexpression und Stoffwechsel zu neurodegenerativen Erkrankungen beitragen. Diese Verfahren sind leicht skalierbar und kann zum Studium der Proteom-und epigenomischen Beiträge zu Krankheiten angewendet werden.
Introduction
Im letzten Jahrhundert hat sich Drosophila bewiesen, ein unschätzbares Labor Werkzeug zur Untersuchung tiefe biologische Fragestellungen, vor allem in der Entwicklung, Zellbiologie, Genetik und Neurobiologie 1 sein. Die Gründe für diesen Erfolg sind, dass Fruchtfliegen leicht zu manipulieren, haben einen ständig wachsenden Toolbox 18, 21, 31 sind, und besitzen eine relativ einfache Genom mit hochwertigen Annotation 26. Diese technischen Vorteile, mit Einfallsreichtum und ständige Innovation innerhalb der Fliege Gemeinschaft kombiniert, haben eine breite wissenschaftliche Beiträge führte, wie durch die Vergabe von drei Nobelpreise (1933, 1995, 2011) dargestellt. In jüngerer Zeit hat Drosophila als relevantes Modell für die Untersuchung menschlicher Krankheiten, vor allem Entwicklungsstörungen, angeborene Immunität, Krebs und Neurodegeneration 2 entstanden. Wir sind besonders bei der Aufdeckung der zellulären und molekularen Grundlagen neurodegenerativer Erkrankungen interessiert. Diese komplexe und vielfältige Zusammenarbeitnditions sind auf Baugruppen, ggf. lösliche Oligomere, von abnormal gefaltete Proteine gebunden sind und daher leicht in Fliegen modelliert. Alle großen neurodegenerativen Krankheiten, wie Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, mehrere Ataxien, Tauopathien, Prion-Erkrankungen und anderen seltenen Erkrankungen haben in Fliegen wurden in den letzten fünfzehn Jahre 23 modelliert. Fly Labors haben zum Verständnis dieser Erkrankungen vor allem durch die Nutzung der Fähigkeiten der Drosophila-Genetik, um neue Gene in der Neurotoxizität der pathogenen Proteine beteiligt zu identifizieren beigetragen. Sobald neue Gene, die für die neurotoxischen Kaskade identifiziert werden, sind ihre Auswirkungen in der Regel von den traditionellen Ansätzen, einschließlich Histologie zu ermitteln Muster der Degeneration, Immunfluoreszenz an Protein Verteilung und Zellularpathologie bestimmen und biochemischen Analysen analysiert, um die Menge und Art der abnormen Proteins Konformationen zu beurteilen . Schließlich Verhaltenioral Analyse dient als funktionelle Auslesen der Krankheitsverläufe. Diese gut etablierte Techniken wurden genutzt, um den Beitrag der eine oder wenige Kandidatengene für die Krankheit zu begutachten, darunter oxidativem Stress und mitochondriale Dysfunktion 13, transkriptionelle Dysregulation 9, 27, 30, aberranten axonalen Transport und synaptische Aktivität 14, abnorme RNA Biologie 9, gehinderten dysregulierten Zellsignalisierung 29, ER dyshomeostasis 6, zellulären proteostasis 33, 23 und viele andere. Allerdings ist nicht klar, wie diese toxischen Proteinen kann gleichzeitig mit mehreren miteinander interferieren Bahnen, ist es, was die zeitliche Abfolge dieser Veränderungen, und was der relative Beitrag von jedem Weg zur Pathogenese. Jahrzehntelange Forschung an Gen konzentriert, haben hypothesengeleitete Ansätze in beiden Menschen und Tiermodellen zu einer unvollständigen, rätselhafte Bild der zellulären Mechanismen, die dazu führen, führtenNeurodegeneration. Die aktuelle Armen Kenntnis der genauen Mechanismen, durch die diese toxischen Proteins Baugruppen führen Neuropathologie ist eine wesentliche Einschränkung der Entwicklung krankheitsmodifizierenden Therapien.
Wir sind nun daran interessiert in der Anwendung neuer Ansätze zum Verständnis, wie diese pathogenen Proteine globalen zellulären Störungen induzieren. Das Aufkommen des omics Ära ermöglicht die tiefe Sondierung komplexe biologische Probleme mit ausgefeilten High-Throughput-Technologien, die eine wirksame Krankheitsbehandlung in der nahen Zukunft führen kann. Genexpression (Transkriptomik) Untersuchungen wurden nach Abschluss der mehreren Genomsequenzen da hochwertiger Anmerkung kann meisten Transkripte vorherzusagen etabliert. Die jüngste Anwendung der nächsten Generation Sequenzierung, um transcript-Analyse (RNA-seq) hat neue Vorteile und Chancen gegenüber Microarrays, einschließlich einer unvoreingenommenen Ansatz verbessert die quantitative Reichweite und reduzierten Kosten 32 vorgesehen.Wir wollen die Vorteile der RNA-seq nutzen, um besser zu verstehen, die häufigste Form der dominant vererbten Ataxie, Spinocerebellar Ataxie Typ 3 (SCA3) oder Machado-Joseph-Krankheit. SCA3 ist eine monogen, dominante Erkrankung mit vollständiger Penetranz, durch eine CAG Trinukleotid Expansion im Ataxin3 Gen (ATXN3) 16 verursacht. Diese Mutation führt zu der Produktion von Atxn3 Protein mit einer langen Polyglutamin (polyQ) Strecke, die es anfällig zu aggregieren lässt. Da Mutante Atxn3 ist die neurotoxische Mittels in SCA3 verantwortlich für alle krankheitsbedingten Störungen, ist dies eine ideale Krankheit für die Anwendung dieser neuen OMIC Ansätze. Zusätzlich war SCA3 eines der frühesten neurodegenerativen Erkrankungen in Fliegen 34 modelliert.
Während die Festlegung von Verfahren für die Sammlung einer großen Anzahl von fly Köpfe für RNA-seq, merkten wir, dass wir das gleiche Material für die Durchführung globaler Studien anderer Informations-Moleküle verwenden. Unter anderen Schwellenländern discipLinien, Proteomik, epigenomics und Metabolomik ermöglicht die Untersuchung von zellulären Pathologie in einer Tiefe bisher nicht erreicht, obwohl nicht ohne Herausforderungen. Was mRNA im Gegensatz, ist der Katalog von Proteinen und Metaboliten recht unvollständig in dieser Zeit aufgrund der zunehmenden Schwierigkeiten bei der Vorhersage alle möglichen Spleißvarianten und die noch rätselhaften Ursprung aller normalen und pathogenen Metaboliten. Große Anstrengungen werden derzeit im Gange, um Proteine in vielen Organismen und in Krankheitszuständen zu katalogisieren. Dafür wollten wir über den Beitrag der veränderten Metaboliten SCA3 Pathogenese mit einem einfachen Organismus wie Drosophila konzentrieren. Dies ist ein relativ neues und vielversprechendes Feld, vor allem mit der kürzlichen Einführung der magnetischen Kernresonanz (NMR), die eine hohe Reproduzierbarkeit liefert und zerstört nicht die Proben 5, 24. Wir schlagen vor, dass Metabolite Profiling können zur Identifizierung von Biomarkern und Krankheitsmechanismen in neurodegenerati verwickelt beitragenauf.
Eine wichtige Überlegung in dieser OMIC Projekten ist, dass sie große, gleichmäßige Muster (200 Fliege Köpfe) sowie präzise Reinigungstechniken zu experimentellen Variation minimieren erfordern. Wir fingen an, fliegt nach Verfahren, die wir bisher für Microarrays verwendet hatte und kürzlich auch für RNA-seq 12 verwendet zu sammeln. Aber wir bald auf eine Reihe von Problemen im Zusammenhang mit misexpressing die SCA3 Konstrukte. Zunächst mußten wir ein Gal4-Treiber für diese Versuche 4, wobei das Zielgewebe für die Analyse war das Gehirn auszuwählen. Die offensichtliche Wahl wäre ein pan-neuronalen Fahrer seit SCA3 ist eine Erkrankung des Gehirns. Allerdings, da wir mRNA und Metaboliten aus ganze Köpfe sammeln wollen, würde diese Option gemischtes Material aus Geweben exprimiert und nicht exprimierenden die Konstrukte zu produzieren. Um eine homogene Proben, bei denen alle Zellen exprimieren die Konstrukte zu erzeugen, haben wir beschlossen, eine schwache, aber allgegenwärtigen Fahrerpaarung, daughterless (da)-Gal4 verwenden. Interesprickelnd, haben viele der Gene bei neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich ATXN3 20, verwickelt eine breite Verteilung, so dass die Wahl der ubiquitäre Expression angemessen. Dann stießen wir auf ein zweites Problem: ubiquitäre Expression pathogener Atxn3-78Q verursacht Letalität während der Entwicklung. Um dieses zu umgehen Letalität, wir GAL80 ts eingearbeitet, um die zeitliche Aktivierung des Gal4 19 zu steuern. Dies erlaubte uns, die experimentellen Fliegen, Alter sie für bis zu 20 Tage sammeln, sie einfrieren und verarbeiten ihre lyophilisierte Köpfen entweder für RNA (TRIzol) oder Metaboliten (Methanol-Chloroform) Extraktion (Abbildung 1). Wir haben bereits dieses Protokoll für den Erhalt einer Probe für die Transkriptom-und Metabolom-Analysen verwendet, aber es gibt andere offensichtliche Anwendungen für diese Technik (zB Proteomik oder Neuro-peptidomic Analysen).
Experimentelle Überblick: Das übergeordnete Ziel dieser Protokolle ist es, die Sammlung von consi unterstütztStent Proben fly Köpfe für die Extraktion der Transkripte und Metaboliten. Das konkrete Ziel dieser Verfahren ist es, Fliegen Ausdruck Atxn3-27Q und Atxn3-78Q (nicht-pathogenen und pathogenen experimentellen Konstrukte) sowie LacZ (Kontrolle Konstrukt), wo eine einzelne Stichprobe besteht aus 200 fly Köpfen zu erwerben. Obwohl derzeitige Technologie erlaubt die Analyse von sehr kleinen Proben, einschließlich einzelner Zellen 28, wir 200 Köpfe experimentellen, biologische und technische Variante zu beseitigen gebündelt, so dass wir die zellulären Veränderungen mit der Krankheit Prozess mit hoher statistischer Sicherheit zu identifizieren. Dieser Ansatz ist so konzipiert, dass nur die Veränderungen in der Genexpression, die konsistent sind in der Bevölkerung, uns den Weg zu den wichtigsten Bahnen fahren Degeneration erkennen. Da wir in altersabhängige Änderungen in den Köpfen dieser entfernt Interesse wurde jedes Genotyps an 1, 10 und 20 Tage alt.
Ein wesentlicher Aspekt dieserglobale Analysen ist die Herstellung von biologischen Replikate, dass die Unterstützung einer robusten statistischen Analyse. Unsere bisherigen Erfahrungen mit Microarrays und RNA-seq schlägt vor, dass die Analyse von biologischen Proben in dreifacher bieten starke statistische Signifikanz der Daten 11, 12. Wir beschreiben in Abschnitt 1), wie eine einzelne biologische replicate (Rep 1) für jeden Genotyp und Zeitpunkt zu generieren. Diese Verfahren kann wiederholt werden, um Wiederholungen 2 und 3 zu erzeugen, oder parallel durchgeführt, solange jeder Rep richtig identifiziert. Obwohl drei Reps ist das Ziel, die Einstellung ein Viertel (oder sogar fünfte) Rep wird dringend empfohlen, Fragen im Zusammenhang mit geringer Ausbeute, Verlust von Fliegen während des Alterns, oder versehentlichen Verlust von Material (Fliegen, Köpfe oder RNA) in einem oder mehreren decken Proben.
Wir fanden, dass zehn Kreuze (Flaschen mit Buchstaben AJ identifiziert) genug Nachkommen zu 200 Köpfe / Genotyp / Zeitpunkt zu erhalten produziert. Äußerste Sorgfalt anzuwenden, um Verwechslungen zu vermeiden, da eine große Anzahl von Flaschenerforderlich, um ein Rep (10 Flaschen x 3 Genotypen x 3 Zeitpunkten = 90 Flaschen) erhalten erneut. Dafür haben wir jede Flasche bezeichnet mit Genotyp, Zeitpunkt, und eine Flasche Brief. Zum Beispiel bezieht sich SCA3-27Q 20E der fünften Flasche (zehn) von Fliegen exprimieren Atxn3-27Q für 20 Tage gealtert. Sobald der Nachkommenschaft eclose werden die Fliegen in separaten Fläschchen mit der eindeutigen Kennung markierte aufrechterhalten.
Wir behielten die Zahl der Fliegen für jede Probe, Flasche, und Sammelstelle (morgens und abends) in einer Excel-Tabelle erhalten. Wir überarbeiteten die Anzahl der Fliegen pro Fläschchen vor dem Einfrieren zu berücksichtigen Letalität und Ausbrecher nehmen. Von diesen letzten zählt, kann Vials Zugabe von 200 fliegt einfach vor dem Öffnen der Gefriertruhe liegen und damit einen Beitrag zur Erhaltung der Proben. Da entfernt von einer Flasche gesammelt kann nur in einer Rep verwendet werden, wir deren Beitrag pro Replikat biologischen maximiert, obwohl alle Fliegen aus mehreren Wiederholungen Flaschen enthielten. Wir vorbehaltendie Fliegen aus Flaschen nicht in ihrer geplanten Rep für andere Reps verwendet, als Ersatz Proben oder für ähnliche Experimente (Western-Blot, qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufbauend auf unseren bisherigen Erfahrungen in Transkriptomik 11, 12, Stoffwechsel 15, und neurodegenerative Erkrankungen 6, 8, präsentieren wir hier ein neues Protokoll für das Sammeln von Tausenden von fly Köpfe mit Erwachsenen-spezifische Expression der pathogenen Gene und Reinigung mRNA und Metabolite zur RNA- seq und NMR-Spektroskopie sind. Die Natur dieser Versuche erforderlichen des Einbaus von mehreren Innovationen vor der Fliege Sammlung, einschließlich der Auswahl eines ubiquitären Gal4 Linie und die Verwendung von zeitliche Regulation der Genexpression. Bezüglich Gal4, ubiquitäre Expression der Transgene entscheidend war aus zwei Gründen. Zunächst wird eine Vielzahl von Genen in neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich ATXN3, Huntingtin, Amyloid-Vorläufer-Protein und Superoxiddismutase 1, unter anderem beteiligt, sind weit verbreitet in neuronalen und glialen Zellen sowie in anderen Zelltypen außerhalb des Nervensystems exprimiert. Wir wolltenkorrekt zu modellieren diesen Aspekt der Biologie dieser pathogenen Gene durch die Analyse der Folgen der ubiquitäre Expression, anstatt sich nur auf neuronale Ausdruck. Zweitens ist es nicht möglich, fly Gehirn in großer Zahl sammeln, aber wir können dies mit fly Köpfe (über 200 in dreifacher pro Bedingung) 11, 12. Da Homogenisierung ganze Köpfe mischt neuronalen und nicht-neuronalen Geweben wird allgegenwärtig Transgenexpression kritischen zum Erhalten einheitliche RNA und Metabolite von Populationen von Zellen, die die gleichen Transgenen. Es ist wichtig anzumerken, dass da-Gal4 für seine relativ gleichmäßige Verteilung gewählt wurde, nicht wegen seines hohen Expressionsniveau, obwohl eine kürzlich erschienene vorgeschlagen, dass da-Gal4 eventuell nicht vollkommen ubiquitäre 25. Wir hatten zuvor bereits andere allgegenwärtigen Gal4 Linien, darunter Arm-, Tub-und Act-Ga4 betrachtet, aber sie alle zeigten komplexe Expressionsmuster in den adulten ZNS und Muskeln, so dass sie weniger einungenügender für diese Studie. In der Tat zeigte die Immunfluoreszenz im erwachsenen Gehirn, dass da-Gal4 weit verbreitet, aber schwache Expression, die nur in hohen Konzentrationen im Gehirn Zentren von ein paar tausend Axonen besteht und in einigen großen Neuronen (Abbildung 2) angesammelt induziert. Obwohl die Expression der Konstrukte waren niedrig, diese Bedingungen drastisch verringert Überleben in einer polyQ-abhängigen Weise. Dieser Ausdruck Dynamik erfüllt unsere Bedürfnisse während Expression niedrig, was wichtig war für die Einhaltung der langsame, progressive zellulären Veränderungen durch neurotoxische Proteine induziert.
Eine vorhersehbare Folge der Induktion ubiquitäre Expression von neurotoxischen Proteinen war, dass es Letalität vor Erwachsenen eclosion verursacht. Glücklicherweise war diese Komplikation umgangen mit der Verwendung von GAL80 ts. Wie oben diskutiert, erreicht Genexpression maximalen Niveaus etwa 48 Stunden nach der Temperaturverschiebung, die passt gut zu dem Zeitpunkt frame des Experiments. Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von GAL80 ts war, dass, im Gegensatz zu Experimenten, bei denen die neurotoxischen Proteine konstitutiv exprimiert werden pan-neural, gab es keine Expression während der Entwicklung des Nervensystems. So schufen die Verwendung von GAL80 ts eine "saubere" Hintergrund, wo das Nervensystem nicht auf die toxischen Aktivitäten dieser neurotoxischen Proteinen während der empfindlichen Entwicklungsstadien ausgesetzt war. Aus unserer Sicht führte Aktivierung der Genexpression bei Erwachsenen in ein besseres Modell für diese Klasse von Altersdiabetes Pathologien. Allerdings GAL80 ts führte auch ein paar Komplikationen mit der Temperatur ändert verbunden. Einer war, dass wachsende Fliegen bei niedrigen Temperaturen (18-20 ° C) das Leben Zyklus verzögert, so dass die Experimente deutlich länger. Auch ist es allgemein bekannt, dass der Anbau Fliegen bei hohen Temperaturen (29-31 ° C) ihren Stoffwechsel, wie durch die verkürzte Lebensdauer gegenüber Fliegen bei 25 ° C gealtert dargestellt beschleunigt Since die Transkriptions-und metabolischen Untersuchungen in Fliegen bei hohen Temperaturen im Alter durchgeführt werden, können wir erwarten, dass wichtige Veränderungen in zellulären Stress Wege und Energiestoffwechsel zu sehen. Deshalb ist es so wichtig, zwei Kontrollen mit dem Experiment, ein mit dem nicht-pathogenen Atnx3-27Q und eine unabhängige Kontrolle ausdrücken LacZ einzuführen. Diese Steuerelemente werden eine Grundlinie für die Genexpression und metabolischen Veränderungen mit Hochtemperatur assoziiert ist, so dass wir diese Änderungen direkt auf die Expression von toxischen Atxn3 verbunden identifizieren können. Und ein paar Nachteilen (Temperaturgang Fragen und nächster Absatz) – – für das Studium Altersdiabetes, fortschreitenden Krankheiten Insgesamt haben wir mehrere Änderungen der Sammlung von Fliegen, die zahlreiche Vorteile bieten eingeführt.
Obwohl die zeitliche Regelung mit GAL80 ts war eine hilfreiche Ergänzung, es führte auch eine unerwartete Komplikation. Während die Erzeugung der Fliegen, die sowohl GAL80 ts and da-Gal4 Konstrukte in einem stabilen Lager, bemerkten wir, dass fliegt doppelt homozygot für beide Konstrukte lebensfähig, aber unfruchtbar waren. Da homozygote GAL80 ts und da-Gal4 Stämme waren lebensfähig und fruchtbar für sich, ist es nicht klar, warum die Kombination niedriger Fertilität angezeigt. Es ist seit einiger Zeit, dass Gal4 leicht giftig für Drosophila Geweben 22 ist bekannt. Es ist also möglich, dass die heterologe Expression des Hefe-GAL80 Transkriptionsrepressordomäne der Toxizität von Gal4 Beiträgen interferierenden möglicherweise auch mit dem endogenen Transkriptionsmaschinerie. Diese Toxizität können durch die ubiquitären Verbreitung von Gal4 unter der Kontrolle von da, ein Gen, das eine zentrale Rolle in der frühen Entwicklung und sexuelle Bestimmung verschlimmert werden. Unabhängig von den Ursachen der Sterilität, haben wir das GAL80 ts; da-Gal4 Fliegen durch die Aufrechterhaltung einer Balancer-Chromosom über da-Gal4, während die homozygosity für GAL80 t s, was darauf hindeutet, dass Gal4 eine kritische Faktor für die Sterilität. Diese Lösung war Schlüssel, weil wir Hunderte dieser Männchen verwendet jede zweite Woche, mit jedem der UAS Transgene überqueren. Allerdings kreuzt Tragen einer Ausgleichswelle erstellt Mehraufwand bei der Auswahl des geeigneten Nachkommenschaft. Nur ein Viertel (25%) der Nachkommen wurde gesammelt (Weibchen, nicht-Balancer), die zusätzliche Auswahl Zeit, verringert den Ertrag pro Flasche, und erhöht die Anzahl der Flaschen benötigt mindestens 200 Fliegen pro Genotyp erhalten / replizieren / Zeit Punkt. Insgesamt, obwohl die Sammlung von Fliegen wurde zeitaufwendig aufgrund der großen Mengen benötigt wird, sind wir zuversichtlich, dass das Studium zellulären Veränderungen nur ein paar Stunden nach dem Einschalten der Expression der pathogenen Gene ubiquitär wird neuartige und interessante Prozesse in progressive Verlust von Nervenzellen beteiligt zu identifizieren.
Sobald die genetische Konstruktion war an Ort und Stelle, zahlten wir besonderes Augenmerk auf dieexperimentelle Manipulationen, die biologische Variabilität einführen könnten. Erstens haben wir nur jungfräulichen Weibchen gesammelt, um die Homogenität der Proben zu gewährleisten, obwohl dies bedeutete Wegwerfen Männchen und Prüfen auf Nachkommen zweimal täglich. Während Alterung wurden nicht mehr als 12 Fliegen in der gleichen Flasche gehalten, um Überbelegung und Stress zu vermeiden. Auch vor dem Einfrieren wurden Fliegen zu Kryoröhrchen ohne Betäubung übertragen und durften aus der Übertragung für 30 min erholen. Diese scheinbar triviale Faktoren können Einfluss auf die Genexpression und Stoffwechsel, Einführung Variabilität in der abschließenden Analyse, die nicht relevant wären, um das Experiment.
Um die Qualität der gefrorenen Materialien (Köpfe, RNA und Metaboliten) zu gewährleisten, zahlen wir besonderes Augenmerk auf jedes Detail, das den Abbau von Gewebe beitragen können. Da fliegt zu Kryoröhrchen in kleinen Stückzahlen (bis zu 12 Fliegen pro Fläschchen) übertragen werden, mussten wir viele Fläschchen für die Sammlung von 200 Köpfen abzurufen. Diese Manipulationen sind dein mit äußerster Sorgfalt in einem kalten Raum mit Trockeneis und flüssigem Stickstoff. Die Sammlung von Fliegen, Trennung der Köpfe, und Aufreinigung von informativen Moleküle zu zeitaufwendig ist, um zu entdecken, dass das Material abgebaut am Ende dieses langen Prozess war. Neben der Sicherstellung, dass das Material seine Qualität behält, beschreibt das Protokoll mehrere Schritte, die die Ausbeute an RNA und Metaboliten, einschließlich der Gefriertrocknung und Perlen Prügel zu maximieren. Diese Schritte werden für den normalen Extraktionen für RT-PCR oder quantitative PCR aus ganzen Fliegen erforderlich, aber sie sind ausschlaggebend für konsistente Reinigung aus kleinen Proben wie fly Köpfe. Wir haben festgestellt, dass andere Schritte die Ausbeute an RNA beeinflussen. Zum Beispiel produziert älteren Fliegen deutlich weniger RNA als jüngere Fliegen, unabhängig vom Genotyp. Diese Beobachtung legte nahe, dass die Alterung bei hohen Temperaturen induziert dramatische Veränderungen. Auch Extrahieren von RNA aus 100 Köpfen war tatsächlich effizienter als von 200 Köpfen, so gingen wir in zwei b reinigenatches von 100 pro Sample, nur um sie nach Überprüfung der Qualität mit dem BioAnalyzer kombinieren. Auch schien Spalten für mRNA Reinigung leicht zu sättigen, so dass die Menge an Gesamt-RNA pro Spalte verwendet optimiert werden muss.
Metabolite sind eine heterogene Mischung aus kleinen Molekülen, so Qualitätskontrolle ist schwieriger als mit DNA, RNA oder Proteine. Leider gibt es keine vollständige Katalog von Metaboliten für jeden Tiermodell zu diesem Zeitpunkt, etwas, das in den nächsten Jahren dank werden kann das Ändern der Anwendung von mehreren technologischen Innovationen, darunter NMR-Spektroskopie und der erweiterten Nutzung von Flüssigchromatographie – Massenspektrometrie ( LC-MS). Obwohl die NMR ist weniger empfindlich als MS, es zeigt viel versprechende Vorteile, darunter keine Zerstörung der Proben, keine analytischen Verfahren, die Vorspannung (LC) einzuführen, und eine hohe Reproduzierbarkeit, die statistische Vergleich der Reps und mehreren experimentellen Bedingungen 24 ermöglicht. Somit kann die Stichproberetested zu überprüfen Beobachtungen oder durch LC-MS, NMR Daten zu validieren erneut analysiert. Hier haben wir gezeigt, vorläufige NMR-Daten von Fliegen, die wir verwenden, um einen Katalog von Metaboliten in Drosophila zu kompilieren. Diese Informationen sind entscheidend für die Festlegung, wie Expression der pathogenen Gene normalen Stoffwechsel verändert, ein neues Fenster öffnen, um weiteres Verständnis der zellulären Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen.
Neu entstehende OMIC Technologien bieten die beste Gelegenheit, um neurodegenerative Krankheiten in einem Level of Detail bisher nicht erreichten studieren. Vielleicht das größte Hindernis in diesen High-Throughput-Studien zu überwinden, ist der treue Sammlung von reproduzierbaren Proben, die mit hochempfindlichen Methoden analysiert werden können. Die Verfahren hier vorgestellten bieten eine Möglichkeit, diese Konsistenz zu erreichen, und wird zu Ergebnissen, die leicht über Datensätze verglichen werden führen können. Obwohl unsere primären Forschungsinteressen Untersuchung von Veränderungen der Gen-express beteiligtIons und Stoffwechselprodukte, könnte die Fliegen erzeugt auch proteomischen oder epigenomischen Analyse unterzogen werden. Proteomik und epigenomischen Veränderungen während Neurodegeneration sind wahrscheinlich auch von entscheidender Bedeutung für die Krankheit Prozess sein. Wenn die wissenschaftliche Gemeinschaft letztendlich identifiziert das gesamte Spektrum der molekularen Veränderungen beeinflussen den Krankheitsverlauf, wird eine echte System-Ebene Verständnis der Krankheit möglich sein. Auf dieser Ebene wird krankheitsmodifizierenden Therapien schließlich als Realität entstehen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Janice Santiago, Gabriel Figueroa, und Jose Herrera für die technische Unterstützung und die Bloomington Drosophila Stock Center an der Indiana University for fly Aktien. DH und CW wurden durch Mittel aus NSF-IOS-1051890 unterstützt. PF-F und LMM wurden von einer Chance Seed Fund von der University of Florida unterstützt.
Materials
| Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |
Riferimenti
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