Diyabet Araştırma β-hücre Kütle Dağılımı değerlendirmelerinde Kızılötesi Optik Projeksiyon Tomografi civarında
Summary
Biz optik projeksiyon tomografisi (OPT) adaptasyonu tarif<sup> 1</sup> Yakın kızılötesi spektrum, ve hesaplama araçları bir dizi uygulama içinde görüntüleme için. Bu protokoller, büyük numuneler pankreas β-hücre kitlesi (BCM) değerlendirmelerini sağlayan tekniğin kanallı kapasitesini artırmak ve OPT verilerin kalitesini artırmak.
Abstract
Yakın kızılötesi (NIR) spektrum görüntüleme yeteneğini eklemek için OPT adapte olarak, biz burada böyle sıçan pankreas pankreas dokusu görüntüsü daha büyük cisimlerin imkanı göstermek ve kanal sayısı (hücre tipi) olabilir artırmak için tek bir örnek olarak incelenecektir. ; Yazı için 2 / geliştirilmiş algoritmalar bir örneğinin (bizim durumumuzda pankreas) dönme ekseninde kütle merkezi (COM) (AR) 2 1 / doğru konumlandırma: Biz daha verin hesaplama araçlarını bir dizi uygulama tarif -hizalama tomografik geriçatma 2 ve 3 / OPT tabanlı BCM tespitler 3 gürültü oranları sinyal artırmak için yoğunluğu dengeleme için bir protokol sırasında geometrik bozulmaları önler ayarlama. Ayrıca, görüntü edinimi sırasında numune kasıtsız hareketleri riskini en aza indiren bir numune tutucu açıklar. Birlikte, bu protokolleri BCM dağıtım ve oth değerlendirmelerini sağlamaker özellikleri, Langerhans adacıkları bireyin düzeyine çözünürlüğe sahip, sağlam pancreata veya diğer organlara (adacık nakli çalışmaları gibi) hacmi boyunca aşağı yapılmalıdır.
Introduction
Β-üreten hücrelerin insülin kan şekeri dengesini kontrol etmek için vücudun yeteneğini için anahtardır. Bu nedenle, pankreas BCM dağıtım değerlendirmeler klinik öncesi diyabet araştırma birçok alanda zorunludur. Örneğin terapötik rejimlerin değerlendirmelerde, hastalık için kemirgen modellerinde endokrin hücre farklılaşması veya diyabet etiyolojisi çalışmaları hedeflenen gen ablasyon etkisi sık sık bu tür analizler bağlıdır. Geleneksel olarak, bu tür değerlendirmeler boyut ve pankreas kompleks anatomik anayasasını dolayı yapmak zor olan zaman alıcı stereolojik yaklaşımlar yararlanmıştır. Şu anda en yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlar (genellikle optik), kemirgenler tüm pankreas görüntüleme için yeterli penetrasyon derinliği vermeyin. Tersine, onların penetrasyon derinliği (genellikle nükleer) ile sınırlı değildir görüntüleme yaklaşımları tam BCM dağılımı gidermek için yoksul kararlılık sağlamak ve engellenmektedir4,5 yeterli kontrast maddelerin eksikliği.
Optik projeksiyon tomografi cm çaplı 6 mm biyomedikal numunelerin yüksek çözünürlüklü değerlendirmeler sağlayan bir 3D görüntüleme yöntemidir. Bu vesile ile, mekansal konumu ve Langerhans adacıkları ifade bireyin insülin hacmi hakkında bilgi normal ve diyabetik farelerde 3,7-10 yılında pankreas hacmi boyunca elde edilebilir. Bu çalışmanın amacı, daha pankreatik β-hücrelerinin değerlendirilmesi için bu tekniğin kapasitesini artırmak için; diğer dokular, diğer pankreatik bileşenlerin (örneğin hücre tipleri infiltratif gibi) onların ilişkisi içine ve büyük aşılı kendi endojen dağılımı, önceden mümkün olandan pankreas hazırlıkları.
Yakın kızılötesi optik projeksiyon tomografi (NUR-OPT) kurulumu
Protokoller, yukarı Sharpe tarafından tanımlanan orijinal kümesine dayanan OPT tarayıcının altında ise <earalığında yakın kızılötesi görüntüleme için uyarlanmış m> 1 ve diğerleri, açıklanan ve kullanılmaktadır. Fare pankreas (BCM gibi) tek bir kanal değerlendirilmesi için, SkyScan 3001 (Bioptonics) tarayıcı kullanılabilir.
650nm Yukarıdaki dalga boylarında bir civa ark lambası daha yüksek uyarma enerjisi sağlayan metal halide lamba, eksitasyon ışığı sağlar. Işık sıvı ışık kılavuzu ile aktarılır. Florokromlar ve NIR floresan görüntüleme ve kanal ayırma için bant geçiş filtresi yararlı bir kombinasyon Şekil 3 'de gösterilmiştir. Yayılan ışık NUR spektrumunda yüksek kuantum verimliliği ile, arka aydınlatmalı CCD kamera ile tespit edilir. OPT tarama bir kamerayı kontrol LabView platformu ve step motor kullanılarak otomatik olarak yapılır. Bozulmamış sıçan pancreata, korunmuş bir gümüş kaplı ayna ve bir küvet büyük boyutu olarak örnek desteklemek için kullanılır. Son olarak, bir numune tutucu istenmeyen dikey movemen ortadan kaldırırTarama sırasında numunenin ts tasarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPT görüntüleme için anlatılan teknikleri fare pankreas hacmi boyunca mekansal ve niceliksel parametreler ekstraksiyon sağlar. Mezoskopik görüntüleme, bu tür için ulaşılabilir çözünürlük sınırlamaları nedeniyle belirtmek gerekir ki en görüntüleme yöntemlerinin yanı, daha büyük numune düşük çözünürlük (daha yüksek çözünürlüklü CCD kullanımı OPT tarama çözünürlüğünü artırmak gerekir rağmen) . Dolayısıyla, sağlam pankreas fare lobların değerlendirilmesi için, şu anda teknik olmasına rağmen yakın (yaklaşık 15-20 mikron) 7 Tek hücre çözümü sağlamaz. Yine, fare pankreas BCM dağılımının çıkarılması için protokollerinin tam morfometri 3,13 sayma örneğin noktası elde eşleşen fazla Unutulmamalıdır ki veri sağladıklarını CLAHE protokolün uygulanması önemli ölçüde daha fazla adacıktan tespiti için izin verir ancak bu adacıklar genellikle daha küçük ve katkısı yokte büyük ölçüde tüm β-hücre hacmine.
Katılan immünohistokimyasal protokolleri (en fazla iki hafta) nispeten uzundur, ancak numune hazırlama için zaman gerçek eller kısa ve dolayısıyla tekniği de hayvanların 9 büyük kohort çalışması için uygun olmasıdır. Heterojen dağılımları potansiyel soruşturma için bir odak noktası ise, bakım fiksasyon ilgilendiren ve pankreatik doku olumsuz bir şekilde sabit hale gelir ve düz ("yaymak" olduğunu önlemek için montaj adımları alınması gerektiği vurgulanmalıdır doku) bağlama bu değerlendirmede kolaylaştırmak için çaba olmalıdır.
OPT gerçekleştirerek önemli bir konu da örnek COM dönme ekseni sabit ve tarama işlemi sırasında, yatay veya dikey, hareket etmediğinden olmasıdır. Bu nedenle attachi için istikrarlı mekanik kurulum ve iyi işleyen bir sisteme sahip olmak esastırng örnek. Biz yeni bir bağlama (Şekil 7) oluşturarak bu sorunu çözdü.
Paralel geometri bizim NUR-OPT veya sırt ve kaydedilen projeksiyon görüntüleri periferik nesnelerin önünde pozisyon arasındaki dikey bir kayma olduğu tespit edildi Bioptonics 3001 tarayıcı için doğru değildi. (2.3.1 bakınız) ilgili tarayıcının log dosyasına kaynak mesafe nesnesi ayarlayarak önemli ölçüde bizim veri kalitesini artırmak olabilir ve belirli bir öneme sahiptir projeksiyon görüntüleri en uzak kenarlarında geometrik bozulmaları düzeltmek zaman Daha büyük numuneler değerlendirilmesi.
Geçerli protokol, biz üç farklı belirli kanallar ve sağlam pankreas hazırlıkları değerlendirmelerinde bir "anatomisi" kanal görüntülenmesine izin filtre setleri bir öneri sunmak. Açıkçası bu ayarları floresan tüm formları olduğu gibi, daha iyi olmasına rağmen, belirli bir çalışma için kullanılan florokromlar uygun modüle olabiliryüzde mikroskopi, sinyal sızdırma-yoluyla potansiyel tehlike dikkatle değerlendirilmelidir. 750 nm ve üzeri heyecanlıyız florokromlar ile insülin etiketli adacık çalışma henüz bizim set up kullandığı metal halide lamba kullanarak bize mümkün olmamıştır. Bu alternatif ışık kaynağının (örneğin diyot lazerler) ile birlikte uygun dalga boylarında da yüksek kuantum verimliliği sahip bir kamera daha NIR-OPT potansiyelini artırmak ve daha yüksek dalga boylarında görüntüleme için izin verebilecek mümkündür.
OPT görüntüleme mm-cm ölçekte biyomedikal numune mekansal ve niceliksel olarak değerlendirilmesi için oldukça çok yönlü bir tekniktir. Burada sunulan protokol pankreas / diyabet araştırma amacı için geliştirilmiş olmasına rağmen, diğer türler, örnek tipine ve belirteçleri üzerine araştırma çevirmek mümkün olmalıdır. NUR-OPT görüntüleme f, sağlam pankreas hazırlıkları birkaç farklı kanallar görselleştirmek için potansiyel olarakurther sürece bu kontrast ajanlar da OPT tarafından algılanamaz bir fluorofor taşımak için tasarlanmış olabilir gibi diğer görüntüleme yöntemleri ile non-invaziv değerlendirme amaçlı kontrast maddelerin alımını özgüllüğünü değerlendirmek için bir araç olarak bir potansiyele sahiptir.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr P. Lindström ob / ob farelere sağlamak için kabul edilmektedir. J. Lehtonen düzenleme ile yardım için video prodüksiyon ve J. Gilbert yardım için kabul edilmektedir. (JS ve: Bu çalışma Diyabet Araştırma Enstitüsü Vakfı (AP), Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (AP ve UA), Avrupa Komisyonu (. CP-IP 228933-2 FP-7, hayır Hibe anlaşması) hibe tarafından desteklenen UA), Kempe Vakıflar, Umea Üniversitesi ve UA ile İsveç araştırma konseyi
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
| Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
| Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
| Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |
Riferimenti
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
- Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).
- Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
- Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
- Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753 (2011).
- Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).
